呂燕

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040)

硝基呋喃類抗生素(nitrofuran antibiotics) 是人工合成的抗感染類藥物[1-3]，主要是指呋喃唑酮(furazolidone)、呋喃西林(nitrofurazone)、呋喃妥因(furantoin)和呋喃它酮(furaltadone)，及其對應(yīng)的代謝產(chǎn)物有呋喃唑酮(AOZ)、呋喃西林(SEM)、呋喃妥因(AHD)和呋喃它酮(AMOZ)。這類抗生素被廣泛用于家禽、家畜、水產(chǎn)、蜂等動(dòng)物傳染病的預(yù)防與治療，但有關(guān)研究證明[4-9]，硝基呋喃類藥物及其代謝物具有較強(qiáng)的毒副作用，可能誘導(dǎo)有機(jī)體基因突變，有致畸和誘發(fā)癌癥的可能，從而被人們高度重視。

如今，我國及大多數(shù)歐美國家都禁止使用該類藥物，為確保該藥物日常檢測結(jié)果的準(zhǔn)確，本文利用《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[10]和《測量不確定度評定與表示》[11]等相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，對用農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006[12]的方法進(jìn)行前處理并分析檢測過程中可能產(chǎn)生的不確定因素，評定最終檢測結(jié)果的不確定度[9,13-15]，以保證最終結(jié)果的準(zhǔn)確與可靠。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀、組織搗碎機(jī)、分析天平、渦旋振蕩器、氮吹儀、容量瓶、離心管、移液槍等。

試劑：甲醇、乙酸乙酯、乙酸銨等。除特殊說明外，其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

標(biāo)準(zhǔn)品：AOZ、AMOZ，SEM、AHD，純度均大于99%。同位素內(nèi)標(biāo)：AOZ-D4、AMOZ-D5，SCA-15N2-13C HCL、AHD-13C3，純度均大于99%。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：稱取AMOZ、AOZ、AHD和SEM標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解得到100 mg·L-1的AMOZ、AOZ、AHD和SEM標(biāo)準(zhǔn)儲備液。吸取1.0 mL AMOZ、AOZ、AHD和SEM標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇配制得到1.0 mg·L-1AMOZ、AOZ、AHD和SEM的混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液。再吸取0.1 mL 1.0 mg·L-1AMOZ、AOZ、AHD和SEM的混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋得到0.01 mg·L-1AMOZ、AOZ、AHD和SEM的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法一致。

1.2.2 樣品前處理方法

按照農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006《水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》的樣品處理方式進(jìn)行提取。

1.2.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱為C18，液相色譜流速及梯度洗脫程序見表1。采用正離子掃描方式，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，質(zhì)譜定性定量離子對信息見表2。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

表2 目標(biāo)化合物液質(zhì)測定條件

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006測定方法及結(jié)果計(jì)算公式，建立樣品中硝基呋喃類代謝物殘留量測定的數(shù)學(xué)模型如下：

X=RcV/Rsm。

(1)

式(1)中：X為檢測樣品中硝基呋喃類代謝物的含量，μg·kg-1；R為提取的樣品待測液中的目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比；c為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中硝基呋喃類代謝物的質(zhì)量濃度，ng·mL-1；V為提取的樣品待測液最終的定容體積，mL；Rs為標(biāo)準(zhǔn)液中的目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比；m為檢測樣品的質(zhì)量，g。

以上各種因素都會(huì)對測量結(jié)果的不確定度產(chǎn)生影響，其最終合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為：

(2)

式(2)中：urel(c)為合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度；urel(c0)為標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度；urel(cs)為標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度；urel(m)為樣品稱量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度；urel(V)為樣品前處理過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度；urel(frep)為重復(fù)測量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度；urel(R)為加標(biāo)回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.2 不確定度來源分析

從測定過程和數(shù)學(xué)模型分析，硝基呋喃類殘留測定的不確定度來源如圖1所示。

圖1 不確定度來源的因果關(guān)系

本次測定的不確定度主要來源于以下幾個(gè)方面：測量重復(fù)性引起的不確定度；曲線校準(zhǔn)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度；樣品前處理過程引入的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制過程中的不確定度；方法回收率引入的不確定度。

2.3 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的評定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c0)

本實(shí)驗(yàn)對4種硝基呋喃類代謝物，選取與硝基呋喃類代謝物相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)濃度比，制備了不同濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)濃度點(diǎn)校準(zhǔn)溶液平行測定3次，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度Ci為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積比Ai為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法擬合，獲得線性回歸方程(Y=a+bX)以及線性相關(guān)系數(shù)r，如表3所示。

表3 硝基呋喃類代謝物回歸方程測量結(jié)果

線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度公式如下：

(3)

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c0)結(jié)果見式(4)。

(4)

相對不確定度結(jié)果列于表4。

表4 相對不確定度

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(cs)

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的數(shù)學(xué)模型為：

(5)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表5。

表中：

(6)

根據(jù)以上計(jì)算的各分量及公式(5)可以計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(cs)：

2.3.3 樣品稱量過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

表6 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的不確定度

(7)

2.3.4 樣品前處理過程中引入的不確定度urel(V)

(8)

表7 樣品制備過程引入的不確定度

2.3.5 整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(frep)

整個(gè)實(shí)驗(yàn)包括樣品稱量操作的重復(fù)性和進(jìn)樣體積的重復(fù)性等。因此，將這些重復(fù)性分量合并為總試驗(yàn)的一個(gè)分量，利用方法確認(rèn)的數(shù)值將其量化是合理的。稱量的重復(fù)性屬A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度，以算數(shù)平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。按照1.2節(jié)方法進(jìn)行處理和上機(jī)測定，平行測定樣品6次，用貝塞爾公式(9)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表8。公式如下：

(9)

表8 重復(fù)測定結(jié)果及其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度(n=6)

2.3.6 加標(biāo)回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)

(10)

表9 加標(biāo)回收率結(jié)果和加標(biāo)實(shí)驗(yàn)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3.7 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c)及不確定度uc(X)

以上各項(xiàng)不確定度分量相對獨(dú)立，不考慮分量間的相關(guān)性，將上述各值代入公式(2)中，得出合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c)，再利用公式(11)來計(jì)算不確定度uc(X)，最終檢測結(jié)果取包含因子結(jié)果合成不確定度，結(jié)果如表10所示。

uc(X)=urel(c)·X。

(11)

表10 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度和不確定度

2.4 擴(kuò)展不確定度

取包含因子k=2(近似95%置信概率)，擴(kuò)展不確定度U=kUc(X)，則結(jié)果可報(bào)告為：X(AOZ)=1.161 6 μg·kg-1，U=0.150 μg·kg-1，k=2；X(AMOZ)=0.858 8 μg·kg-1，U=0.182 μg·kg-1，k=2；X(SEM)=1.027 5 μg·kg-1，U=0.200 μg·kg-1，k=2；X(AHD)=0.933 3 μg·kg-1，U=0.102 μg·kg-1，k=2。

3 小結(jié)與討論

本文按照農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006《水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》對硝基呋喃類藥物進(jìn)行檢測，通過建模、評定和計(jì)算測量整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的各個(gè)不確定度分量，得出最終擴(kuò)展不確定度。結(jié)果表明，硝基呋喃類代謝物殘留量測定的不確定度主要來自于標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制及使用、標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合、加標(biāo)回收率，其次為測量重復(fù)性和樣品稱樣量。因此，在日常檢測過程中，應(yīng)盡量選擇高精度器皿，并適當(dāng)增加測定次數(shù)，以最大限度降低整個(gè)檢測過程中可能帶來的不確定度影響，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，為正確評價(jià)和使用檢測數(shù)據(jù)提供依據(jù)。