楊德新，徐崢嶸,王新莊，閆 磊，朱小潔，薛永康，劉曉曼，張 震*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450002；2.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,甘肅蘭州 730046；3.河南省奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定中心，河南鄭州 450046；4.河南省奶牛健康養(yǎng)殖國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450046；5.河南省種牛遺傳性能測(cè)定中心，河南鄭州 450046；6.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070)

牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的一種接觸性傳染病，在全球的奶牛業(yè)和肉牛業(yè)都造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。BVDV感染后呈多種臨床表現(xiàn)類型，以體溫升高，食欲減少、口腔黏膜爛斑、腹瀉和發(fā)育異常為主。病毒引起的急性疾病稱為牛病毒性腹瀉,引起的慢性持續(xù)性感染稱為黏膜病[2]。BVDV是20世紀(jì)80年代該病傳入我國(guó)[3]，隨著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，牛群感染BVDV的情況日益嚴(yán)重[4]。根據(jù)其抗原性的不同和5′-UTR的高度保守性，BVDV主要分為BVDV-1型和BVDV-2型兩種。BVDV-3型在牛和水牛中被確認(rèn)[5]，但我國(guó)無(wú)BVDV-3型感染牛的相關(guān)報(bào)道。BVDV-1型可進(jìn)一步分為1a-1u亞型，BVDV-2型可進(jìn)一步分為2a-2d亞型[6-8]。我國(guó)已分離和檢測(cè)到許多BVDV-1亞型，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)BVDV-1b和BVDV-1 m為主要的亞型[9-10]。采取ELISA方法對(duì)河南省規(guī)模化牛場(chǎng)進(jìn)行BVDV抗原檢測(cè)，并用RT-PCR方法進(jìn)行BVDV基因分型鑒定，以期掌握河南省規(guī)?；?chǎng)BVDV的流行情況和基因型，為該病防控和疫苗研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 血樣 采集河南省14個(gè)市40個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)5 486份血樣，采集后靜置2 h，離心、分離血清，置-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑與儀器 牛病毒性腹瀉抗原檢測(cè)試劑盒，西班牙英吉納(INGENASA)公司產(chǎn)品；異丙醇，天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；2×PCR Mix、ddH2O，廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)品；M5 First Strand cDNA合成試劑盒、Trizol試劑，北京聚合美生物科技有限公司產(chǎn)品；普通PCR儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物 參照文獻(xiàn)[11-12]中引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，用于擴(kuò)增5′-UTR來(lái)進(jìn)行BVDV分子基因型鑒定。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 引物序列、位置

1.2 方法

1.2.1 BVDV的抗原檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作方法與判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2.2 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 取血清200 μL，加入400 μL Trizol振蕩混勻，室溫放置8 min。加入160 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置5 min，4℃、12 000 r/min離心10 min。將上清液移入1.5 mL離心管內(nèi)，加入等體積的異丙醇，室溫放置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清。沉淀用20 μL 750 mL/L乙醇沖洗后4℃、5 000 r/min離心5 min，吸棄乙醇，超凈臺(tái)上開(kāi)蓋干燥5 min～10 min。用10 μL DEPC水溶解，置-80℃凍存?zhèn)溆没蛑苯佑梅崔D(zhuǎn)錄。利用M5 First Strand cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并置于-20℃待用。

1.2.3 BVDV-1的RT-PCR擴(kuò)增與檢測(cè) 用外套引物BVDV-1F/BVDV-1R與內(nèi)套引物BVDV-1Fn/BVDV-1Rn進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增BVDV-1 5′-UTR基因。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系如下:cDNA模板1 μL，2×PCRTaqmix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，外套引物(上游、下游引物，10 μmol/L)各0.5 μL。外套PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。反應(yīng)完成后取1 μL產(chǎn)物進(jìn)行內(nèi)套PCR反應(yīng)，其中外套引物PCR產(chǎn)物1 μL，2×PCRTaqmix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，內(nèi)套引物(上游、下游引物，10 μmol/L)各0.5 μL。內(nèi)套PCR反應(yīng)條件為：94℃ 10 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠核酸電泳和凝膠成像掃描儀進(jìn)行檢測(cè)與分析，產(chǎn)物送由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.4 BVDV-2 5′-UTR的擴(kuò)增 將BVDV-1 5′-UTR擴(kuò)增陰性樣品使用外套引物BVDV-F1/BVDV-R1與內(nèi)套引物BVDV P3/BVDV P4進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增BVDV-2 5′-UTR基因，反應(yīng)體系為：cDNA模板1 μL，2×PCRTaqmix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，外套引物(上游、下游引物，10 μmol/L)各0.5 μL。外套PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)完成后取1 μL產(chǎn)物進(jìn)行內(nèi)套PCR反應(yīng)，其中，外套PCR產(chǎn)物1 μL，2×PCRTaqmix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，內(nèi)套引物(上游、下游引物，10 μmol/L)各0.5 μL。內(nèi)套PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；95℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠核酸電泳和凝膠成像掃描儀進(jìn)行檢測(cè)與分析，產(chǎn)物送由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.5 5′-UTR序列分析 應(yīng)用DNAStar軟件將測(cè)序樣本的序列與GenBank中已公布的BVDV參考序列進(jìn)行多序列比較，使用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

檢測(cè)牛病毒性腹瀉抗原共5 486份，陽(yáng)性率為1.77%(97/5486)。A10奶牛場(chǎng)，BVDV抗原陽(yáng)性率最高，為7.8%(11/141)，A11、A17奶牛場(chǎng)BVDV抗原陽(yáng)性率最低，為0.66 %(1/151)。40家規(guī)?；膛?chǎng)共檢測(cè)到35家奶牛場(chǎng)有牛病毒性腹瀉，場(chǎng)陽(yáng)性率為87.5%(35/40)(表2)。在駐馬店地區(qū)，BVDV抗原陽(yáng)性率最高，為6.18%(18/291)；在鶴壁地區(qū)，BVDV抗原陽(yáng)性率為0(0/102)(表3)。造成這種地區(qū)陽(yáng)性差異的因素可能是氣候、濕度、溫度的不同。

表2 河南省不同奶牛場(chǎng)BVDV血清抗原檢測(cè)結(jié)果

表3 河南省不同地區(qū)BVDV血清抗原檢測(cè)結(jié)果

將97份ELISA檢測(cè)BVDV抗原陽(yáng)性的樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，隨機(jī)選擇RT-PCR呈陽(yáng)性的樣本11份進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序所得序列與GenBank中公布的8株BVDV進(jìn)行同源性比較，根據(jù)5′-UTR基因測(cè)序所得11株測(cè)序株之間的同源性為84.0%～100%，參考株之間的同源性為82.7%～100%(表4、圖1)。

圖1 BVDV核苷酸序列同源性分析

表4 不同測(cè)序株名稱及GenBank登錄號(hào)

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，樣本PY8 (MZ063763)與BVDV-1 strain ZM-95 (AF526381.3)有密切關(guān)系，XY1033 (MZ063760)與BVDV-1 isolate SD0803 (JN400273.1)具有密切關(guān)系。陽(yáng)性株BF55起源要早于其他的陽(yáng)性株，而其他陽(yáng)性株處于一個(gè)大的進(jìn)化分支中，且都是由共同的祖先BF55發(fā)育而來(lái)。BF55 (MZ063761)與參考株BVDV-1 strain ZM-95 (AF526381.3)和BVDV-1 isolate SD0803 (JN400273.1)親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)(圖2)。結(jié)果說(shuō)明河南地區(qū)牛病毒性腹瀉病毒與其他參考株由共同的祖先進(jìn)化而來(lái)，并且與參考株之間存在一定的變異。

圖2 基于5′-UTR序列的11株測(cè)序株的系統(tǒng)發(fā)育分析

3 討論

BVDV是導(dǎo)致奶牛腹瀉的重要病原，感染BVDV后可以導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降，嚴(yán)重影響奶牛場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)調(diào)查該病在我國(guó)大部分地區(qū)存在[13-15]。本研究中，河南省14個(gè)市BVDV的陽(yáng)性率為1.77%，與調(diào)查結(jié)果相符合。此次調(diào)查40個(gè)奶牛場(chǎng)中，BVDV的場(chǎng)陽(yáng)性率為87.5%，本研究與報(bào)道中的場(chǎng)陽(yáng)性率也相符合。BVDV可在妊娠奶牛40 d～120 d傳遞給胎兒，并誘導(dǎo)胎兒對(duì)BVDV免疫耐受，導(dǎo)致持續(xù)性感染(PI)牛的分娩，PI牛一生都在排毒，是傳染源。因此，檢測(cè)和消除PI牛對(duì)預(yù)防和控制牛群病毒性腹瀉具有重要意義。

BVDV-1型能引起一次性的臨床癥狀，而B(niǎo)VDV-2型所引起的臨床癥狀比BVDV-1型嚴(yán)重，病死率更高。本研究發(fā)現(xiàn)在河南地區(qū)流行的BVDV均為BVDV-1型，病死率也較低，但河南地區(qū)牛病毒性腹瀉病毒與參考株相比存在一定的變異。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上看出除了陽(yáng)性株BF55外，其他陽(yáng)性株都是從BVDV-1b參考株發(fā)育而來(lái)，這也和我國(guó)主要流行株為BVDV-1b和BVDV-1m相符合。雖然在河南地區(qū)BVDV的陽(yáng)性率較低，也無(wú)死亡率較高的BVDV-2型，但對(duì)于BVDV的防控還是要重視，奶牛BVDV的綜合防控應(yīng)采取以疫苗接種為主，加強(qiáng)流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，根據(jù)流行病學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果逐步撲殺、淘汰陽(yáng)性感染牛，早日實(shí)現(xiàn)牛群中BVDV的凈化[16]。