李孝初，袁秀芳，蘇菲，余斌，李軍星，葉十一，徐麗華*，肖琛聞*

(1.寧波鄞州中銘農(nóng)業(yè)科技有限公司，浙江 寧波 315000；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

Eichwald和Silmsersl于1955年利用純系C57BL/6小鼠進(jìn)行皮膚移植試驗(yàn)時(shí)首次發(fā)現(xiàn)H-Y抗原[1]。這種抗原屬于次要組織相容性抗原，在哺乳動(dòng)物中是雄性個(gè)體中特異基因的表達(dá)產(chǎn)物[2]。H-Y抗原的發(fā)現(xiàn)，引起了H-Y抗原對(duì)精子選擇和胚胎性別鑒定的廣泛研究[3]。雖然利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)獲取的H-Y單克隆抗體具有純度和效價(jià)高的優(yōu)點(diǎn)，但由于H-Y抗原亞型多，單克隆抗體篩選的機(jī)遇性極大，研究周期長，技術(shù)難度大，因此難以成功[4]。在實(shí)際中，大多仍以動(dòng)物制備多克隆抗H-Y抗體。本試驗(yàn)探索以不同兔H-Y抗原的提取和免疫接種程序來制備兔H-Y抗血清，并用ELISA法測定抗血清效價(jià)，用所制備的抗血清以Western-blot技術(shù)檢測兔睪丸H-Y抗原組分。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

從浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種兔場選取2組同窩生新西蘭試驗(yàn)兔8只(第1組1公3母；第2組2公2母)，每只體重1.5～2.0 kg，3～4月齡。委托浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種兔場進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)管理，試驗(yàn)起始于1月，結(jié)束于7月。

1.2 睪丸H-Y抗原的制備

將公兔放血致死，無菌操作取出睪丸，立即置冰浴上剝離被膜和附睪，將睪丸剪成小塊，置無菌的5 mL玻璃勻漿器中，按1∶5加入預(yù)冷的0.01 mol·L-1PBS，冰浴制取勻漿，4 ℃ 2 000 r·min-1離心10 min，取上清用Lowery法測定蛋白濃度。分裝于1.5 mL小試管，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫方法和程序

免疫前每只試驗(yàn)兔分別采血約5 mL，分離血清，用作陰性血清對(duì)照，-70 ℃保存?zhèn)溆?。每次免疫時(shí)從-70 ℃取出H-Y抗原適量，等量加入完全弗氏佐劑，用超聲波完全乳化備用。試驗(yàn)共分2組，每組用公兔睪丸H-Y抗原免疫同窩母兔，以減少個(gè)體間抗原反應(yīng)，提高獲取抗H-Y抗血清的可能性。

第1組試驗(yàn)兔背部分2點(diǎn)皮下注射0.5 mL，然后每隔2周同法加強(qiáng)免疫一次，劑量相同，共免疫5次。將H-Y抗原加入等量不完全弗氏佐劑，用超聲波混合乳化完全，最后加強(qiáng)免疫一次，劑量同前，免疫后隔10 d，兔子采血致死，分離血清，每兔各得約20 mL抗血清，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第2組試驗(yàn)兔第一次足墊注射免疫同窩2母兔，每只0.5 mL，然后每周皮下加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，劑量相同，最后一次免疫后，隔2周，分別采血致死，分離血清，每兔各得約20 mL抗血清，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 H-Y抗血清的效價(jià)測定

從-70 ℃取出兔睪丸H-Y抗原，以NaHCO3/Na2CO3緩沖液稀釋至0.01 mg·mL-1，包被96孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，4 ℃過夜。取出酶標(biāo)板，用5%脫脂奶粉封閉1 h。用pH 7.2的0.01 mol·L-1PBST洗滌3次。每孔加入1∶50稀釋的抗血清100 μL，37 ℃作用1 h，同法洗滌3次。再加入酶標(biāo)SPA，37 ℃作用1 h后洗滌3次，用OPD+H2O2顯色，最后用2 mol·L-1H2SO4終止液(各50 μL)終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀于490 nm處測定D值,計(jì)算抗血清效價(jià)。

將上述取得的H-Y抗血清分別取15 mL，使用精子細(xì)胞毒性分析法測定H-Y抗血清的效價(jià)。

1.5 Western-blot檢測兔H-Y抗原組分

從-70 ℃取出睪丸H-Y抗原液適量，加入等量2×SDS上樣緩沖液混勻，煮沸3 min，高速離心后備用。同時(shí)制備12% SDS-PAGE，每孔上樣10 μL，120 V恒壓電泳2 h。電泳完畢，取出凝膠，立即進(jìn)行電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上，4 ℃ 30 V恒壓電泳過夜。

取出硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，用0.01 mol·L-1PBST洗滌3次，加入1∶50稀釋的抗血清，37 ℃作用1 h；同法洗滌3次，再用酶標(biāo)SPA作用1 h，同法洗滌后用DAB+H2O2顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 睪丸H-Y抗原蛋白濃度

本研究選取的2窩試驗(yàn)兔，分別取睪丸，研磨成勻漿，離心后用Lowery法測定蛋白濃度，第1組H-Y抗原蛋白濃度為28 mg·mL-1，第2組為24 mg·mL-1。

2.2 ELISA法測定兔H-Y抗血清效價(jià)

用提取的睪丸抗原包被酶標(biāo)板后，分別用免疫前血清和免疫后血清進(jìn)行倍比稀釋，按常規(guī)操作進(jìn)行ELISA法檢測，最后于波長490 nm處測定D值。結(jié)果(圖1)表明，0830#兔子免疫前和免疫后D值變化較明顯，抗體效價(jià)在1∶100以上；其余4只試驗(yàn)兔免疫前和免疫后D值變化不明顯。

圖1 兔H-Y抗血清效價(jià)

用提取的睪丸抗原包被酶標(biāo)板后，分別用免疫前血清和免疫后血清進(jìn)行倍比稀釋，按常規(guī)操作進(jìn)行ELISA法檢測，最后于波長490 nm處測定D值。結(jié)果表明，0830#兔子免疫前和免疫后D值變化較明顯，抗體效價(jià)在1∶100以上；其余4只試驗(yàn)兔免疫前和免疫后D值變化不明顯。

2.3 Western-blot驗(yàn)證

免疫的2組試驗(yàn)兔，第1組有3只，抗血清編號(hào)為0829#、0830#、0889#；第2組有2只，抗血清編號(hào)為0337#、0397#。第1組試驗(yàn)中，4次免疫后采血，進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，無條帶，再加強(qiáng)免疫一次后采血。將5份抗血清分別進(jìn)行Western-blot，最后顯色觀察，只有0830#兔抗血清作用的硝酸纖維素薄膜出現(xiàn)一條較弱的特異性條帶，另外的4個(gè)抗血清均無條帶出現(xiàn)(圖2)。

圖2 兔睪丸提取液的SDS-PAGE和Western-blot驗(yàn)證

3 小結(jié)與討論

哺乳動(dòng)物的性別由性染色體決定，雌性的性染色體為“XX”，雄性的性染色體為“XY”。根據(jù)這個(gè)特性，我們可以先分離X和Y精子，再通過人工授精的辦法有效地達(dá)到性別控制的目的。1955年在同一品系小鼠不同雌雄個(gè)體間進(jìn)行皮膚移植時(shí)發(fā)現(xiàn)，雌性小鼠對(duì)雄性小鼠的皮膚移植有強(qiáng)烈地排斥反應(yīng)[5]，這種現(xiàn)象源于一種雄性特異性的抗原，稱之為Y染色體組織相容性抗原(Y-chromosomal histocompatibility antigen)，簡稱“H-Y抗原”。Billingham等在1968年進(jìn)一步證實(shí)，H-Y抗原是一種結(jié)合在細(xì)胞表面的糖蛋白，存在于所有哺乳動(dòng)物含有Y染色體的雄性細(xì)胞表面。許多科學(xué)家對(duì)H-Y抗原的特異性進(jìn)行了系統(tǒng)分析，結(jié)果推測H-Y抗原是一種弱抗原，由多個(gè)抗原表位組成，而每一個(gè)抗原表位僅有8～11個(gè)氨基酸。Greenfield等[6]報(bào)道，在小鼠上已經(jīng)鑒定出4個(gè)H-Y抗原表位，其中2個(gè)H-Y抗原表位的編碼基因均為Smcy，一個(gè)編碼基因?yàn)閁ty，第4個(gè)表位的編碼基因目前未知。其中Smcy和Uty表位基因在X染色體上的同源基因分別為Smcx和Utx，而在小鼠中這2個(gè)基因表達(dá)的抗原表位與H-Y基因的差異比較大。H-Y抗原表位在人類中鑒定出2個(gè)由Smcy編碼的H-Y抗原表位，其中一個(gè)表位與同源基因Smcx編碼的多肽僅差2個(gè)氨基酸。在精子中，H-Y抗原主要存在于精子頂體，附睪頭分離的精子其H-Y抗原主要分布于靠近精子的尾部，附睪尾分離的精子其抗原主要分布于頂體后端。很多試驗(yàn)證實(shí)只有Y精子才能表達(dá)H-Y抗原。H-Y抗原的發(fā)現(xiàn)開辟了利用抗原抗體反應(yīng)原理進(jìn)行性別控制的新途徑，由H-Y抗體識(shí)別H-Y抗原，再通過一定分離程序?qū)⒕臃蛛x成X精子和Y精子，再選擇其中一種精子進(jìn)行人工授精后得到所需性別的后代。

國內(nèi)對(duì)H-Y單克隆抗體的研究已有多年歷史。小鼠H-Y抗原已被發(fā)現(xiàn)與多種動(dòng)物發(fā)生交叉反應(yīng)，包括人類、大鼠、兔、狗、鼴鼠、田鼠、鳥類、青蛙，甚至龍蝦、甲蟲、蟑螂和硬骨魚等無脊椎動(dòng)物[7]。牛樹理等[8]采用間接ELISA條件提高靈敏度，建立檢測H-Y抗體的檢測方法。利用純系BALB/c公鼠免疫同系母鼠制備H-Y單抗，間接免疫熒光法鑒定胚胎性別PCR方法驗(yàn)證準(zhǔn)確率。結(jié)果表明，在18枚H-Y陽性胚胎中有15枚雄性胚胎和3枚雌性胚胎準(zhǔn)確率為83%，在16枚H-Y陰性胚胎中有15枚雌性胚胎和1枚雄性胚胎準(zhǔn)確率為94%。杭蘇琴等[9]以純系BALB/c雄性小鼠脾細(xì)胞腹腔注射免疫同系雌性小鼠9次，獲得的抗血清經(jīng)雌、雄鼠脾細(xì)胞吸收后用于精子細(xì)胞毒性試驗(yàn)，測得H-Y抗血清效價(jià)為1∶160。本次試驗(yàn)選取體重相近的全同胞新西蘭兔，進(jìn)行不同程序的免疫方式制備兔H-Y抗血清，結(jié)果5只受免疫的兔子中，只有0830#兔子產(chǎn)生較高效價(jià)的抗體滴度，并在Western-blot中出現(xiàn)一條較弱的特異性條帶。說明不同的免疫方法，其免疫效果也有很大差別。而同窩公兔睪丸提取液免疫同窩母兔，其產(chǎn)生抗血清的效價(jià)也不同，說明個(gè)體對(duì)H-Y抗原的敏感性也有很大的差異。

根據(jù)資料報(bào)道，H-Y抗原是一種弱組織相容性抗原，對(duì)不同動(dòng)物的反應(yīng)差異較大，免疫效果較差，產(chǎn)生的抗血清效價(jià)不高，一般獲得的效價(jià)只有1∶4～1∶16。而用本試驗(yàn)所制備的兔H-Y抗原，以不同免疫程序，多點(diǎn)免疫，多次免疫，結(jié)合使用佐劑免疫等方法，最后獲取的效價(jià)較高，ELISA檢測效價(jià)在1∶100以上，兔H-Y抗血清制備獲得初步成功。對(duì)H-Y抗體效價(jià)的測定中，以往都是采用間接免疫熒光分析法、精子細(xì)胞毒性分析法和囊胚形成抑制法等方法，但這些方法都存在一定的不足之處。間接免疫熒光分析法準(zhǔn)確率低，特異性差；精子細(xì)胞毒性分析法需要采集活精子進(jìn)行試驗(yàn)，眼觀判定精子活力，結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性不強(qiáng)。而本試驗(yàn)探索建立ELISA法，檢測H-Y抗血清的效價(jià)滴度，為H-Y抗血清效價(jià)的測定提供了一種新的檢測方法。

本試驗(yàn)通過Western-blot技術(shù)，檢測到兔睪丸H-Y抗原有一條分子量約為90 ku的反應(yīng)條帶。SDS-PAGE顯示兔睪丸提取液中蛋白成分極為復(fù)雜，而Western-blot僅檢測到一條顯色帶，特異性極強(qiáng)，該蛋白很可能就是H-Y抗原的主要成分。但據(jù)報(bào)道，人的H-Y抗原基因的mRNA為4 619 bp[10],鼠的H-Y抗原基因的mRNA為4 655 bp，其對(duì)應(yīng)蛋白的理論分子量約為170 ku[11]，與本試驗(yàn)檢測到的分子量差異很大，造成此結(jié)果的原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證，可能是因?yàn)樵谕貌G丸H-Y抗原制備過程中蛋白發(fā)生部分降解。