張瑞麟，杜 超，鞠雪瑩，吳玉雯，臧延青

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319)

油茶為山茶屬多年生喬木，普遍種植于浙江、江西、河南等南方高山和丘陵地帶[1-3]，是世界四大可食用油源樹(shù)種之一，也是我國(guó)特有的一種可食用油源樹(shù)種[2,4]。據(jù)報(bào)道油茶籽粕年產(chǎn)量達(dá)39.71萬(wàn)t[5]，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，可廣泛應(yīng)用于化工、輕工、食品、飼料等領(lǐng)域[6]，但仍然存在處理不當(dāng)直接丟棄的現(xiàn)象，造成極大的資源浪費(fèi)與環(huán)境污染問(wèn)題。

多糖是在單糖之間形成糖苷鍵的線性或支鏈的高聚物[7]，為油茶籽粕中的主要成分，占15%～30%[5]。已有研究人員從茶粕多糖中分離純化出木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖胺和甘聚糖，并證明其具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤、抗凝血、減肥和消炎鎮(zhèn)痛等多種生物活性[7]，因此在結(jié)構(gòu)和功能上都具有很高的研究?jī)r(jià)值，已成為近些年的研究熱點(diǎn)。

目前，關(guān)于植物多糖的提取方法有溶劑提取法、超臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和酶解法等[8]。超聲輔助提取時(shí)會(huì)產(chǎn)生高剪切力，加速細(xì)胞壁破碎速度，增加溶劑滲透作用，縮短提取時(shí)間，提高提取率[9]。油茶籽粕是油茶產(chǎn)業(yè)鏈的副產(chǎn)物，產(chǎn)量巨大，且活性成分含量較為豐富，其所含茶粕多糖的生物活性較強(qiáng)，是開(kāi)發(fā)功能性食品的高質(zhì)量資源。為發(fā)揮不同產(chǎn)地油茶籽的自身營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，對(duì)其進(jìn)行品質(zhì)研究和主要活性成分的含量測(cè)定具有重要意義。郭玉華等[2]研究表明油茶籽粕多糖的結(jié)構(gòu)為甘露糖和葡萄糖，徐迪等[5]對(duì)油茶籽粕多糖提取工藝優(yōu)化。但對(duì)不同地區(qū)和不同品種油茶籽粕多糖提取率與抗氧化活性的比較研究鮮有報(bào)道。為充分了解不同產(chǎn)地、不同品種的油茶籽的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，本研究選取產(chǎn)自江蘇省宿遷市的長(zhǎng)林系列油茶籽、福建省建寧縣的紅花油茶籽和浙江省衢州市的普通白花油茶籽為原料，優(yōu)化油茶籽粕多糖的提取工藝，并評(píng)價(jià)其抗氧化活性。以期進(jìn)一步提高油茶籽利用率和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，研發(fā)相關(guān)功能性食品，為不同品種油茶籽粕資源的精深開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

長(zhǎng)林系列油茶籽，江蘇省宿遷市；紅花油茶籽，福建省建寧縣；普通白花油茶籽，浙江省衢州市。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH試劑)、乙醚、三氯乙酸、硫酸亞鐵、抗壞血酸(VC)、鄰苯三酚、鄰羥基苯甲酸、過(guò)氧化氫、三羥甲基氨基甲烷：分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

KH3200DE型數(shù)控超聲波清洗器，TD4A型臺(tái)式離心機(jī)，V5100型可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)試驗(yàn)方法

1.2.1 油茶籽的預(yù)處理

油茶籽→烘干→脫殼→粉碎→乙醚索氏回流→油茶籽粕。

1.2.2 油茶籽粕多糖的提取

參考郝繼偉[10]、楊衛(wèi)等[11]方法并略做修改。將已預(yù)處理的油茶籽粕與無(wú)水乙醇均勻混合以去除多余油脂，通風(fēng)晾干后加入一定料液比的蒸餾水，利用超聲波進(jìn)行輔助處理，離心去除沉淀。向上清液中加入一定量三氯乙酸靜置過(guò)夜，離心后去除沉淀，加入95%乙醇(4倍體積)于4 ℃冰箱中靜置過(guò)夜，經(jīng)離心獲得的乳白色沉淀，沉淀干燥即為油茶籽粕多糖。3種油茶籽粕多糖分別為：長(zhǎng)林系列油茶籽粕多糖(長(zhǎng)林)，紅花油茶籽粕多糖(紅花)，普通白花油茶籽粕多糖(白花)。

1.2.3 油茶籽粕多糖提取率

稱量脫脂干燥后油茶籽粕質(zhì)量(m0)和干燥后油茶籽粕多糖質(zhì)量(m1)，計(jì)算油茶籽粕多糖提取率公式為：

(1)

式中：Y為油茶籽粕多糖提取率/%；m0為脫脂干燥后油茶籽粕質(zhì)量/g；m1為干燥后油茶籽粕多糖質(zhì)量/g。

1.2.4 油茶籽粕多糖提取的單因素實(shí)驗(yàn)

以蒸餾水為浸提溶劑利用超聲波輔助提取油茶籽粕多糖，以不同功率、溫度、時(shí)間、料液比四個(gè)單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)條件如表1所示，使用式(1)計(jì)算油茶籽粕多糖提取率。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)水平

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，使用L9(34)正交實(shí)試驗(yàn)對(duì)油茶籽粕多糖的提取條件做優(yōu)化處理，選擇的合適水平如表2所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

1.2.6 油茶籽粕多糖體外抗氧化活性的測(cè)定1.2.6.1 對(duì)DPPH自由基清除能力實(shí)驗(yàn)

參考李欣欣等[12]的方法略作修改。取2 mL不同濃度的多糖樣品溶液，加入1 mmol/L DPPH乙醇溶液，震蕩均勻，25 ℃避光靜置50 min，記錄517 nm處吸光度值，以VC為對(duì)照，每組重復(fù)3次，使用式(2)計(jì)算清除率。

(2)

式中：E為自由基清除能力/%；A0為蒸餾水與DPPH溶液的吸光度；A1為樣品與DPPH溶液的吸光度；A2為樣品與2 mL無(wú)水乙醇溶液吸光度。

1.2.6.2 對(duì)OH·自由基清除能力實(shí)驗(yàn)

參考馬超等[13]的方法略作修改。配制6 mmol/L的FeSO4、H2O2和水楊酸溶液。取1 mL不同濃度的多糖樣品溶液，加入1 mL FeSO4和1 mL水楊酸溶液然后加入1 mL H2O2，震蕩均勻，水浴37 ℃避光反應(yīng)1 h，記錄510 nm處吸光度值，用VC作為對(duì)照，每組重復(fù)3次，按式(3)計(jì)算清除率。

(3)

式中：E為自由基清除能力/%；A0為蒸餾水與自由基的吸光度；A1為樣品、FeSO4溶液、水楊酸溶液和H2O2溶液混合后的吸光度；A2為水楊酸溶液換成蒸餾水與自由基的吸光度。

參考Li等[14]的方法略作修改。取0.4 mL不同濃度的多糖樣品溶液，加入1.84 mL Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.1)，混合均勻后，37 ℃水浴10 min，再加入0.16 mL的鄰苯三酚溶液，震蕩均勻，靜置4 min后加0.5 mL濃硫酸終止反應(yīng)，記錄325 nm處吸光度值，用VC作為對(duì)照，每組重復(fù)3次，按公式4計(jì)算清除率。

(3)

式中：E為自由基清除能力，%；A0為蒸餾水與自由基的吸光度；A1為樣品與自由基的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶粕多糖提取率單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 超聲波功率對(duì)多糖提取率的影響

由圖1得知，超聲波功率對(duì)油茶籽粕多糖的提取率有較明顯的影響。超聲波功率在60～90 W之間對(duì)3種油茶籽粕多糖提取率的影響是呈現(xiàn)正相關(guān)。隨著超聲波功率的提高，多糖提取率的增加趨勢(shì)越明顯，超聲波功率在80～90 W之間，多糖提取率上升趨勢(shì)最大，90 W時(shí)油茶籽粕多糖提取率最高。而在100 W時(shí)，3種油茶籽粕多糖提取率出現(xiàn)下降的情況。出現(xiàn)這種問(wèn)題可能是當(dāng)超聲波的功率增加，使得油茶籽粕傳質(zhì)作用效果增加，油茶籽粕多糖溶解度增加的同時(shí)，過(guò)高頻率的超聲波振動(dòng)導(dǎo)致溶解出的多糖部分降解[15]。從而使超聲波功率在100 W時(shí)，油茶籽粕多糖的提取率降低。在相同超聲波功率作用下，長(zhǎng)林提取率最高，紅花和白花提取率次之。綜上選取90 W左右為實(shí)驗(yàn)超聲波功率，故將80、90、100 W作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)考查水平。

圖1 不同超聲波功率下3種油茶籽粕多糖提取率

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

由圖2得知，提取時(shí)間對(duì)油茶籽粕多糖的提取率有較明顯的影響。提取時(shí)間在25～55 min之間，3種油茶籽粕多糖提取率與提取時(shí)間呈正相關(guān)，即油茶籽粕多糖提取率隨提取時(shí)間變長(zhǎng)而提高，45 min到55 min多糖提取率上升最明顯，在55 min時(shí)提取率達(dá)到峰值。但65 min后，油茶籽粕多糖提取率出現(xiàn)下降的現(xiàn)象。原因可能是超聲波作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使部分多糖溶解出來(lái)后長(zhǎng)時(shí)間受到機(jī)械剪切力作用反被破壞[16]。在相同提取時(shí)間下，長(zhǎng)林提取率最高，紅花和白花提取率略低。因此，選取55 min左右為實(shí)驗(yàn)提取時(shí)間，故將45、55、65 min作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)考查水平。

圖2 不同提取時(shí)間下3種油茶籽粕多糖提取率

2.1.3 溫度對(duì)多糖提取率的影響

由圖3得知，提取溫度在45～55 ℃之間時(shí)，3種油茶籽粕多糖提取率與提取溫度呈現(xiàn)正相關(guān)，即油茶籽粕多糖提取率隨提取溫度增加而增長(zhǎng)，因?yàn)殡S著提取溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，有利于多糖分子析出至溶劑。提取溫度在65 ℃以上3種油茶籽粕多糖提取率有不同的變化，白花提取率開(kāi)始下降，另兩種多糖提取率少量上升，在75 ℃后長(zhǎng)林和紅花提取率出現(xiàn)下降。出現(xiàn)多糖提取率下降的原因可能是多糖在高溫情況下分解或高溫使溶劑蒸發(fā)嚴(yán)重進(jìn)而影響提取率[7]。在相同提取溫度作用下，長(zhǎng)林提取率在3種多糖中最高，紅花和白花提取率略低。因此，選取65 ℃左右為實(shí)驗(yàn)提取溫度，故將55、65、75 ℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)考查水平。

圖3 不同提取溫度下3種油茶籽粕多糖提取率

2.1.4 料液比對(duì)多糖提取率的影響

由圖4得知，料液比在(1∶10)～(1∶20)之間對(duì)3種油茶籽粕多糖提取率的影響呈現(xiàn)正相關(guān)，即油茶籽粕多糖提取率隨提取溫度增加而增長(zhǎng)，當(dāng)料液比超過(guò)1∶20后3種油茶籽粕多糖提取率趨于穩(wěn)定。說(shuō)明提取液在這個(gè)范圍內(nèi)傳質(zhì)作用已經(jīng)達(dá)到平衡，不會(huì)繼續(xù)隨著料液比增加而增加。在相同料液比作用下，長(zhǎng)林提取率最高，其次為紅花提取率，最次為白花提取率。選取1∶20左右為實(shí)驗(yàn)料液比，故將1∶15、1∶20、1∶25作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)考查水平。

圖4 不同料液比下3種油茶籽粕多糖提取率

2.2 正交實(shí)驗(yàn)分析

由表3得知，根據(jù)R分析長(zhǎng)林、紅花和白花提取率的影響因素從主到次排列是∶C(提取溫度)>D(料液比)>A(超聲波功率)>B(提取時(shí)間)。由k值大小得出結(jié)論，油茶籽粕多糖最優(yōu)提取工藝為A2B3C3D3，即超聲波功率90 W，提取時(shí)間65 min，提取溫度75 ℃，料液比1∶25。但提取時(shí)間影響最小且提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致提取率下降，故結(jié)合實(shí)際情況，油茶籽粕多糖最優(yōu)提取工藝為A2B2C3D3，即超聲波功率90 W，提取時(shí)間55 min，提取溫度75 ℃，料液比1∶25，在此條件下油茶籽粕多糖的提取率為長(zhǎng)林(14.08±0.23)%、紅花(14.03±0.32)%和白花(13.11±0.21)%。

表3 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 對(duì)DPPH自由基清除能力

具有抗氧化活性的物質(zhì)通過(guò)供氫將紫色的DPPH自由基還原成黃色的二苯肼，故DPPH自由基清除率常用于體外抗氧化實(shí)驗(yàn)的研究[17]。由圖5得知，樣品質(zhì)量濃度在1.0～5.0 mg/mL之間內(nèi)，3種油茶籽粕多糖質(zhì)量濃度越高，對(duì)DPPH自由基清除率越大，表現(xiàn)為良好的量效關(guān)系，且相同質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)DPPH自由基清除能力接近。長(zhǎng)林、紅花和白花質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，3種多糖對(duì)DPPH自由基的清除率分別為78.88%、78.51%和71.56%。3種油茶籽粕多糖對(duì)DPPH自由基清除能力由強(qiáng)到弱依次為長(zhǎng)林>紅花>白花。

圖5 3種油茶籽粕多糖對(duì)DPPH自由基清除曲線

2.3.2 對(duì)OH·自由基清除能力

在機(jī)體中OH·自由基能穿透生物膜，嚴(yán)重破壞生物分子引發(fā)機(jī)體疾病，故OH·自由基清除率常用于體外抗氧化實(shí)驗(yàn)的研究測(cè)[17]。由圖6得知，樣品質(zhì)量濃度在1.0～5.0 mg/mL之間，3種油茶籽粕多糖對(duì)OH·自由基清除率隨多糖質(zhì)量濃度的增加而增加。3種油茶籽粕多糖質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，紅花、長(zhǎng)林和白花，對(duì)OH·自由基清除率分別為，67.92%、65.60%和59.65%。3種油茶籽粕多糖對(duì)OH·自由基清除能力由強(qiáng)到弱依次為紅花>長(zhǎng)林>白花。

圖6 3種油茶籽粕多糖對(duì)OH·自由基清除曲線

圖7 3種油茶籽粕多糖對(duì)自由基清除曲線

3 結(jié)論

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲輔助提取3種油茶籽粕多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的提取條件為：提取溫度75 ℃，料液比1∶25，超聲波功率90 W，提取時(shí)間55 min。長(zhǎng)林的提取率最高，為(14.08±0.23)%。3種油茶籽粕多糖都具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且自由基清除能力與多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，同種油茶籽粕多糖對(duì)不同類型自由基的清除能力不同，但3種油茶籽粕多糖均對(duì)DPPH自由基具有顯著的清除效果。與其他品種相比，長(zhǎng)林的提取率最高且對(duì)自由基清除能力最強(qiáng)，這可能與產(chǎn)地氣候和土地成分等因素有關(guān)，其深層次原理有待進(jìn)一步探究。