余山紅，謝關(guān)林，嚴(yán)成其

(1.臺州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 臺州 317000；2.浙江大學(xué) 生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310029；3.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040)

水稻白葉枯病(bacterial leaf blight)和水稻細(xì)菌性條斑病(bacterial leaf streak，簡稱細(xì)條病)是目前嚴(yán)重威脅我國水稻生產(chǎn)的兩種重要細(xì)菌病害。白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，xoo)和細(xì)條病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，xooc)是水稻黃單胞菌屬下的2個(gè)致病變種，親緣關(guān)系極為接近。白葉枯病最早于1884年在日本岡縣發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在亞洲、非洲、美洲和澳大利亞等地均有發(fā)生，是許多國家的檢疫對象。該病在亞洲尤其在周年種植水稻的南亞和東南亞地區(qū)的危害最為嚴(yán)重，我國大部分地區(qū)均有發(fā)生，造成水稻減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重可達(dá)50%以上。細(xì)條病于1918年在菲律賓首先發(fā)現(xiàn)，目前在東南亞各國和非洲中部都有發(fā)生。在我國部分地區(qū)此病發(fā)生嚴(yán)重，常年發(fā)生面積在460萬hm2以上[1]，尤其在我國南方部分稻區(qū)危害已超過白葉枯病[2-4]。

因長期大量使用農(nóng)藥造成的自然生態(tài)環(huán)境污染及稻米農(nóng)藥殘留問題越來越突出[5]，尋求作物病害防治的新途徑一直是人們努力的目標(biāo)。拮抗細(xì)菌是一類重要的生物防治資源，在水稻病害的綜合防治中應(yīng)該發(fā)揮更大的作用[6]。然而，由于地域條件、栽培方式及病原菌特性等的不同，生防菌在不同地方對病害的防治效果往往很不一樣，因此，根據(jù)各地的自然條件因地制宜地篩選適合某一區(qū)域使用的菌株是生物防治的關(guān)鍵[7]。本研究從水稻根圍分離細(xì)菌，通過室內(nèi)拮抗菌篩選、溫室防病效果測定、水稻種子毒性及促生作用測定，以期篩選出有較好防病效果的生防細(xì)菌，為白葉枯病和細(xì)條病的生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

白葉枯病和細(xì)條病樣品均采自浙江臨海，以組織分離法分離，經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證后進(jìn)行鑒定，確認(rèn)為稻黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)和稻黃單胞菌稻生致病變種(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 樣品采集

從浙江臨海已經(jīng)混合發(fā)生白葉枯病和細(xì)條病的水稻田塊中，將發(fā)病植株連根拔起裝入樣品袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 培養(yǎng)基

水稻根圍細(xì)菌的分離以及對峙培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(NA)。配制病原菌和拮抗菌懸浮液使用的為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NB)。

細(xì)菌脂肪酸鑒定過程中培養(yǎng)待測菌使用的為胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基(TSBA)。

1.2 方法

1.2.1 水稻根圍細(xì)菌的分離

先抖掉水稻根圍松散的土粒，將根部切成0.2～0.7 cm的小段，混勻，然后稱取5 g混合樣品于無菌研缽中碾碎，用50 mL無菌水懸浮制成樣本母液。取母液l mL于裝有9 mL無菌水的試管中，依次稀釋成濃度梯度10-1～10-6的懸浮液，每個(gè)梯度分別取10 μL到NA平板上，用滅菌的涂布棒涂布均勻。放置20 min后將平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，挑取典型菌落進(jìn)行純化，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在校園內(nèi)，也可能存在車輛超速的問題，對于存在問題的車輛，就可以利用智能警告系統(tǒng)對其行文進(jìn)行警告，從而對車輛進(jìn)行及時(shí)的處理。如果出現(xiàn)沒能及時(shí)處理的情況，就可以給指定人員發(fā)送聲音、郵件和短信，通告交通管理人員及時(shí)進(jìn)行防范，避免引發(fā)事故[5]。該技術(shù)還可以和地圖結(jié)合起來，通過記錄車輛所經(jīng)過的攝像頭，從而對車輛進(jìn)行定位，并且能夠在地圖上還原車輛行駛的軌跡，并對車輛的位置進(jìn)行查詢，保證交通管理的精度。

1.2.2 生防細(xì)菌的篩選

當(dāng)三角瓶中的NA培養(yǎng)基融化后冷卻到45 ℃左右時(shí)，按體積比10∶1加入已在搖床NB培養(yǎng)基中振動培養(yǎng)72 h的病原菌懸浮液，搖勻，倒平板靜置4 h，在帶菌平板中央用接種環(huán)點(diǎn)接待測的細(xì)菌菌株。48 h后觀察并測量抑菌圈的直徑，挑選出同時(shí)對Xoo和Xooc抑菌能力最強(qiáng)的5個(gè)菌株。

1.2.3 溫室生防菌浸種防病試驗(yàn)

將培養(yǎng)48 h的5株生防菌分別用無菌水配成濃度約為1.0×108mL-1的菌懸液。將水稻種子放入菌懸液中浸種48 h，催芽24 h后溫室盆栽播種。以清水浸種作對照。待水稻幼苗生長至1心2葉期時(shí)飽和噴霧接種濃度約為1.0×108mL-1的病原菌菌懸液，薄膜覆蓋保濕24 h。接種14 d后統(tǒng)計(jì)白葉枯病和細(xì)條病的發(fā)生情況，記載發(fā)病率和病級，病情分級標(biāo)準(zhǔn)參照國家標(biāo)準(zhǔn)[8-10]進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 生防菌對水稻種子毒力和促生效果測定

將培養(yǎng)48 h的5株生防菌分別用無菌水配成濃度約為1.0×108mL-1的菌懸液。將水稻種子分別放入菌懸液中浸種48 h，催芽24 h后，播種于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，以清水浸種作為對照。7 d后統(tǒng)計(jì)各處理種子的發(fā)芽率，測量幼苗根長、苗長。

脂肪酸甲基酯鑒定(FAMEs)試驗(yàn)方法按美國MIDI公司的操作手冊進(jìn)行[11]，菌株在TSBA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)16～24 h，收集菌體40 mg，經(jīng)皂化、脂化、抽提和洗滌，獲得脂肪酸甲脂。脂肪酸鑒定采用美國Agilent 6890型氣相色譜及MIDI公司開發(fā)的全自動微生物鑒定系統(tǒng)MIS 4.5(microbial identification system)和LGS 4.5(1ibrary generation software)。

16S rDNA序列測定參照已發(fā)表的細(xì)菌16S rDNA基因的通用引物序列[12]。正向引物27F為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴(kuò)增反應(yīng)總體積為50 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)在PTC-200型熱循環(huán)儀上進(jìn)行，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測擴(kuò)增效果。PCR產(chǎn)物純化與測序工作委托北京六合華大基因科技股份有限公司完成，將測得的細(xì)菌16S rDNA序列登陸NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS軟件進(jìn)行分析[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防細(xì)菌篩選結(jié)果

從水稻根圍土壤共分離到細(xì)菌51株，經(jīng)過初篩后，獲得21株同時(shí)對Xoo和Xooc有拮抗能力的細(xì)菌，其中抑菌圈直徑小于20 mm的有16株，大于20 mm的有5株，根據(jù)菌落形態(tài)將其編號為A1、A2、B1、B2、C。

2.2 生防菌浸種對白葉枯病和細(xì)條病的防治效果

5個(gè)生防菌浸種處理對白葉枯病與細(xì)條病都有不同程度的預(yù)防效果(表1)，其中以菌株C和B2防效最為顯著，對白葉枯病的防效分別達(dá)到54.6%、49.9%，對細(xì)條病的防效分別達(dá)到57.4%、42.6%。

2.3 生防菌促生能力及毒力測定結(jié)果

對綜合拮抗能力最強(qiáng)的5個(gè)菌株進(jìn)行水稻種子毒力測定，并檢驗(yàn)是否具有促進(jìn)種子萌發(fā)的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個(gè)菌株對稻種的生活力影響各不相同。菌株A1抑制水稻幼苗生長，A2抑制種子發(fā)芽，B1同時(shí)促進(jìn)根和幼苗的生長，B2在促進(jìn)種子發(fā)芽的同時(shí)抑制根的生長，C能促進(jìn)根的生長(表2)。

表1 溫室生防菌對水稻白葉枯病與細(xì)條病的防治效果

表2 拮抗菌對稻苗生活力的影響

2.4 生防菌的鑒定

經(jīng)過對A1、A2、B1、B2、C 5種生防菌進(jìn)行FAMEs測定及16S rDNA序列比對，將其鑒定為2株洋蔥伯克氏菌(Burkholderiacenocepacia)、2株解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和1株惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)(表3)。

表3 待測菌的脂肪酸分析及16S rDNA鑒定結(jié)果

3 小結(jié)與討論

利用拮抗細(xì)菌生物防治植物病害是當(dāng)今植物病害十分活躍的研究課題，并已顯示出良好的應(yīng)用前景[14-15]，使用對病原菌有拮抗作用的細(xì)菌是一種既經(jīng)濟(jì)有效又無副作用的防治途徑[16]。而拮抗菌的篩選是一切生物防治的基礎(chǔ)，國內(nèi)篩選、利用拮抗菌進(jìn)行白葉枯病或細(xì)條病的生物防治已有大量研究，但篩選同時(shí)對兩種病原菌有抑制能力的生防菌還不多，已開發(fā)成能真正用于大田防治的生防菌劑更是少之又少。

目前，國內(nèi)正式登記用于防治水稻白葉枯病和細(xì)條病的生物活性制劑僅有3種，分別是德強(qiáng)生物股份有限公司生產(chǎn)的100億芽孢·g-1枯草芽孢桿菌可濕性粉劑(PD20140340)(用于防治白葉枯病)、陜西恒田生物農(nóng)業(yè)有限公司生產(chǎn)的80億芽孢·g-1甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6可濕性粉劑(PD20181621)(用于防治細(xì)條病)和江蘇省蘇科農(nóng)化股份有限公司研制出的60億芽孢·mL-1解淀粉芽孢桿菌LX-11懸浮劑(PD20190018)(在兩種病害上同時(shí)獲得登記)。

此外，楊俊譽(yù)等[17]發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、短狀桿菌屬(Brachybacterium)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)為感染白葉枯病水稻植株特有的內(nèi)生拮抗細(xì)菌屬，而節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)和考克斯菌屬(Kocuria)僅存在于健康植株中。高玲玲等[18]從云南水稻根部分離到NR-18和NR-79兩株多黏類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)NR-64。張芬等[19]從水稻根際土壤樣品中得到枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)T429、伯克氏菌屬(Burkholderia)。劉郵洲等[20]從稻田分離獲得枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。胡凌鳴等[21-23]從校園植物根際土壤中分離到淡紫灰鏈霉菌(Streptomyceslavendulae)S1-10和玫瑰輪絲鏈霉菌(Streptomycesroseoverticillatus)Sr-63。李生樟等[24-26]從蔬菜根際土壤中分離到蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)512、蟲媒假單胞菌(Pseudomonasentomophila)1257、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)504。鄒路路等[27]從校園內(nèi)健康孝順竹葉分離純化得到枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BME 17。朱潤杰[28]從作物根際土壤中分離得到變棕溶桿菌(Lysobacterbrunescens)OH23。張琪等[29-30]從腐爛的水果、發(fā)霉的食物、土壤、空氣等不同生境中篩選到灰黃青霉(Penicilliumgriseofulvum)Pg-35、皮落青霉(Penicilliumcrustosum)Pc-28和菌核曲霉(Aspergillussclerotiorum)As-75。陳思宇[31]從江蘇植物根圍土壤中分離出枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、海洋解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefacien)。潘潔莉[32]分別從土壤、空氣中采集到越南伯克氏菌(Burkholderiavietnamiensis)Ja2和假單胞菌(Pseudomonas)Dc3。黃夢桑等[33]從辣椒根際土壤中分離篩選到高地芽孢桿菌(Bacillusaltitudinis)181-7。以上分離出的菌株均同時(shí)對白葉枯病菌和細(xì)條病菌有抑菌能力。

本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)發(fā)病水稻植株根圍存在著大量能夠抑制白葉枯病菌和細(xì)條病菌生長的拮抗細(xì)菌，如洋蔥伯克氏菌(Burkholderiacenocepacia)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)等，而且部分細(xì)菌還具有促進(jìn)水稻種子萌發(fā)和根系及地上部生長的作用，具有很好的應(yīng)用前景。利用拮抗細(xì)菌進(jìn)行生物防治受植物、病原物、拮抗細(xì)菌和環(huán)境條件等多種因素的影響，特別是其他微生物的競爭作用，使拮抗細(xì)菌的種群數(shù)量發(fā)生較大變化[34-35]，因此，生防細(xì)菌的定殖能力對于病害的防治效果非常重要。而根圍細(xì)菌能夠在寄主植物周圍環(huán)境中很好定殖，不易受環(huán)境條件的影響，一般比外來拮抗菌具有更強(qiáng)的定殖能力，在病害的生物防治上更具有優(yōu)勢。由此可見，植物根圍是獲取生防菌的良好來源。本研究拓寬了水稻白葉枯病和細(xì)條病生防菌的分布范圍，為該病害的生物防治提供了重要資源。