梅儒齊， 鞠 倩， 李曰平， 劉誠聰

1 北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所重癥醫(yī)學(xué)科， 惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100142； 2 青島市中心醫(yī)院 胃腸外科， 山東 青島 266000

原發(fā)性肝癌是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，全球發(fā)病率不斷上升[1]。肝細(xì)胞癌(HCC)是肝臟最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，占所有原發(fā)性肝癌的70%～80%[1-2]。早期HCC可以通過肝切除術(shù)或肝移植治療，然而多數(shù)患者在診斷時(shí)已是晚期，已不適合行手術(shù)治療[3-5]。即使在根治性手術(shù)切除后，由于較高的復(fù)發(fā)率，肝癌患者的5年生存率仍然很低[6]。肝臟是一種“免疫特惠”器官，多種來自腸道的抗原匯集于門靜脈須經(jīng)肝臟代謝。為避免過度免疫反應(yīng)，肝臟中的免疫細(xì)胞不及其他組織器官活躍，且慢性病毒性肝炎使肝臟免疫系統(tǒng)處于耐受狀態(tài)。這為起源于肝臟的惡性腫瘤發(fā)生免疫逃逸提供了天然環(huán)境。因此，理論上HCC是免疫治療的優(yōu)勢腫瘤。近年來，PD-1/PD-L1單克隆抗體等免疫檢查點(diǎn)抑制劑 (immune checkpoint lnhibitor,ICI)治療HCC的臨床研究開展得如火如荼[7-8]，納武利尤單克隆抗體客觀有效率和總體生存時(shí)間分別為22.5%和28.6個(gè)月，優(yōu)于索拉非尼耐藥組[7]。因此，美國食品藥品監(jiān)督管理局優(yōu)先批準(zhǔn)納武利尤單克隆抗體為晚期HCC的二線治療藥物。而另外一項(xiàng)納武利尤單克隆抗體[8]和帕博利珠單克隆抗體[9]作為HCC一、二線治療的Ⅲ期臨床研究尚未達(dá)到主要終點(diǎn)。因此，在治療前確定患者對免疫治療的敏感性是很重要的。

人B淋巴細(xì)胞限制受體P2RY8是一種Gα13蛋白偶聯(lián)受體，由生發(fā)中心B淋巴細(xì)胞和濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞(Tfh)高度表達(dá)[10-11]。生發(fā)中心是抗體多樣化和親和力成熟的重要部位，也是B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤的常見來源，被限制在B淋巴細(xì)胞濾泡內(nèi)。含Gα13的異三聚體G蛋白通過P2RY8的下游信號傳導(dǎo)，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞向生發(fā)中心外遷移[12]。P2RY8通過耦聯(lián)Gα13抑制淋巴組織中B淋巴細(xì)胞遷移，同時(shí)調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞生長[10-12]。P2RY8在人淋巴細(xì)胞和其他一些免疫細(xì)胞類型中也有廣泛的表達(dá)，介導(dǎo)其在生發(fā)中心以外的功能。淋巴細(xì)胞中的Gα13激活A(yù)rhGEF1，從而激活Rho并抑制細(xì)胞向化學(xué)吸引劑的遷移[13]。

近年來，P2RY8在血液系統(tǒng)腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用得到了重視[14-15]，而在實(shí)體瘤尤其是HCC中的表達(dá)和臨床價(jià)值尚不清楚。 TCGA數(shù)據(jù)庫通(https://portal.gdc.com)過應(yīng)用高通量的基因組分析技術(shù)，創(chuàng)建一個(gè)較全面的癌癥基因組圖譜，從而提高對癌癥的預(yù)防、診斷和治療能力[16]。本實(shí)驗(yàn)利用TCGA數(shù)據(jù)庫，對HCC患者樣本P2RY8表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，結(jié)合免疫組化研究結(jié)果，進(jìn)一步探討P2RY8在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用，為HCC防治提供新的理論依據(jù)及潛在的生物靶點(diǎn)，以期讓更多患者受益。

1 材料與方法

1.1 P2RY8表達(dá)水平的比較 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載21種人類癌癥(包括424例HCC組織，50個(gè)HCC組織以及50個(gè)與其配對的相鄰正常肝組織)的P2RY8的RNA序列(P≤0.05，| log2FC |≥ 2)。使用R軟件包limma對標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行P2RY8差異表達(dá)分析。為進(jìn)一步明確P2RY8表達(dá)在肝癌患者中的分布是否具特異性，筆者收集來自于GEO數(shù)據(jù)庫中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)的數(shù)據(jù)集GSE58208(慢性乙型肝炎患者12例，健康對照者5例)，下載數(shù)據(jù)格式為MINiML。

1.2 P2RY8與腫瘤分期及預(yù)后的相關(guān)性分析 采用ggplot2包的R軟件進(jìn)行P2RY8表達(dá)與腫瘤分期(TNM分期、病理分期、組織學(xué)分級)的相關(guān)性分析。繪制Kaplan-Meier圖計(jì)算生存率，使用生存包進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)估計(jì)生存率差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用R軟件包(pROC、timeROC和survival包)建立診斷受試者工作特征(ROC)曲線、診斷時(shí)間依賴曲線和Nomogram模型分析。本節(jié)使用的臨床數(shù)據(jù)同樣取自TCGA數(shù)據(jù)庫。

1.3 P2RY8與HCC組織中免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析

采用TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析HCC中P2RY8表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤豐度及免疫細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性。此外，TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4、LAG3和PDCD1LG2是與免疫檢查點(diǎn)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本，提取這7個(gè)基因的表達(dá)值，使用TIMER和基于TCGA的ggplot2包的R軟件來評估HCC中P2RY8表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 對P2RY8進(jìn)行GO功能富集、KEGG通路富集和基因集富集分析 GO分析和KEGG分析使用STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)獲取HSPA4的PPI網(wǎng)絡(luò)信息。當(dāng)?shù)鞍紫嗷プ饔迷u分在0.9以上時(shí)，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從分子功能、生物學(xué)過程、細(xì)胞組分3個(gè)方面來進(jìn)行GO富集分析。通過對20個(gè)互作基因進(jìn)行GO富集和KEGG通路分析來探討P2RY8的生物學(xué)功能。

此外，應(yīng)用基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)來評估先前定義的一組基因在兩種生物狀態(tài)之間是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著且一致的差異。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫下載的數(shù)據(jù)，將腫瘤樣本分為P2RY8低表達(dá)組和高表達(dá)組。應(yīng)用R軟件集群Profiler(版本3.6.0)執(zhí)行GSEA，使用MSigDB Collections of c2(c2.all.v7.2.symbols.gmt)運(yùn)行。校正后P<0.05和q值(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率，F(xiàn)DR)<0.25可認(rèn)定為顯著富集。

1.5 臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證

1.5.1 研究對象 從2007年6月—2008年11月行肝癌根治性手術(shù)的64例HCC患者中獲取腫瘤組織及其中35例對應(yīng)的癌旁組織(組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司)，并統(tǒng)計(jì)其臨床資料及隨訪資料，臨床資料包括性別、年齡、AFP、TBil、Alb、ALT、GGT、HBV及HCV感染史、肝硬化與否、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、TNM分期等。隨訪截止時(shí)間為2016年2月。手術(shù)后至死亡或最后隨訪時(shí)間定義為總生存時(shí)間。隨訪資料包括1、3、5年生存率，無進(jìn)展生存期(PFS)，總生存時(shí)間(OS)等。

1.5.2 免疫組化染色及評分 組織標(biāo)本經(jīng)二甲苯和分級醇脫蠟后，在EDTA溶液中進(jìn)行熱誘導(dǎo)表位提取步驟。然后用1%的BSA封閉30 min，與抗P2RY8抗體(bs-12073R, 博奧森生物技術(shù)有限公司，北京)在4 °C孵育過夜，然后與hrp標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體在37 °C孵育30 min。使用3,30 -二氨基聯(lián)苯胺(DAB，中山金橋生物技術(shù)有限公司，北京)和蘇木紫染色檢測免疫反應(yīng)。染色結(jié)果判定：P2RY8陽性染色主要集中在細(xì)胞質(zhì)中。染色強(qiáng)度評分：無染色為0分，微弱染色(淡黃色)為1分，中等染色(棕黃色)為2分，強(qiáng)染色(棕褐色)為3分。陽性染色比例評分：陽性染色細(xì)胞占比0～5%計(jì)0分，6%～30%計(jì)1分，31%～50%計(jì)2分，51%～70%計(jì)3分，≥71%計(jì)4分。染色結(jié)果判定總分=染色強(qiáng)度分值×陽性染色比例分值?？偡譃?分計(jì)為陰性表達(dá)，1～2分為弱陽性表達(dá)，3～6分為中陽性表達(dá)，>6分為強(qiáng)陽性表達(dá)?？傇u分>3分定義為 P2RY8高表達(dá)組織，總評分≤3分定義為P2RY8低表達(dá)組織。

2 結(jié)果

2.1 P2RY8表達(dá)的泛癌分析 為了探索P2RY8在癌癥發(fā)生中的可能作用，首先分析了其在21種人類癌癥中的表達(dá)水平。如附錄1a所示，與正常組織相比，P2RY8在膽管癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、HCC這5種腫瘤類型中均顯著上調(diào)；在膀胱尿路上皮癌、結(jié)腸癌、腎嫌色細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肺鱗癌、直腸腺癌、子宮內(nèi)膜癌這7種腫瘤中均顯著下調(diào)；然而，P2RY8在乳腺浸潤癌、宮頸鱗癌和腺癌、食管癌、肺腺癌、胰腺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤、前列腺癌、胃癌、甲狀腺癌中無顯著差異。附錄1b和1c也分別表明了P2RY8在HCC中高表達(dá)。

此外，為了探索P2RY8在HCC中的表達(dá)是否具有特異性，筆者還分析了來自于GEO數(shù)據(jù)庫中12例慢性乙型肝炎患者與5例健康對照者中P2RY8表達(dá)的分布差異，結(jié)果顯示分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.44)。

2.2 P2RY8表達(dá)與腫瘤分期及腫瘤預(yù)后相關(guān)性 T分期、N分期、M分期、TNM分期在P2RY8高表達(dá)組與低表達(dá)組之間分布均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1a～d)。然而，Kaplan-Meier生存曲線顯示，P2RY8高表達(dá)的HCC患者預(yù)后較好，OS(P=0.005)、疾病特異性生存期(P=0.04)、無進(jìn)展間期(P=0.042)均提示高表達(dá)的患者獲得更加良好的預(yù)后(圖2a～c)。進(jìn)一步的單因素和多因素分析也表明P2RY8水平是HCC預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素(表1，圖2d)。

2.3 P2RY8表達(dá)在診斷和預(yù)測預(yù)后中的價(jià)值 從診斷方面的ROC曲線來看，通過分析P2RY8表達(dá)水平能夠準(zhǔn)確地從正常組織中鑒別腫瘤(AUC=0.794)(圖3a)。通過建立P2RY8的時(shí)間依賴生存ROC曲線來預(yù)測1、3、5年生存率(圖3b)。結(jié)合臨床病理因素(T、N、M分期)和P2RY8水平，建立Nomogram模型，預(yù)測臨床患者1、3、5年生存概率(圖3c)，均獲得了不錯(cuò)的效果。

圖1 P2RY8表達(dá)與HCC分期的關(guān)系

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中HCC的單因素和多因素生存分析Table 1 Univariate and multivariate survival analysis of hepatocellular carcinoma

注：a，診斷區(qū)分腫瘤與正常組織的ROC曲線；b，時(shí)間依賴生存ROC曲線分析預(yù)測1、3、5年生存率；c，Nomogram模型，結(jié)合臨床分期和P2RY8水平預(yù)測1、3、5年生存率。

2.4 P2RY8表達(dá)與HCC腫瘤免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性 Kaplan-Meier生存曲線顯示P2RY8高表達(dá)與更好的預(yù)后相關(guān)，接下來利用TCGA和TIMER數(shù)據(jù)庫探索P2RY8表達(dá)與HCC免疫細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)浸潤豐度之間的關(guān)系。使用R語言整體分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P2RY8表達(dá)水平與HCC組織中多種免疫細(xì)胞浸潤程度呈正相關(guān)(0

2.5 HCC中P2RY8表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)的關(guān)系 進(jìn)一步利用TIMER數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫分別檢測HCC組織中P2RY8表達(dá)與PD-1(附錄2a、c)和CTLA-4(附錄2b、d)表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果表明均呈正相關(guān)。TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4、LAG3和PDCD1LG2是與免疫檢查點(diǎn)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本[17]，提取這7個(gè)基因的表達(dá)值，觀察免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因的表達(dá)情況。P2RY8與各免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)水平在HCC中呈顯著正相關(guān)(附錄2e)。此外，通過泛癌分析發(fā)現(xiàn)，在除腎上腺皮質(zhì)癌及葡萄膜黑色素瘤之外的其他各個(gè)腫瘤中，P2RY8表達(dá)水平與多種免疫細(xì)胞浸潤程度呈明顯相關(guān)(附錄2f)。

圖4 HCC中P2RY8與免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)性的棒棒糖圖Figure 4 Correlations between P2RY8 expression levelsand immune cell infiltration in hepatocellular carcinoma

2.6 HCC中P2RY8表達(dá)與ICI治療的關(guān)系 基于表達(dá)譜數(shù)據(jù)，利用腫瘤免疫功能障礙與排除(TIDE)算法預(yù)測單個(gè)樣本或者某亞型對預(yù)測ICI響應(yīng)性[18]。TIDE使用一組基因表達(dá)標(biāo)記來評估2種不同的腫瘤免疫逃逸機(jī)制，包括腫瘤浸潤細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的功能障礙和免疫抑制因子對細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的排斥。結(jié)果顯示，P2RY8低表達(dá)者TIDE評分低，ICI治療效果好，接受ICI治療后將獲得更長的生存期(圖5)。

2.7 HCC中P2RY8相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)的建立 為了進(jìn)一步了解HCC患者中與P2RY8表達(dá)相關(guān)的可能相關(guān)基因，筆者查找了與P2RY8呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的前20個(gè)基因?；赟TRING構(gòu)建了這些基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)(附錄3a)。接下來進(jìn)行GO和KEGG富集分析，了解P2RY8在HCC中潛在的生物學(xué)功能。GO分析顯示，P2RY8在主要的生物過程(循環(huán)免疫球蛋白介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，補(bǔ)體激活，T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫)、細(xì)胞組分(免疫球蛋白復(fù)合物、T淋巴細(xì)胞受體復(fù)合物)和分子功能(抗原結(jié)合、免疫球蛋白受體結(jié)合)均有不同程度的富集(附錄3b、d)。KEGG通路分析表明，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，原發(fā)性免疫缺陷通路明顯富集于P2RY8共表達(dá)基因(附錄3b、c)。此外，進(jìn)行GSEA以基于游離富集評分(NES)和FDR(假發(fā)現(xiàn)率)q值，闡明P2RY8在P2RY8高表達(dá)組與低表達(dá)組之間可能調(diào)節(jié)的生物學(xué)途徑。如附錄3d所示，P2RY8高表達(dá)組在受體相互作用通路、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)通路等幾種信號通路顯著富集。

表2 HCC中P2RY8表達(dá)與免疫細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of P2RY8 expression andimmune cell markers in hepatocellular carcinoma

圖5 預(yù)測P2RY8高表達(dá)組與低表達(dá)組間免疫反應(yīng)得分的分布情況

2.8 64例HCC患者的臨床資料特征、P2RY8的表達(dá)水平及預(yù)后 在64例HCC組織中，24例P2RY8呈強(qiáng)陽性表達(dá)，22例呈中陽性表達(dá)，12例呈弱陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為90.6%；對應(yīng)的35例癌旁組織中，26例呈強(qiáng)陽性表達(dá)，4例呈中陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為85.7%。與癌旁組織相比，HCC組織中P2RY8陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織(χ2=7.352，P=0.007)(圖6)。

本研究同時(shí)分析了P2RY8表達(dá)水平與各項(xiàng)臨床數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。如表3所示，將64例HCC患者根據(jù)P2RY8表達(dá)水平分為高低兩組，其中年齡、性別、AFP、AST、GGT、TBil、Alb及腫瘤數(shù)目組間分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均>0.05)；而P2RY8高表達(dá)的HCC患者腫瘤最大直徑相對較小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。同樣發(fā)現(xiàn)兩組患者的腫瘤TNM分期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與之前生信分析中的結(jié)論相符。

針對預(yù)后，從1、3、5年生存率、PFS及OS 5個(gè)層面分析與P2RY8表達(dá)水平之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，P2RY8高表達(dá)的肝癌患者術(shù)后3、5年生存率和OS顯著高于低表達(dá)者(P值均<0.05)；而1年生存率及PFS也存在相應(yīng)趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。這可能與研究樣本量較少有關(guān)。

Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，P2RY8高表達(dá)的HCC患者總生存期明顯高于低表達(dá)者(P=0.004)(圖7)。本研究結(jié)果有效驗(yàn)證了之前的結(jié)論，即通過檢測P2RY8表達(dá)水平可預(yù)測HCC患者術(shù)后的預(yù)后狀況。

注：a，陰性表達(dá)；b，弱陽性表達(dá)；c，中陽性表達(dá)；d，強(qiáng)陽性表達(dá)。

圖7 64例HCC患者P2RY8表達(dá)水平與術(shù)后總生存期的Kaplan-Meier生存曲線分析

3 討論

HCC由于其隱匿性及侵襲性，在早期診斷及治療方面頗為棘手。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，P2RY8在HCC中與正常肝組織相比呈高表達(dá)。HCC組織中P2RY8表達(dá)水平與TNM分期無明顯相關(guān)，而進(jìn)一步的生存和預(yù)后分析中P2RY8高表達(dá)的HCC患者遠(yuǎn)期生存率顯著提高，是良好預(yù)后的獨(dú)立影響因素。通過P2RY8表達(dá)水平能夠很好地區(qū)分腫瘤和正常組織，預(yù)測1、3、5年生存率，提示P2RY8可能是一種潛在有價(jià)值的HCC早期診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。筆者進(jìn)一步的臨床數(shù)據(jù)分析也驗(yàn)證了這一想法。

腫瘤免疫在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)歸中起著至關(guān)重要的作用，以其作為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療是近年來抗腫瘤治療的新興中堅(jiān)力量[17-18]。免疫檢查點(diǎn)，包括刺激和抑制檢查點(diǎn)分子，作為免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在自體耐受和細(xì)胞免疫中的作用不容小覷。因此，為了探索P2RY8與HCC良好預(yù)后相關(guān)性的可能原因，本研究從免疫細(xì)胞浸潤及免疫檢查點(diǎn)方面入手，分析結(jié)果表明在HCC中，P2RY8表達(dá)水平與絕大多數(shù)免疫細(xì)胞浸潤程度呈正相關(guān)，而7個(gè)免疫檢查點(diǎn)也均與P2RY8表達(dá)水平呈正相關(guān)。進(jìn)一步泛癌分析發(fā)現(xiàn)，P2RY8表達(dá)在多種類型腫瘤組織中與免疫細(xì)胞浸潤程度均呈正相關(guān)。這提示P2RY8可能通過調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞群來調(diào)控HCC免疫。行TIDE評分顯示P2RY8低表達(dá)者TIDE評分低，提示P2RY8低表達(dá)者在接受ICI治療之后便可獲得較好的療效，從而獲得更大的生存獲益。

表3 64例HCC患者中P2RY8表達(dá)水平與臨床特征及預(yù)后之間的關(guān)系Table 3 The relationship between P2RY8 expression level and clinical characteristics and outcomes in 64 HCC patients

此外，GO/KEGG分析結(jié)果提示P2RY8與循環(huán)免疫球蛋白介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫相關(guān)，進(jìn)一步GSEA分析發(fā)現(xiàn)P2RY8與受體相互作用通路顯著富集，與筆者前面的生信研究結(jié)論相符。HCC組織中P2RY8表達(dá)水平上升，通過誘導(dǎo)免疫細(xì)胞浸潤，從而達(dá)到抗腫瘤效果。這可能是P2RY8高表達(dá)的HCC患者預(yù)后較好的原因之一。

He等[19]研究表明P2RY8的表達(dá)下調(diào)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病有關(guān)。之前有研究[19-20]發(fā)現(xiàn)P2RY8的表達(dá)減少了小鼠模型中DNA反應(yīng)性濾泡B淋巴細(xì)胞的積累，說明P2RY8可能對這種耐受檢查點(diǎn)很重要。另一方面，P2RY8發(fā)生突變的B淋巴細(xì)胞可在抗體反應(yīng)的各個(gè)階段中發(fā)生去調(diào)節(jié)遷移，從而提高了自身免疫性疾病的發(fā)病率[21-22]。本研究結(jié)果也同樣證明P2RY8廣泛參與了免疫反應(yīng)的各個(gè)階段，至于是如何通過調(diào)節(jié)免疫影響腫瘤臨床結(jié)果，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)室探索和臨床研究來驗(yàn)證。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)方法驗(yàn)證了P2RY8在HCC診斷和預(yù)后判斷中的價(jià)值，并結(jié)合臨床樣本進(jìn)一步驗(yàn)證，使得結(jié)論更具有說服力。本研究發(fā)現(xiàn)，P2RY8可能不僅參與HCC的發(fā)生、發(fā)展，還參與了HCC的免疫調(diào)節(jié)。因此，P2RY8可以作為一種潛在的HCC診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。P2RY8功能的預(yù)測為進(jìn)一步研究HCC的發(fā)病機(jī)制以及P2RY8在HCC免疫治療中的作用提供了新的思路。未來需要進(jìn)一步的相關(guān)機(jī)制研究來驗(yàn)證筆者的發(fā)現(xiàn)并促進(jìn)其臨床應(yīng)用。

同時(shí)，本研究存在一些局限性。首先，從公共數(shù)據(jù)庫檢索出的生信分析數(shù)據(jù)及用作驗(yàn)證的臨床樣本均為回顧性研究，未來需要進(jìn)一步前瞻性研究來證實(shí)。其次，本研究用于外部驗(yàn)證的臨床樣本量偏少。此外，盡管在不同的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了P2RY8與免疫細(xì)胞浸潤密切相關(guān)，具體機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步的機(jī)制研究來探索。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2017年1月6日經(jīng)由上海芯超生物科技有限公司倫理委員會(huì)審批，批號：SHYJS-CP-1701002，所納入患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：梅儒齊負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；梅儒齊、鞠倩、李曰平參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；劉誠聰負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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