李文文，王丹，董淑君，侯麗靜，張禧慶, ，鄭振佳

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點實驗室，山東泰安 271018；2.龍大食品集團有限公司，山東煙臺 265231；3.山東杰諾檢測服務(wù)有限公司，山東煙臺 265200）

生姜，是我國重要的調(diào)味品，在我國大部分地區(qū)均有種植，年產(chǎn)量約在800 萬噸左右。在姜片和姜脯等的初加工過程中會產(chǎn)生大量姜皮，通常作為廢棄物丟棄，造成資源浪費和環(huán)境污染。生姜多糖具有多種生物活性，例如免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、降血糖活性等。生姜皮富含多糖，從其中提取多糖可實現(xiàn)生姜資源的綜合利用，增加生姜附加值。

鋅是生物體生長發(fā)育所必需的微量元素，參與體內(nèi)多種酶和蛋白質(zhì)的組成，發(fā)揮著重要的生理功能。缺鋅會導(dǎo)致生長發(fā)育遲緩、免疫失調(diào)等一系列疾病。膳食中鋅含量不足，且食物中存在鋅元素吸收抑制劑，因此新型高效、吸收利用率高的補鋅劑具有重要的開發(fā)價值。

多糖具有表面絡(luò)合能力，可與鋅離子結(jié)合得到多糖鋅，有效避免鋅離子在胃腸道中產(chǎn)生沉淀，利于提高鋅離子的生物接受率。同時，多糖鋅兼具鋅與多糖兩者的生物活性，與無機鋅相比，具有高效、穩(wěn)定、副作用小等優(yōu)點。因此，對多糖鋅開展生物合成及生物活性的相關(guān)研究具有重要意義。近年來，多糖鋅的相關(guān)研究主要集中于降血脂、抗氧化等生物活性的評價分析，多糖鋅中鋅離子的生物接受率有待深入研究。生姜皮多糖與鋅離子復(fù)合的研究較少，本研究將生姜皮多糖與硫酸鋅螯合，以螯合率為指標(biāo)明確制備生姜皮多糖鋅的最優(yōu)工藝條件，并通過體外模擬胃腸道消化比較分析硫酸鋅和生姜皮多糖鋅的消化與吸收情況，為新型補鋅劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜皮 羅平縣垠地工貿(mào)有限公司；七水合硫酸鋅 分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；鋅標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1000 μg/mL）國家檢驗認(rèn)證有限公司；人工胃液和腸液 福州飛凈生物科技有限公司；硝酸超純，蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司；鹽酸（優(yōu)級純）、氫氧化鈉（分析純）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；透析袋（500 Da）怡康科貿(mào)生物試劑耗材實驗有限公司。

7800 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 美國安捷倫科技公司；Avanti J-15R 型冷凍高效臺式離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；SECURA224-ICN 型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；S210 型pH 計梅特勒-托利多儀器有限公司；DKZ-2B 水熱恒溫振蕩水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FD-304 冷凍干燥機 濟南駿德儀器有限公司；Multiwave PRO微波消解儀 Anton Paar。

1.2 實驗方法

1.2.1 生姜皮多糖提取 采用熱水浸提法從生姜皮中提取多糖。稱取粉碎后的生姜皮2.5 kg，按料液比1:10（g/mL）進行熱水回流提取2 h，重復(fù)一次，合并濾液，過濾濃縮，醇沉后，5000 r/min 離心10 min，沉淀復(fù)溶后加入1/4 體積的Sevag 溶液（氯仿:正丁醇=4:1）處理至中間層無變性蛋白，將上清液醇沉，凍干得生姜皮多糖粉末。

1.2.2 生姜皮多糖鋅的制備工藝 采用硫酸鋅法制備生姜皮多糖鋅復(fù)合物。將一定濃度的多糖溶液與硫酸鋅溶液等量混合，調(diào)節(jié)溶液pH，置于一定溫度的恒溫震蕩水槽中反應(yīng)一定時間，反應(yīng)完畢后加入4 倍體積的無水乙醇醇沉，5000 r/min 離心10 min，沉淀復(fù)溶后于500 Da 透析袋透析48 h，真空冷凍干燥得生姜皮多糖鋅。

1.2.3 單因素實驗 分別考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)pH、多糖與鋅質(zhì)量比四個因素對螯合率的影響。

1.2.3.1 反應(yīng)溫度對螯合率的影響 取0.4 g/L 的鋅溶液，按多糖與鋅質(zhì)量比為5:1 進行混合，調(diào)整pH為7，分別于30、40、50、60、70 ℃條件下，200 r/min震蕩反應(yīng)100 min，精確移取5 mL 混合液加入20 mL無水乙醇醇沉，離心后取上清液進行鋅含量測定，計算螯合率，考察反應(yīng)溫度對螯合率的影響。

1.2.3.2 反應(yīng)時間對螯合率的影響 取0.4 g/L 的鋅溶液，按多糖與鋅質(zhì)量比為5:1 進行混合，調(diào)整pH為7，于50 ℃、200 r/min 分別振蕩反應(yīng)30、60、90、120、150 min 后，按“1.2.3.1”進行操作，考察反應(yīng)時間對螯合率的影響。

1.2.3.3 反應(yīng)pH 對螯合率的影響 取0.4 g/L 的鋅溶液，按多糖與鋅質(zhì)量比為5:1 進行混合，調(diào)整pH 為6、7、8、9、10，于50 ℃、200 r/min 振蕩反應(yīng)100 min后，按“1.2.3.1”進行操作，考察pH 對螯合率的影響。

1.2.3.4 多糖與鋅質(zhì)量比對螯合率的影響 取0.4 g/L的鋅溶液，分別按多糖與鋅質(zhì)量比為10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 進行混合，調(diào)整pH 為7，于50 ℃、200 r/min 振蕩反應(yīng)100 min 后，按“1.2.3.1”進行操作，考察多糖與鋅質(zhì)量比對螯合率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇多糖與鋅質(zhì)量比、反應(yīng)時間和反應(yīng)pH 這三個因素，以生姜皮多糖鋅的螯合率為響應(yīng)值，采用Design-Express 8.0.6 軟件，以Box-Behnken 設(shè)計響應(yīng)曲面試驗方案，對生姜皮多糖鋅的制備工藝進行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平如表1 所示。

表1 Box-Behnken 試驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and coded levels used in Box-Behnken design

1.2.5 螯合率的計算

1.2.6 鋅含量的測定

1.2.6.1 鋅標(biāo)曲的繪制 利用鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL 的鋅溶液。電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定，以鋅元素的濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，響應(yīng)信號值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.989X+0.0072，R=0.9998。

1.2.6.2 鋅含量的測定 將生姜皮多糖鋅（20 mg）置于50 mL 的試管中，然后加入7.0 mL 的硝酸，室溫下保存過夜。消化后，用5%硝酸稀釋樣品的濃度，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定鋅含量。

1.2.7 體外模擬消化試驗 通過體外模擬消化實驗對生姜皮多糖鋅和硫酸鋅進行生物接受率比較。

體外模擬消化試驗參照文獻[26]方法并稍做修改：取濃度為5 mg/mL 的生姜皮多糖鋅和鋅溶液，用1 mol/L 的HCl 調(diào)節(jié)pH 為2.0，加入等體積模擬胃液混勻，在37 ℃，150 r/min 的恒溫水浴振蕩器中分別反應(yīng)0、30、60、90、120、150、180、210、240 min后，于95 ℃沸水浴滅酶處理10 min，在4 ℃保存?zhèn)溆?。取模擬胃液消化120 min 的生姜皮多糖鋅溶液和硫酸鋅溶液冷卻至室溫，用1 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH 為7.0，加入等體積的模擬腸液混勻，于2000 Da 的透析袋中透析，在37 ℃，150 r/min 的恒溫水浴震蕩器中分別反應(yīng)1、2、4、6、8 h 后，于95 ℃沸水浴滅酶處理10 min，在4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7.1 鋅離子溶解率的測定 分別取胃液消化和腸液消化不同時間的溶液，用4 倍體積的無水乙醇醇沉，5000 r/min 離心10 min 后取上清液，稀釋一定倍數(shù)，測定上清液中的游離鋅離子含量。計算鋅離子的溶解率公式如下：

式中：S 表示上清液中鋅離子濃度，mg/mL；C 表示樣品中鋅離子濃度，mg/mL。

1.2.7.2 透析率的測定 經(jīng)腸液消化后，取透析袋外的溶液，測定溶液中鋅離子含量，用來表示透過模擬腸道的鋅含量。計算鋅離子的透析率公式如下：

式中：A 表示透析液鋅離子濃度，μg/mL；V 表示透析液體積，mL；B 表示樣品中鋅含量，μg/g；M 表示樣品的質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各組實驗均重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Design Expert 8.0.6 和SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Origin 2019 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

如圖1 和表2 所示，生姜皮多糖與硫酸鋅的螯合率隨反應(yīng)溫度的升高出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)反應(yīng)溫度低于60 ℃時，隨著反應(yīng)溫度的升高，螯合率從71.35%緩慢提高到72.59%，當(dāng)反應(yīng)溫度高于60 ℃以后，螯合率緩慢下降。推測是由于高溫引起多糖分子間或分子內(nèi)基團的變化，從而阻礙多糖分子與Zn的配位反應(yīng)，也可能為過高的反應(yīng)溫度會使多糖分子與Zn運動太快而無法相互結(jié)合，解析速度高于結(jié)合速度，因此固定反應(yīng)溫度為60 ℃進行后續(xù)試驗。螯合率隨反應(yīng)時間的增加出現(xiàn)先增高后輕微下降，推測隨著反應(yīng)時間延長，多糖鋅穩(wěn)定性降低，可能會出現(xiàn)解離現(xiàn)象，致使螯合率下降，因此選擇反應(yīng)時間為90～150 min進行后續(xù)試驗。當(dāng)反應(yīng)pH 過低或過高時均會導(dǎo)致螯合率下降，原因推測為在酸性條件下高濃度的H與Zn在結(jié)合多糖中的羥基或羧基時產(chǎn)生競爭作用，阻礙其與多糖結(jié)合；堿性條件下，Zn形成沉淀，從而降低螯合率，當(dāng)pH 為8 時，螯合率達到最大值92.47%。因此，選擇反應(yīng)pH 為7～9 進行后續(xù)試驗。多糖與鋅質(zhì)量比對螯合率的影響呈現(xiàn)出先上升后趨于平緩的趨勢，當(dāng)質(zhì)量比超過25:1 時，溶液粘稠度增大，使得結(jié)合位點暴露減少，阻礙了Zn與多糖結(jié)合，導(dǎo)致螯合率增幅趨于平緩?？紤]多糖與鋅質(zhì)量比過大會導(dǎo)致多糖的浪費，質(zhì)量比過小會導(dǎo)致硫酸鋅的浪費，因此選擇質(zhì)量比為15:1～25:1 進行后續(xù)試驗。

表2 各因素水平及對應(yīng)數(shù)值Table 2 Level of each factors and corresponding values

圖1 各因素對螯合率的影響（n=3）Fig.1 Influence of the various factors on the chelation rate（n=3）

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立與分析 響應(yīng)面試驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。由Design Expert 8.0.6.1 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到三元二次回歸方程為Y=99.10+1.66A?0.58B+0.70C+1.01AB?0.63AC?0.093BC?1.06A?1.15B?2.70C。如表3 所示，對回歸模型進行方差分析，該模型顯著（<0.01），失擬項不顯著（>0.05），決定系數(shù)R為0.9915，校正后決定系數(shù)R為0.9805，說明該回歸方程擬合度和可信度均較高，可利用此模型對生姜皮多糖和硫酸鋅的螯合率進行預(yù)測。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Response surface optimization test design and results

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

從表4 中可以看出，一次項A、B、C，交互項AB、AC 和二次項A、B、C對螯合作用的影響極顯著（<0.01），交互項AB 對螯合作用的影響顯著（<0.05）。BC 項對螯合作用影響不顯著（>0.05），將其從回歸模型中刪除。因此，最終回歸模型為：Y=99.10+1.66A?0.58B+0.70C+1.01AB?0.63AC?1.06A?1.15B?2.70C。

2.2.2 響應(yīng)面圖分析 應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件繪制兩兩因素之間交互影響的響應(yīng)面圖，各因素交互影響效果見圖2。圖2A 中，隨著多糖與鋅質(zhì)量比和反應(yīng)時間水平的增加，螯合率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，且其二維等高線圖偏橢圓型，判斷兩個因素之間交互作用顯著；圖2B 中，隨著多糖與鋅質(zhì)量比和反應(yīng)pH水平的增加，螯合率呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，且其二維等高線圖偏橢圓型，判斷兩個因素之間有一定的交互作用；圖2C 中，隨著反應(yīng)時間和反應(yīng)pH 水平的增加，螯合率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，等高線圖接近圓形，表明交互作用對響應(yīng)值的影響不顯著。由表4 可知，AB、AC、BC 項的值分別為0.0003<0.05、0.0048<0.05、0.5718>0.05，等高線圖與值代表的交互作用對響應(yīng)值影響程度相一致。

圖2 各因素交互作用影響面立體分析圖和等高線圖Fig.2 Stereo analysis diagram and contour diagram of influence surface influenced by interaction of various factors

2.2.3 回歸模型驗證試驗 由回歸模型方程計算可知，當(dāng)A=24.14，B=123.28，C=8.03 時，Y 出現(xiàn)極大值。即當(dāng)多糖與鋅質(zhì)量比為24.14:1，反應(yīng)時間為123.28 min，反應(yīng)pH 為8.03 時，預(yù)測螯合率最大值為99.76%。為方便操作，選擇以下試驗條件進行驗證試驗：多糖與鋅質(zhì)量比為24:1，反應(yīng)時間為125 min，反應(yīng)pH8，所得螯合率為98.53%±0.31%，達到預(yù)測值的98.77%，說明該工藝穩(wěn)定可靠，可用于生產(chǎn)實踐。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗所得的最優(yōu)條件制備生姜皮多糖鋅，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定鋅含量為21.17±0.25 mg/g。

2.3 生姜皮多糖鋅和硫酸鋅的體外消化特性

2.3.1 兩種鋅源在模擬胃液中的消化情況 生姜皮多糖鋅和硫酸鋅在模擬胃液中鋅離子溶解率隨著消化時間的變化情況見圖3。在整個胃消化過程中，硫酸鋅的鋅離子溶解率穩(wěn)定在55%左右。而生姜皮多糖鋅在0～60 min 消化初期，其溶解率處于一個平穩(wěn)的狀態(tài)，維持在8%左右，但在消化的中期和后期，溶解率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。硫酸鋅的鋅離子終溶解率為55.79%高于生姜皮多糖鋅的8.35%。結(jié)果表明，酸性環(huán)境有利于鋅離子的溶解與釋放，硫酸鋅顯示出較好的鋅離子溶解性；與硫酸鋅相比，生姜皮多糖鋅在胃液酸性環(huán)境下釋放較少，推測原因為螯合鋅具有較穩(wěn)定的配位鍵，具有一定的抗胃液消化特性。隨著消化時間的延長，生姜皮多糖鋅在胃液中的鋅離子溶解率下降，推測原因為鋅離子與胃液其它成分進行了結(jié)合。

圖3 鋅溶解率在胃液中隨消化時間的變化（n=3）Fig.3 Variation of solubility of zinc in gastric juice with digestion time (n=3)

2.3.2 兩種鋅源在模擬腸液中的消化與吸收情況生姜皮多糖鋅和硫酸鋅在模擬腸液中鋅離子的溶解率和透析率隨消化時間的變化情況見圖4 和圖5。圖4 顯示生姜皮多糖鋅和硫酸鋅的鋅離子溶解率均隨著消化時間的增加而逐漸減小，8 h 后分別降至1.16%和0.01%。在模擬腸液中硫酸鋅和生姜皮多糖鋅的鋅離子溶解率呈逐漸下降的趨勢，原因為在腸液偏堿性的環(huán)境下，不利于游離鋅離子的存在。圖5 顯示生姜皮多糖鋅的鋅離子透析率可達到14.04%左右，遠(yuǎn)高于硫酸鋅的0.60%。其原因可能是硫酸鋅受腸液環(huán)境的影響易形成不溶性組分，無法透過透析袋，導(dǎo)致鋅離子透析率下降；而生姜皮多糖鋅具有較穩(wěn)定的配位鍵，可在多糖的保護下通過透析袋。多糖鋅在模擬腸液中的鋅溶解率和透析率均高于無機鋅，這一發(fā)現(xiàn)與Wang 等結(jié)論一致。鋅的主要吸收部位為十二指腸，在腸道中鋅的溶解率高有利于被人體吸收，綜上表明生姜皮多糖鋅較硫酸鋅具有更高的穩(wěn)定性和生物接受率，有潛力作為一種新型鋅補充劑。

圖4 鋅溶解率在腸液中隨消化時間的變化（n=3）Fig.4 Changes of zinc solubility in intestinal fluid with digestion time (n=3)

圖5 鋅透析率在腸液中隨消化時間的變化（n=3）Fig.5 Changes of zinc dialysis rate in intestinal fluid with digestion time (n=3)

3 結(jié)論

本研究通過單因素結(jié)合響應(yīng)面試驗確定了生姜皮多糖鋅的最佳工藝條件為反應(yīng)溫度60 ℃，反應(yīng)時間125 min，反應(yīng)pH8，多糖與鋅質(zhì)量比24:1。在此條件下螯合率可達98.53%±0.31%，以此條件制備得到的生姜皮多糖鋅中鋅含量為21.17±0.25 mg/g。體外消化模擬實驗表明硫酸鋅的鋅溶解率受胃液的酸化影響較大，生姜皮多糖鋅結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且受胃液酸化環(huán)境影響較小。在模擬腸液中生姜皮多糖鋅的鋅離子溶解率和和透析率均高于硫酸鋅。與硫酸鋅相比，生姜皮多糖鋅在胃液消化過程中穩(wěn)定性較好，同時有效避免了無機鋅在腸道中吸收較低的問題，提高了鋅的生物接受率，具有作為新型鋅補充劑的開發(fā)潛力。