曾 靜，郭建軍，袁林

（江西省科學(xué)院微生物研究所，江西南昌 330096）

優(yōu)化工業(yè)淀粉制糖工藝的相關(guān)研究對于我國淀粉制糖工業(yè)的發(fā)展具有重要的技術(shù)和經(jīng)濟(jì)意義?，F(xiàn)行工業(yè)淀粉制糖工藝包括液化和糖化兩個步驟。液化步驟和糖化步驟的反應(yīng)溫度、pH 均不同，并且淀粉制糖工藝中使用了多種淀粉水解酶（例如-淀粉酶、-淀粉酶、普魯蘭酶以及葡萄糖淀粉酶等），這些因素導(dǎo)致淀粉制糖工業(yè)的生產(chǎn)成本增加、生產(chǎn)效率降低。因此，如果能夠獲得一種在高溫液化條件下對淀粉原料同時進(jìn)行液化和糖化作用的酶，則可有效降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。

III 型普魯蘭多糖水解酶（EC 3.2.1.1/41）屬于糖苷水解酶類的第13 家族（GH13_20），是一種雙功能淀粉水解酶，同時具有-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性。嗜熱酸性III 型普魯蘭多糖水解酶可在淀粉制糖工業(yè)的液化條件下完全水解淀粉為淀粉糖，有望實現(xiàn)“液化糖化一步法”淀粉酶法制糖工藝。嗜熱酸性III 型普魯蘭多糖水解酶TK-PUL 來源于極端嗜熱古生菌KOD1，具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性和高溫活性，并且其熱穩(wěn)定性和高溫活性均不依賴于Ca，即TK-PUL 的酶學(xué)性質(zhì)完全符合淀粉酶法制糖工業(yè)的需求。因此TK-PUL在淀粉酶法制糖工業(yè)中具有巨大的應(yīng)用潛力。但是TK-PUL 的催化效率尚不能滿足淀粉酶法制糖工業(yè)的需求，難以在淀粉酶法制糖工業(yè)中高效地發(fā)揮水解作用，這限制了TK-PUL 在淀粉酶法制糖工業(yè)中的應(yīng)用。通過蛋白質(zhì)工程對TK-PUL 進(jìn)行提高催化活性的分子改造可以為其在淀粉酶法制糖工業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，對淀粉制糖工業(yè)的升級改造具有重要意義。此外，突變體催化效率強(qiáng)化的分子機(jī)制研究也可為其他淀粉水解酶以應(yīng)用為導(dǎo)向的分子改造提供理論依據(jù)和設(shè)計思路。

易錯聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）就是目前采用最多的一種蛋白質(zhì)體外定向進(jìn)化技術(shù)，在酶分子的催化特性改善方面發(fā)揮重要作用。易錯PCR 技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于提升淀粉水解酶、脂肪酶、漆酶、-葡聚糖酶、糖基海藻糖合酶、纖維素酶等酶活力，并對研究影響酶催化性質(zhì)的關(guān)鍵氨基酸殘基起到了重要指導(dǎo)作用。本研究擬運(yùn)用易錯PCR 技術(shù)對TK-PUL 進(jìn)行體外定向進(jìn)化研究，以期獲得酶活力提高的突變體。進(jìn)一步通過比較突變體與TK-PUL 的酶學(xué)特性和蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，揭示突變體酶活力提高的可能分子機(jī)制。本研究有助于理解TK-PUL 的雙功能催化機(jī)制，也可為其他淀粉水解酶以應(yīng)用為導(dǎo)向的分子改造提供理論依據(jù)和設(shè)計思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

TK-PUL 表達(dá)載體pBE-S-大腸桿菌JM109 均由本實驗室保存；DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、質(zhì)粒DNA 小量純化試劑盒、Secretory Protein Expression System、DNA Ligation Kit Ver.2.1、限制性內(nèi)切酶 日本TaKaRa 公司；StarMut 隨機(jī)突變試劑盒 北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；Ni-NTA 親和層析柱 德國QIAGEN 公司；普魯蘭糖、可溶性淀粉、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、潘糖、異潘糖 上海惠誠生物科技有限公司；Bradford 法蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司；LB 肉湯培養(yǎng)基 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

S1000 PCR 儀（Mastercycler gradient）美國Bio-Rad 公司；全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（Tanon-4100）上海天能科技有限公司；紫外可見分光光度計（760CRT）上海儀電分析儀器有限公司；CMax Plus 酶標(biāo)儀 日本Hitachi 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 易錯PCR 擴(kuò)增 根據(jù)StarMut 隨機(jī)突變試劑盒說明書和TK-PUL 的基因序列，設(shè)計易錯PCR 引物。在引物的末端分別引入限制性內(nèi)切酶I 和I 的酶切位點（如下劃線所示）：上游引物F 為5'-CGCATATGAGCGGATGTATCTCGGAGAGC-3'；下游引物R 為5'-TGTCTAGAACCCCGCTCAAGG ATGATTATC-3'。易錯PCR 反應(yīng)的模板為pBE-S。PCR 反應(yīng)體系為50 μL：模板DNA 1 μL、2×StarMut Random system 25 μL、上游引物F 1 μL、下游引物F 1 μL、StarMut Enhancer 0～20 μL、ddHO補(bǔ)足至50 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，25 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。通過調(diào)整PCR 反應(yīng)體系中StarMut Enhancer 的添加量改變堿基突變率。

1.2.2 突變文庫的構(gòu)建 采用DNA 膠回收試劑盒對易錯PCR 產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。將重組載體pBES-和純化后的易錯PCR 產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶I 和I 雙酶切后進(jìn)行連接，其中酶切反應(yīng)和連接反應(yīng)均參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。將連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物于37 ℃孵育1 h 后涂布于含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB 平板，37 ℃培養(yǎng)16 h，提取所有轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒。采用改進(jìn)的Spizizen 法將所獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化RIK1285 感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)Secretory Protein Expression System 說明書，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含10 μg/mL 卡那霉素的LB 平板上，于37 ℃培養(yǎng)24 h，即獲得突變文庫。

1.2.3 突變文庫的高通量培養(yǎng)和高通量篩選 突變文庫的高通量培養(yǎng)和高通量篩選參照文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行。突變體文庫經(jīng)高通量培養(yǎng)后，各突變體的發(fā)酵液上清用于-淀粉酶活性的高通量檢測。-淀粉酶活性的高通量檢測對應(yīng)的吸光值的大小反應(yīng)突變體的酶活大小，篩選出吸光值最大的突變體用做第2 輪易錯PCR 的模板或進(jìn)行基因測序分析。

1.2.4 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）檢測重組酶的純度，并采用Bradford 法蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒測定重組酶的濃度。

1.2.5 重組酶的酶活力測定 分別以1%（m/V）可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物，參照文獻(xiàn)[13]測定重組酶的-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性。酶活力單位（U）定義：在一定反應(yīng)條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol 還原糖的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.2.6 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)測定 分別以1%可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物，測定重組酶的最適反應(yīng)pH、pH 穩(wěn)定性、最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性。重組酶的酶學(xué)性質(zhì)測定參照文獻(xiàn)[26]進(jìn)行。重組酶的最適反應(yīng)pH 以及pH 穩(wěn)定性的測定范圍為pH3.0～9.0；于40～110 ℃下測定重組酶的最適反應(yīng)溫度，并于100 ℃下測定重組酶的熱穩(wěn)定性。測定重組酶的最適反應(yīng)pH 或最適反應(yīng)溫度時，將所測得的最高酶活定義為100%，其余測得酶活與最高酶活的比值定義為相對酶活。測定重組酶的pH 穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性時，將未處理酶液的酶活定義為100%，處理后酶液的酶活與未處理酶液的酶活的比值定義為剩余酶活。

1.2.7 重組酶的動力學(xué)常數(shù)測定 分別以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物，測定重組酶的動力學(xué)常數(shù)。重組酶的動力學(xué)常數(shù)測定參照文獻(xiàn)[26]進(jìn)行?？扇苄缘矸鄣臐舛忍荻仍O(shè)定為5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、35.0 mg/mL；普魯蘭多糖的濃度梯度設(shè)定為1.6、3.2、6.4、12.8、16.0、20.0 mg/mL。

1.2.8 生物信息學(xué)分析 將篩選獲得的突變體送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行基因測序，并根據(jù)基因的堿基序列生成氨基酸序列，分析堿基及氨基酸的突變情況。以TK-PUL（PDB ID：5OT1）的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)為模板，采用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org）同源模建突變體的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，并采用三維圖像軟件PyMOL v2.5.2 顯示TK-PUL 及突變體的三級結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3 次，試驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用軟件SigmaPlot 14.0 對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 易錯PCR 條件的確立

根據(jù)StarMut 隨機(jī)突變試劑盒說明書，調(diào)整PCR反應(yīng)體系中StarMut Enhancer 的添加量可以改變堿基突變率。因此我們根據(jù)實驗要求，在PCR 反應(yīng)體系中加入不同體積的StarMut Enhancer，進(jìn)行易錯PCR 反應(yīng)，構(gòu)建突變體文庫。從每組突變體文庫中隨機(jī)挑取10 株菌進(jìn)行基因測序以計算突變率，如表1 所示，其中StarMut Enhancer 的添加量為1 μL時的平均突變率為0.26%，接近目前公認(rèn)的合適突變率0.25%，因此本研究易錯PCR 反應(yīng)體系中Star-Mut Enhancer 的添加量為1 μL。

表1 PCR 反應(yīng)體系中StarMut Enhancer 添加量對應(yīng)的PCR 突變率Table 1 PCR mutation rates corresponding to the supplemental level of StarMut Enhancer in the PCR reaction system

2.2 突變體文庫的構(gòu)建與高通量篩選

以重組質(zhì)粒pBE-S-為模板進(jìn)行第1 輪易錯PCR，回收PCR 產(chǎn)物，將其雙酶切處理后連接經(jīng)同樣雙酶切處理的載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞，提取所有轉(zhuǎn)化子所含重組質(zhì)粒。將所獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化RIK1285感受態(tài)細(xì)胞，獲得容量約為2500 株轉(zhuǎn)化子的突變體文庫。利用高通量篩選方法篩選突變體文庫中酶活力提高的轉(zhuǎn)化子，共獲得10 株胞外-淀粉酶活力提高的轉(zhuǎn)化子（數(shù)據(jù)未顯示）。再次采用高通量篩選方法對以上10 株轉(zhuǎn)化子（定義為轉(zhuǎn)化子1～轉(zhuǎn)化子10）以及包含重組質(zhì)粒pBE-S-的轉(zhuǎn)化子（定義為轉(zhuǎn)化子C）進(jìn)行胞外-淀粉酶活力的測定，結(jié)果如表2所示，篩選得到2 株胞外-淀粉酶活力提高幅度最大的轉(zhuǎn)化子（轉(zhuǎn)化子2 和轉(zhuǎn)化子7）。提取這2 株轉(zhuǎn)化子中重組質(zhì)粒，并以這兩種重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行第2 輪易錯PCR，按照同樣的方法獲得容量約為2800 株轉(zhuǎn)化子的突變體文庫。然而對新的突變體文庫進(jìn)行高通量篩選未能獲得酶活力進(jìn)一步提高的突變體。對經(jīng)第1 輪易錯PCR 反應(yīng)獲得的2 個重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示這2 個重組質(zhì)粒包含的突變位點一致，其第1612 位堿基由C 突變?yōu)镚、第1613 位堿基由T 突變?yōu)锳，即基因編碼序列CTC突變?yōu)镚AC，氨基酸序列由Leu538 突變?yōu)锳sp538。即本研究通過易錯PCR 技術(shù)對TK-PUL 進(jìn)行體外定向進(jìn)化，獲得了酶活力提高的突變體L538D。

表2 轉(zhuǎn)化子的高通量篩選結(jié)果Table 2 High throughput screening results of the transformants

2.3 TK-PUL 和突變體L538D 的表達(dá)、純化及比酶活測定

枯草芽孢桿菌作為傳統(tǒng)的工業(yè)生產(chǎn)菌株，具有分泌能力強(qiáng)、培養(yǎng)條件和基因操作簡單、發(fā)酵工藝成熟等優(yōu)點，被認(rèn)為是理想的外源蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)宿主菌。本研究于枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)TKPUL 和突變體L538D，重組酶TK-PUL 和突變體L538D 均得到成功表達(dá)。采用Ni親和層析法對重組酶進(jìn)行純化，并采用SDS-PAGE 檢測各重組酶的純度。如圖1 所示，TK-PUL 和突變體L538D 的表觀分子質(zhì)量分別約為84 kDa，大小均與理論值相符。根據(jù)SDS-PAGE 檢測圖中蛋白質(zhì)條帶的灰度分析結(jié)果，重組酶TK-PUL 和突變體L538D 的純度均達(dá)到95%以上。

圖1 TK-PUL 和突變體L538D 的SDS-PAGE 檢測圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of TK-PUL and the mutant L538D

采用Bradford 法測定TK-PUL 和突變體L538D的蛋白質(zhì)濃度，并測定其分別以可溶性淀粉和普魯蘭多糖為底物的比酶活力，結(jié)果如表3 所示。TKPUL 的-淀粉酶比酶活力為54.08 U/mg，L538D 的-淀粉酶比酶活力為81.14 U/mg。與TK-PUL 相比，L538D 的-淀粉酶比酶活力提高了50%。TKPUL 的普魯蘭酶比酶活力為110.39 U/mg，L538D 的普魯蘭酶比酶活力為133.18 U/mg。與TK-PUL 相比，L538D 的普魯蘭酶比酶活力提高了21%。TKPUL 的-淀粉酶活性與普魯蘭酶活性的比值為0.49，L538D 的-淀粉酶活性與普魯蘭酶活性的比值為0.61。以上結(jié)果表明，與TK-PUL 相比，突變體L538D 的-淀粉酶活性和普魯蘭酶活性均明顯提高，并且其-淀粉酶活性的提高幅度更大。

表3 TK-PUL 及突變體L538D 于100 ℃的比酶活力Table 3 Specific activities of TK-PUL and the mutant L538D at 100 oC

2.4 TK-PUL 和突變體L538D 的酶學(xué)性質(zhì)

本研究測定了pH 和溫度對TK-PUL 及突變體L538D 酶學(xué)性質(zhì)的影響。由圖2（A）可知。以1%可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時，TK-PUL 及突變體L538D 的最適反應(yīng)pH 均約為4.5，并且兩者的相對酶活隨pH 的變化趨勢也基本相同。另外，圖2（B）顯示，在pH 為3.0～9.0 的范圍內(nèi)，TK-PUL 及突變體L538D 的pH 穩(wěn)定性也幾乎一致。這表明TK-PUL中L538D 位點變化不影響其最適反應(yīng)pH 和pH 穩(wěn)定性。

TK-PUL 及突變體L538D 的最適反應(yīng)溫度測定結(jié)果如圖2（C）所示。TK-PUL 及突變體L538D 的最適反應(yīng)溫度均約為100 ℃，在40～110 ℃的范圍內(nèi)兩者的相對酶活隨溫度的變化趨勢也基本相同。同時，由圖2（D）可知，TK-PUL 及突變體L538D 于100 ℃的熱穩(wěn)定性也基本一致，于100 ℃的半衰期均約為2 h。即TK-PUL 中L538D 位點變化也不影響其最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性。

圖2 TK-PUL 和突變體L538D 的酶學(xué)性質(zhì)Fig.2 Enzymatic properties of TK-PUL and the mutant L538D

2.5 TK-PUL 及L538D 的動力學(xué)常數(shù)測定

本研究測定并比較了TK-PUL 及突變體L538D于100 ℃的動力學(xué)常數(shù)，依此來確定TK-PUL 中L538D 位點變化對其底物結(jié)合能力和底物降解能力的影響。由表4 可知，以可溶性淀粉或普魯蘭多糖為底物時，與TK-PUL 相比，突變體L538D 的K值基本不變，k值均明顯提高。其中以可溶性淀粉為底物時，突變體L538D 的k/K值提高了44%；以普魯蘭多糖為底物時，突變體L538D 的k/K值提高了27%。以上結(jié)果表明，TK-PUL 中L538D 位點變化不影響TK-PUL 對底物的結(jié)合能力，并有利于提高其對底物的降解能力，特別有利于提高其對可溶性淀粉的降解能力。

表4 TK-PUL 及突變體L538D 的動力學(xué)常數(shù)Table 4 Kinetic parameters of TK-PUL and the mutant L538D

2.6 突變位點分析與分子結(jié)構(gòu)模擬

以TK-PUL（PDB ID：5OT1）的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)為模板，采用Swiss-Model 同源模建突變體L538D的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)。采用三維圖像軟件PyMOL v2.5.2 顯示TK-PUL 及突變體L538D 的三級結(jié)構(gòu)。由圖3（A1）可知，TK-PUL 具有糖苷水解酶第13 家族酶分子結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制上的共同特征，如三個結(jié)構(gòu)域、四個高度保守的保守基序、保守的催化活性中心（Asp503、Glu534、Asp601）等。蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，單個氨基酸殘基的突變不會明顯改變蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)，所以突變體L538D與TK-PUL 的三級結(jié)構(gòu)基本一致（如圖3 所示）。由圖3（A2）可知，TK-PUL 中Leu538 距離其催化活性中心和底物結(jié)合中心較遠(yuǎn)，無直接相互作用。本研究結(jié)果也表明，TK-PUL 中L538D 位點變化不影響其最適反應(yīng)pH、pH 穩(wěn)定性、最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性。因此蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)對比分析結(jié)果與本研究實驗結(jié)果是相對應(yīng)的。但是已有研究結(jié)果表明，催化活性位點附近的氨基酸殘基的側(cè)鏈大小以及側(cè)鏈性質(zhì)影響酶分子水解糖苷鍵的活性和特異性。Leu538鄰近催化活性位點Glue534，兩者均位于同一loop 結(jié)構(gòu)上。TK-PUL 中L538D 位點變化可能通過縮短氨基酸殘基側(cè)鏈的長度和減弱氨基酸殘基的疏水性，改變催化活性位點Glu534 所在loop 結(jié)構(gòu)的柔性，進(jìn)而提高酶的催化活性。

圖3 TK-PUL 和突變體L538D 的三級結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.3 Three-dimensional modelling of TK-PUL and the mutant L538D

3 結(jié)論

本研究采用易錯PCR 技術(shù)對III 型普魯蘭多糖水解酶TK-PUL 進(jìn)行體外定向進(jìn)化，獲得催化活性提高的突變體L538D。TK-PUL 中Leu538 是影響其催化效率的重要氨基酸殘基。將TK-PUL 中催化活性位點Glu534 鄰近的氨基酸殘基Leu538 替換為側(cè)鏈長度更短并且極性更強(qiáng)的氨基酸殘基Asp538，有利于提高TK-PUL 的催化活性。突變體L538D有望應(yīng)用于“液化糖化一步法”的淀粉制糖工藝，可極大地簡化淀粉酶法制糖工藝和提高生產(chǎn)效率。本研究也可為其他淀粉水解酶以應(yīng)用為導(dǎo)向的分子改造提供理論依據(jù)和設(shè)計思路。