趙健，付巖，王全勝

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 寧波市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心，浙江 寧波 315040)

配合飼料是由糧谷和不同營(yíng)養(yǎng)組分等按特定配比配制而成，是畜禽的食物。飼料的質(zhì)量決定了畜產(chǎn)品的質(zhì)量，畜產(chǎn)品的質(zhì)量問(wèn)題可以從飼料質(zhì)量檢驗(yàn)中找出。糧谷生長(zhǎng)過(guò)程中，農(nóng)藥被用來(lái)防治病蟲(chóng)草害[1]；真菌毒素、嘔吐毒素等產(chǎn)生于糧谷種植和貯藏過(guò)程[2]；抗生素被一些飼料生產(chǎn)企業(yè)和養(yǎng)殖企業(yè)在飼料中違規(guī)使用[3]。因此，配合飼料存在3類有毒有害物質(zhì)超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)畜禽產(chǎn)品造成污染，最終通過(guò)食物鏈轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，所以對(duì)飼料中3類有毒有害物質(zhì)的監(jiān)測(cè)非常必要。3類藥物，目前檢測(cè)儀器主要有液相色譜[4-6]、氣相色譜[7-8]、UPLC-MSMS[9-11]、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)[12-15]等，但仍以單類農(nóng)藥殘留、獸藥殘留和真菌毒素為主，同時(shí)檢測(cè)配合飼料中3種有毒有害物質(zhì)的方法仍少見(jiàn)。本文擬開(kāi)發(fā)配合飼料中農(nóng)藥殘留、獸藥殘留和真菌毒素等3大類，共9種(黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星、金剛烷胺、三唑磷、多菌靈、甲草胺)同時(shí)檢測(cè)方法。旨在為配合飼料樣品快速檢測(cè)3類有毒有害物質(zhì)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲酸、甲醇、乙腈，色譜純；超純水；多壁碳納米管、N-丙基乙二胺、C18購(gòu)于上海安譜；黃曲霉毒素B1(AFB1)、嘔吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮購(gòu)于加拿大Toronto Research Chemicals(TRC)，磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星、金剛烷胺購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，三唑磷、多菌靈、甲草胺購(gòu)于天津環(huán)保，固標(biāo)均大于95%，液標(biāo)含量為1 000 mg·L-1；仔豬配合飼料。

Milli-QADVA10超純水儀；Waters UPLC/XEVO TQ MS；SIGMA 離心機(jī)；Mettler-Toledo 電子天平(XPE205、PL3002)；IKA控溫?fù)u床；Organomation 氮吹儀；IKA T25 digital勻漿機(jī)。

1.2 溶液配制

1.2.1 儲(chǔ)備和工作標(biāo)液配制

乙腈溶解適量AFB1、DON、玉米赤霉烯酮、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星等固標(biāo)，得到100 mg·L-1儲(chǔ)備液；三唑磷、多菌靈、甲草胺轉(zhuǎn)移并稀釋至乙腈相中，得到100 mg·L-1儲(chǔ)備液；乙腈配制5 mg·L-1工作液。

1.2.2 基質(zhì)標(biāo)液配制

按1.3節(jié)前處理，得到的空白樣液，將5 mg·L-1工作液稀釋至系列基質(zhì)標(biāo)液，隨配隨用。

1.2.3 提取溶液配制

按照體積比，將乙腈、水、甲酸混合配制成提取液：90∶9∶1、80∶19∶1、70∶29∶1等3種。

1.2.4 定溶液

按9∶1體積比，將0.1%甲酸水溶液、乙腈配制成定溶液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱飼料2.00 g于塑料離心管中，添加10.00 mL提取液，勻漿機(jī)10 000g勻漿1 min，搖床振蕩30 min，10 000g離心5 min。分取4.00 mL提取液到含40 mg多壁碳納米管的離心管，渦旋1 min后再10 000g離心5 min；移2.50 mL上清液在水浴40 ℃條件下氮吹近干，用1 mL定溶液溶解殘液，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中15 000g離心5 min，UPLC-MSMS測(cè)定。

1.4 液相色譜條件

柱子為Waters BEH C18，1.7 μm；樣品室20 ℃，柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。流動(dòng)相∶乙腈(A)和0.1%(V∶V)甲酸水溶液(B)；梯度洗脫：0～1.5 min，維持10%A；1.5～2.5 min，10%A線性變化至90%A；2.5～7.0 min，維持90%A；7.0～7.1 min，90%A線性變化至10%A；7.1～10 min，維持10%A。

1.5 質(zhì)譜條件

ESI源(正負(fù)同時(shí)掃描，MRM)，毛細(xì)管電壓2.5 KV/-2.0 KV，霧化氣1 000 L·h-1，錐孔氣50 L·h-1；源溫150 ℃；霧化溫度500 ℃。各化合物的質(zhì)譜條件如表1。

表1 MRM質(zhì)譜采集參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化

飼料含豐富的蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、含水量較低，9種藥物中恩諾沙星和金剛烷胺等含酸堿性基團(tuán)。所以有機(jī)相選用乙腈，以沉淀樣品中蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，水相選用加入適量甲酸的水溶液，以提高回收率。本文采用1.2.3節(jié)中列出的，乙腈、水、甲酸等按照不同體積配比配制出的3種提取液，對(duì)3大類9種藥物提取效果進(jìn)行考察。結(jié)果表明，3種提取液，對(duì)9種藥物的回收率均可達(dá)到75%～120%，考慮到樣品中藥物含量較低，為提高靈敏度便于濃縮，選擇體積比90∶9∶1為提取液。

2.1.2 凈化材料的選擇

飼料提取液中雜質(zhì)復(fù)雜，顏色深黃。為減少儀器基質(zhì)效應(yīng)，更好保護(hù)儀器，減少污染，篩選了N-丙基乙二胺、C18、多壁碳納米管等凈化材料。以2.1.1優(yōu)化得到的提取液空白，加入適量濃度9種藥物，用不同質(zhì)量的3種材料進(jìn)行凈化，篩選其凈化效果。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明，4.00 mL提取液3種凈化填料在適當(dāng)質(zhì)量下，回收率均控制在80%～120%，但是多壁碳納米管能更有效地去除色素，所以選為凈化材料，使用40 mg。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

文中比對(duì)了甲醇和乙腈作為有機(jī)相，純水和0.1%甲酸水溶液作為水相，共4組流動(dòng)相，并對(duì)梯度進(jìn)行了優(yōu)化。水相為純水時(shí)，恩諾沙星、金剛烷胺和磺胺間甲氧嘧啶等藥物峰形均較差，其他藥物均可得到滿意的靈敏度和峰型；但若水相加入0.1%甲酸時(shí)，9種藥物均得到滿意峰型和靈敏度，乙腈做流動(dòng)相時(shí)大多藥物靈敏度優(yōu)于甲醇，故選擇乙腈/0.1%甲酸水作流動(dòng)相。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配置成2 mg·L-1的9種藥物標(biāo)液，流動(dòng)相按照2.2節(jié)色譜條件優(yōu)化所得的流動(dòng)相。標(biāo)液通過(guò)儀器蠕動(dòng)泵泵入質(zhì)譜，電噴霧離子源(ESI)(正負(fù)同時(shí)掃描)得到母離子，玉米赤霉烯酮為ESI-，得到穩(wěn)定母離子[M-H]-；其他藥物為ESI+，得到穩(wěn)定母離子[M+H]+。確定母離子之后，再使用waters質(zhì)譜自帶的IntelliStart技術(shù)，自動(dòng)對(duì)9種藥物子離子及其參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到錐孔電壓、碰撞能力等，建立完整的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方法。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)

配合飼料富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，提取液雖經(jīng)過(guò)多壁碳納米管凈化，但剩余雜質(zhì)仍可能影響藥物靈敏度。文中為了評(píng)估樣液中雜質(zhì)對(duì)藥物靈敏度的影響，用流動(dòng)相起始比例溶液和基質(zhì)空白，分別配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度范圍為2～100 μg·L-1，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)；并計(jì)算得到2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比，見(jiàn)表2?；前烽g甲氧嘧啶、三唑磷、甲草胺、玉米赤霉烯酮為基質(zhì)增強(qiáng)，嘔吐毒素為基質(zhì)抑制，均超出斜率比0.8～1.2的閾值，樣液中含有雜質(zhì)對(duì)藥物靈敏度仍有較大影響，所以選擇基質(zhì)標(biāo)定量。

表2 溶劑標(biāo)液和基質(zhì)標(biāo)液的線性回歸方程和斜率比

2.4.2 定量限

由2.4.1節(jié)所做基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)曲線，可知9種藥物在線性范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系(r>0.99)。配合飼料以定量限進(jìn)行添加，計(jì)算均大于10倍信噪比，最終定量限在0.2～3.0 μg·kg-1。

2.4.3 回收率與精密度

對(duì)配合飼料進(jìn)行5、20、80 μg·kg-1添加回收試驗(yàn)，重復(fù)5次，提前6 h添加標(biāo)液。表3、圖1表明，9種藥物的回收率在74.7%～119.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.5%～12.0%。

表3 9種藥物的回收率、精密度及定量限

圖1 標(biāo)液MRM的色譜

3 小結(jié)

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，建立黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星、金剛烷胺、三唑磷、多菌靈、甲草胺等9種藥物同時(shí)提取、凈化、檢測(cè)的分析方法，該方法簡(jiǎn)單、快速、重現(xiàn)性好，可滿足配合飼料中9種藥物的快速定性定量分析。