李桂女，李和教，黃 易，余 彬

（1.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，?？?570102；2.成都市第一人民醫(yī)院，成都 610041；3.綿陽市中心醫(yī)院，綿陽 621000）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見并發(fā)癥之一，屬于微血管并發(fā)癥，是由于長期高血糖導致代謝及其他功能紊亂而引起的腎小球硬化癥[1]，臨床表現(xiàn)主要為蛋白尿、水腫、高血壓、腎小球濾過率降低，甚至進展為腎功能不全、尿毒癥；DN是糖尿病主要的死亡原因之一，亦是增大糖尿病死亡風險的主要原因[2]；相對于單純的糖尿病患者，DN患者的死亡風險是其12倍，不僅給患者的健康及心理帶來嚴重的影響，還給社會及其家庭帶來嚴峻的考驗[3-4]。目前，西醫(yī)在治療DN上只能延緩疾病進一步發(fā)展，但并未治愈疾病本身，并且治療過程中長期服用藥物會導致藥物依賴性、泌尿道及生殖系統(tǒng)出現(xiàn)感染等不良反應，治療效果及患者死亡下降率尚未滿意。因此，尋找治療DN的新方法尤為迫切。

中藥在治療疾病的作用中體現(xiàn)多成分、多靶點及多通路等特點。研究[5]表明，中醫(yī)中藥在臨床上治療DN的效果顯著，尤其在DN前期的治療效果尤佳。中醫(yī)認為DN發(fā)生發(fā)展的整個過程中會產生氣陰兩虛及血瘀，因此，治療也應以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀為主[6]。血府逐瘀湯（口服液、膠囊）是治療“胸中血府淤血”的常用理血藥方之一，具有活血化瘀、行氣通絡之效，在臨床上治療DN具有較好的療效，可過調節(jié)機體代謝、改善腎微循環(huán)、改善血流動力學紊亂與高凝狀態(tài)及減少致病性細胞因子等改善DN患者臨床癥狀[7-8]。但基礎研究較少，血府逐瘀湯治療DN的關鍵靶點及機制尚不明確。本研究運用網絡藥理學方法，篩選血府逐瘀湯的活性成分靶點，構建“活性成分-潛在靶點”和“成分-潛在靶點-通路”網絡，尋找潛在通路，從整體上對中藥物質基礎和藥理作用進行系統(tǒng)和多層次的解析[9]，為更深入研究血府逐瘀湯治療DN的潛在作用機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 血府逐瘀湯活性成分的篩選

以“桃仁、紅花、當歸、川芎、赤芍、牛膝、柴胡、桔梗、甘草、枳殼、地黃”為關鍵字，通過檢索TCMSP數據庫以及查詢相關文獻，收集符合口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18條件[10]的活性成分，篩選血府逐瘀湯的活性成分，并且通過Pub－Chem數據查詢活性成分對應的結構式（SMILES）。

1.2 血府逐瘀湯活性成分靶點反向預測

通過將SMILES依次輸入Swiss數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）[11]中的Swiss，以“人類”為研究物種預測活性成分的靶點，整合去重得到血府逐瘀湯的作用靶點。

1.3 DN的靶點獲取

利用“diabetic nephropathy”為關鍵詞，對Gene Card數據庫[12]進行疾病靶點的檢索及篩選。整合去除重復靶點，即可獲得DN的相關靶點。

1.4 構建活性成分-潛在靶點網絡圖

利用韋恩圖（Venn diagram）得到成分靶點與疾病靶點的交集，即潛在靶點，使用Cytoscape 3.6.1軟件構建活性成分-潛在靶點網絡。網絡圖中的節(jié)點（node）分別為活性成分和潛在靶點；邊（edge）表示三者的相互關系。使用Cytoscape中Network Analysis插件對相應網絡進行拓撲性質分析，根據節(jié)點連接度（degree）和介數中心性（betweenness centrality）設置網絡樣式，節(jié)點大小反映degree大小，邊的粗細反映betweenness centrality大小。

1.5 蛋白質相互關系網絡構建和關鍵靶點篩選

將血府逐瘀湯治療DN的潛在靶點導入String數據庫，得到潛在作用靶點的PPI網絡，結果以TSV格式導出，將結果中的node1、node2、combined score信息以TXT格式導入Cytoscape軟件中進行可視化和Network Analyzer分析，以節(jié)點度值（degree）和介數中心度（betweenness centrality）大于等于所有點中位數值2倍的靶點，并滿足接近中心度（closeness centrality）大于所有點中位數值條件篩選關鍵靶點作為血府逐瘀湯治療DN的“關鍵靶點”，研究關鍵靶標可能存在的藥理作用。

1.6 GO富集分析與KEGG通路分析

通過DAVID數據庫對血府逐瘀湯治療DN的關鍵靶點進行Gene Ontology分析（生物過程、分子功能和細胞成分3個層面）和Pathways分析，保存并整理結果，篩選排名靠前的生物過程或信號通路，通過Omicshare進行可視化分析。

1.7 構建活性成分-潛在靶點-通路網絡圖

根據KEGG分析結果篩選出關鍵基因富集基因數相對較大的通路，通過Cytoscape軟件構建活性成分-潛在靶點-通路網絡圖。

2 結果

2.1 血府逐瘀湯的活性成分篩選結果

通過TCMSP數據庫以及文獻分別檢索血府逐瘀湯的活性成分及相應靶點等信息，滿足OB≥30%和DL≥0.18條件的成分作為主要活性成分，共得到活性成分212個，其中桃仁23個、紅花22個、當歸2個、川芎7個、赤芍29個、牛膝20個、柴胡17個、桔梗7個、甘草23個、枳殼5個、地黃57個，去重及去除無結構式的活性成分后有105個活性成分，部分主要活性成分見表1。

表1血府逐瘀湯主要活性成分信息

2.2 構建血府逐瘀湯活性成分-血府逐瘀湯治療DN的潛在靶點藥理網絡

活性成分-潛在靶點藥理網絡共包括202個節(jié)點和1 249個邊，該網絡包含了98個化合物節(jié)點和104個潛在靶點節(jié)點，見圖1。潛在的活性成分與靶點產生1 436個相互作用關系。通過Network Analyzer對網絡圖進行分析，結果顯示，與潛在靶點相互作用的活性成分中，橙皮素（Degree28）、木脂素（Degree27）、刺槐黃素（Degree27）、刺甘草查爾酮（Degree27）、漢黃芩素（Degree26）等與其他靶點連接度大于活性成分的中位數度值，即與6個以上靶點連接，是血府逐瘀湯治療DN的主要成分；在這個網絡中，藥物活性成分可作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，一種成分對應多個靶點，一個靶點也對應多種成分，這體現(xiàn)了其多成分、多靶點的作用特點。

圖1 血府逐瘀湯的“活性成分-靶點”網絡圖

2.3 蛋白相互作用網絡的構建和分析

使用STRING網站對得到的血府逐瘀湯治療DN的潛在靶點進行分析，為獲得更加簡潔的PPI網絡，首先刪除自相作用關系的蛋白邊，然后刪除沒有相互作用蛋白的節(jié)點，再使用Cytoscape軟件構建潛在蛋白質-潛在蛋白質相互作用（PPI）網絡，見圖2。PPI網絡中有104個節(jié)點和1 316個邊緣。PPI網絡圖中節(jié)點的大小與其在網絡中的度值呈正相關。節(jié)點的度值越大，其在網絡中作用越重要，相應的蛋白質靶點在疾病過程中有著更重要的作用。而在PPI圖中，用紅色代表度值較大的關鍵蛋白，在PPI網絡中白細胞介素（interleukin，IL）-6（Degree74）、TNF（Degree73）、GAPDH（Degree73）、AKT1（Degree70）、VEGFA（Degree62）、IL-1B（Degree62）、IL-2（Degree38）、MMP9（Degree50）、MMP2（Degree39）、STAT1（Degree36）蛋白質節(jié)點的程度較高，大于節(jié)點中位數對應的度的2倍以上，這些靶點蛋白可能在DN的發(fā)展中起關鍵作用，見表2。

圖2 血府逐瘀湯治療DN潛在靶點相互作用網絡圖

2.4 生物通路富集分析

使用DAVID網站對血府逐瘀湯治療DN的關鍵靶點進行GO富集分析，得到P<0.05的富集GO條目共計109個，其中包含生物過程條目共74個，最顯著的為ERK1和ERK2級聯(lián)正調控、蛋白磷酸化、MAP激酶活性的正調節(jié)、GTP酶活性的正調控等；細胞組成分析結果共有13條，最顯著的為核質、細胞外間隙、胞外區(qū)、細胞質核周區(qū)等；分子功能分析結果共有22條，最顯著的為酶活性、ATP結合、細胞因子活性、轉錄因子活性、DNA結合等，各類分別取前20條。通過對血府逐瘀湯治療DN的關鍵靶點進行KEGG通路分析得到P<0.05的通路共76條，包括JAK-STAT信號通路、缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、Toll樣受體信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、FoxO信號通路、雌激素信號通路等，見圖3。此20條作用通路均與血府逐瘀湯治療DN相關的8個以上靶基因富集重疊，揭示血府逐瘀湯的有效成分可能通過作用于以上多條信號通路來治療DN。相關通路信息及富集基因，見表3。

圖3 GO富集分析和KEGG富集分析氣泡圖

表2血府逐瘀湯治療DN的關鍵靶點

2.5 構建血府逐瘀湯活性成分-潛在靶點-通路網絡

為研究血府逐瘀湯治療DN的主要作用通路，本研究將血府逐瘀湯治療DN作用的35個關鍵靶點蛋白置入DAVID數據庫中進行通路富集分析，刪除結果中含有特殊疾病信號通路，并將結果在Cytoscape軟件中構建血府逐瘀湯活性化合物-疾病靶點-通路網絡，見圖4。該網絡共有127個節(jié)點和289個邊，該網絡有77個血府逐瘀湯中的化合物，27個主要的DN潛在靶點和13個通路。其中TNF信號通路有8個關鍵靶點富集、JAK-STAT信號通路有4個靶點富集、HIF-1信號通路有8個蛋白富集、Toll樣受體信號通路有10個蛋白富集、胰島素抵抗和FoxO信號通路有9個蛋白富集，其余通路富集蛋白數量見表3。

圖4 血府逐瘀湯治療DN的“活性成分-靶點-通路”網絡圖

表3 KEGG富集通路條目信息

3 討論

中醫(yī)認為，DN屬于“消渴證”“尿濁證”范疇，屬于“水腫”和“消渴”類型，腎是主要病位，主要累及脈絡、脾和肝。血府逐瘀湯中的成分有甘草、生地黃、牛膝、桔梗、枳殼、柴胡、紅花、赤芍、桃仁、川芎和當歸。赤芍、川芎和當歸不僅可以起到養(yǎng)血療效，還可以活血化瘀；赤芍、枳殼和柴胡主要療效為疏肝理氣；川芎、當歸、紅花、生地黃和桃仁不僅可以養(yǎng)陰潤燥，還能活血化瘀。一般可以通過調節(jié)機體代謝和改善微循環(huán)來發(fā)揮活血化瘀對于DN的防治作用。各種藥物一起使用，則可以有效通暢氣血、疏通血脈，起到消腫的療效。DN的生理病理機制十分復雜，越來越多的現(xiàn)代藥理學研究顯示其可能跟炎性因子、糖脂代謝紊亂、血流動力學改變、氧化應激及遺傳因素等多方面[13-14]有關，共同參與了DN的發(fā)生與發(fā)展過程。

3.1 血府逐瘀口服液的中藥化學成分靶標分析

在血府逐瘀湯治療DN的成分靶點網絡中，包括103個活性成分和104個潛在主要靶點，其中有28個化合物能與20個及以上靶點發(fā)生相互作用，包括山柰酚（kaempferol）、黃芩黃素（baicalein）、刺甘草查爾酮（glypallichalcone）、刺槐黃素（acacetin）、木犀草素（luteolin）、漢黃芩素（wogonin）、表小檗堿（epiberberine）。槲皮素具有抗炎、抗氧化等作用，對糖尿病并發(fā)癥如DN、視網膜病變等具有較好的療效[15]，還可通過抑制糖尿病腎臟的氧化和糖化來控制糖尿病并發(fā)癥[16]。與槲皮素化學結構類似的山柰酚具有降空腹血糖、改善胰島素抵抗、調節(jié)糖脂代謝紊亂、抗氧化應激和炎性反應等作用[17-18]。查爾酮類可通過抑制相關蛋白及基因的表達（p22phox、p47phox mRNA）、轉錄及翻譯，降低還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性，減輕腎臟氧化應激程度。在臨床治療中，中藥與西藥相比，其治療疾病的作用機制更為復雜，但毒性較小，DN發(fā)病機制主要是高血糖所引起的腎臟血流動力學變化、氧化應激、腎組織炎性反應增加等。血府逐瘀口服液作用原理主要是通過調節(jié)機體代謝、改善腎微循環(huán)、改善血流動力學紊亂與高凝狀態(tài)及減少致病性細胞因子等治療DN。

3.2 血府逐瘀湯治療DN的核心靶標分析及關鍵通路分析

本研究通過構建“活性成分-靶點”網絡及對相關的通路進行分析，探討血府逐瘀湯治療DN的關鍵靶點及其作用機制。對“成分-靶點”網絡圖進行拓撲分析潛在靶點，推測血府逐瘀湯的活性成分主要通過作用于MAPK8、STAT1、IL-2、MMP2、MTOR、SIRT1、ESR1、MMP9、STAT3、IL-1B、VEGFA、AKT1、TNF、IL-6等關鍵基因上發(fā)揮調控DN的發(fā)生發(fā)展過程。

通過DAVID數據庫對關鍵靶點進行GO和KEGG富集分析，GO富集和KEGG通路富集結果顯示，關鍵靶點主要富集于TNF信號通路、JKA-STAT信號通路、雌激素信號通路、HIF-1信號通路等，涉及ERK1和ERK2級聯(lián)正調控、蛋白磷酸化、MAP激酶活性的正調節(jié)等生物過程。炎性因子介導的微炎環(huán)境與DN的發(fā)生發(fā)展存在緊密關系[19]，產生了極大影響。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1B、IL-6及TNF等炎性因子參與DN病情發(fā)生及進展并直接與患者的蛋白尿程度相關[15]，通過引起腎小球基底膜厚度增加而加速了2型糖尿病患者終末期腎病的病情進展[16-17]。這說明改善或抑制DN患者機體微炎環(huán)境（抑制炎癥因子的分泌等）可影響及優(yōu)化DN患者的預后和治療效果。絲裂原活化蛋白激酶，即MAP酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）參與調控細胞代謝凋亡及基因表達等效應，活化后的p38MAPK可通過多種途徑參與細胞應激、炎性反應和凋亡，進一步促進DN的發(fā)生、發(fā)展[18，20]；抑制p38MAPK表達水平可以明顯減少DN的蛋白尿，減輕巨噬細胞、T細胞的浸潤和炎性介質的釋放，最終延緩DN的進展、降低氧化應激損傷、抑制腎臟組織細胞凋亡、降低炎性介質水平，對2型糖尿病大鼠腎臟組織起保護作用。而細胞外信號調節(jié)激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）是MAPK家族最主要成員，主要參與細胞的生長、發(fā)育、分裂、凋亡等多種生理反應的過程，是胞內介導胞外刺激的重要信號系統(tǒng)之一[21]。激活ERK1/2信號通路可誘導足細胞損傷、腎間質炎癥及纖維化等，參與DN的發(fā)生發(fā)展[22]。也證實ERK1/2信號通路激活可促進腎臟系膜細胞增殖，進而導致腎小球的硬化。

JAK2/STAT3信號途徑參與了多種重要致炎/抗炎細胞因子包括腫瘤壞死因子（TNF）、IL-1等的信號轉導及基因調控過程[23]，可誘導細胞凋亡，引起腎組織的免疫炎癥性反應，通過氧化應激與糖脂代謝交叉調控進而引起糖代謝紊亂[24]；有實驗證明[25-26]，糖尿病大鼠腎小球及系膜細胞中JAK/STAT途徑活性明顯增強，相關蛋白表達水平升高，而活化的JAK2/STAT3信號通路可進一步刺激細胞外基質合成及腎小球系膜細胞增殖，最終導致腎損傷；抑制JAK/STAT信號通路及其調控的炎癥因子及纖維化相關蛋白的活化與表達，從而對DN的進展起到延緩作用[27]。由此可見，血府逐瘀湯有效活性成分可能通過參與調控血漿黏稠程度、血清總膽固醇等血液流變學保護腎臟，通過細胞凋亡有效清除大量的增生細胞，進而對腎臟功能給予有效保護。

本研究通過網絡藥理學方法初步探討了血府逐瘀湯的化學成分，治療DN的關鍵靶點、關鍵通路，并進行了預測分析，為后期研究其治療DN的機制提供參考，為其臨床治療DN提供理論依據，但其具體的機制還需通過體內和體外實驗來進一步確證。