劉奕伶，唐麗輝，趙文星，王 輝，郭梓豫，吳可欣，張云昊，莫重輝，趙寶玉，路 浩*

(1.西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；2.青海大學農牧學院，青海西寧 810016)

烏頭(Aconitum)為毛茛科多年生草本植物，該屬植物大部分塊根內含有劇毒烏頭堿，因此被列為有毒植物[1]。近年來我國牧區(qū)烏頭等毒草大量滋生，家畜誤食后中毒，對畜牧業(yè)發(fā)展造成極大危害[2-3]。烏頭屬有毒植物中含有多種毒性成分，主要為二萜類生物堿，常見的有烏頭堿(aconitine)、中烏頭堿(mesaconitine)、次烏頭堿(hypaconitine)、異烏頭堿(isoaconitine)等，其中烏頭堿毒性最強[4]。動物中毒后臨床表現(xiàn)為流涎、嘔吐、腹痛、瞳孔散大、呼吸困難、運動中樞和感覺麻痹等[5]。

烏頭堿的研究主要集中在藥理作用方面，如強心[6]、抗炎[7]、抗腫瘤[8]、抗衰老及抗病毒[9]等，對其毒理研究較少。烏頭堿的毒性主要是影響心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉組織[10]。通過與生物膜上的脂質或蛋白質反應，刺激細胞促凋亡基因的表達增加，誘導動物組織細胞凋亡[11]。其在心肌細胞中促凋亡有劑量依賴性，通過p38/MAPK信號通路引起大鼠心律失常[12]，通過線粒體、內質網(wǎng)通路等誘導細胞凋亡[13]。本研究以小鼠海馬神經(jīng)細胞(HT22)為研究對象，探討烏頭堿體外對HT22細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 HT22細胞，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院(BNCC)提供。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清(FBS)和DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司產品；胰蛋白酶和青鏈霉素，Hyclone公司產品；Annexin V-FITC/PI和Hoechst 33258，Solarbio公司產品；烏頭堿(純度98.36%)，成都曼思特生物科技有限公司產品。

1.1.3 主要儀器設備 電子天平PTI-FA110，福州華志科學儀器有限公司；79-2雙向磁力加熱攪拌器、PHS-3E型酸度計和三用水箱，北京科偉公司；YI-CJ-IN型超凈工作臺，北京亞泰科隆公司；CKX31型倒置顯微鏡，日本Olympus公司；EPOCH酶標儀，美國BioTek公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher Scientific公司；Axio Observer倒置熒光顯微鏡，德國Zeiss公司；BD-FACSAria型流式細胞儀，美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠海馬神經(jīng)細胞復蘇與培養(yǎng) 凍存的HT22細胞于37℃水浴解凍，用DMEM完全培養(yǎng)基于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞鋪滿培養(yǎng)皿底部80%時傳代并進行細胞計數(shù)。

1.2.2 小鼠海馬神經(jīng)細胞存活率測定 取對數(shù)生長期細胞，按常規(guī)方法制成細胞懸液，以1.5×103個/孔均勻接種至96孔板中，設不加細胞的調零孔，置于37℃、體積分數(shù)為5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期，用烏頭堿分別處理HT22細胞6 h和12 h。試驗分陰性對照組為HT22細胞、培養(yǎng)液、無藥物；處理組為HT22細胞、培養(yǎng)液、烏頭堿(0、50、100、200 μg/mL)。按照MTT試劑盒說明檢測細胞存活率(將含有烏頭堿的培養(yǎng)液吸棄，每孔加入含5 g/L的MTT培養(yǎng)液，4 h后將培養(yǎng)液吸棄，每孔加入100 μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min后用酶標儀OD490 nm測吸光度值)，細胞存活率=(處理組OD值-調零孔OD值)/(陰性對照組OD值-調零孔OD值)×100%。

1.2.3 小鼠海馬神經(jīng)細胞核熒光染色 取對數(shù)生長期的細胞，按常規(guī)方法制成細胞懸液，4.5×104個/孔均勻接種至6孔板中，設不加細胞的調零孔，置于37℃、體積分數(shù)為5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期，用烏頭堿分別處理HT22細胞6 h、12 h。試驗分組同1.2.2，按照Hoechst 33258試劑盒說明對細胞核染色(將含有烏頭堿的培養(yǎng)液吸棄，加入Hoechst固定液0.5 mL，37℃孵育20 min后吸棄，PBS緩慢振蕩漂洗3次，加入Hoechst 33258染色液0.5 mL，繼續(xù)孵育5 min后吸棄)，用熒光顯微鏡對HT22細胞進行凋亡形態(tài)學檢測。

1.2.4 小鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率測定 取對數(shù)生長期細胞，按常規(guī)法制成細胞懸液，以1.0×105個/皿的細胞密度均勻接種至60 mm細胞培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期，用烏頭堿分別處理HT22細胞6 h、12 h。試驗分組同1.2.2，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明對細胞進行染色(收集細胞，PBS洗滌后重懸，使細胞密度達1×106個/mL，每管加入100 μL細胞和5 μL Annexin V-FITC，室溫避光，輕輕振蕩10 min，加入5 μL PI，室溫避光孵育5min，加入PBS至500μL，輕輕混勻)，用流式細胞儀檢測HT22細胞凋亡率。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，P<0.05差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 結果

2.1 烏頭堿對小鼠海馬神經(jīng)細胞存活率影響

不同濃度烏頭堿處理HT22細胞6 h、12 h，MTT法檢測細胞存活率，烏頭堿抑制細胞生長有時間-劑量依賴性。與對照組相比，50 μg/mL烏頭堿作用6 h對細胞存活率無影響，其余劑量和作用時間細胞存活率均極顯著降低(P<0.01)(圖1)。

與各自空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01 *P<0.05,**P<0.01,compared to the control group

2.2 烏頭堿對小鼠海馬神經(jīng)細胞核的影響

不同濃度烏頭堿的細胞染色后，熒光顯微鏡可見對照組細胞核為藍色，圓形或卵圓形，呈彌散均勻熒光；試驗組細胞核有不同程度的致密濃染，部分呈顆粒狀、碎塊狀、邊集呈新月形(圖2)。

A.6 h，0 μg/mL；B.6 h，50 μg/mL；C.6 h，100 μg/mL；D.6 h，200 μg/mL；E.12 h，0 μg/mL；F.12 h，50 μg/mL；G.12 h，100 μg/mL；H.12 h，200 μg/mL

2.3 烏頭堿對小鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率的影響

圖3中左下象限Q4代表正?；罴毎珹nnexin V-FITC-/PI-；右下象限Q3代表早期凋亡細胞，Annexin V-FITC+/PI-；右上象限Q2代表壞死細胞或晚期凋亡細胞，Annexin V-FITC+/PI+；左上象限Q1代表細胞收集過程中出現(xiàn)的損傷細胞，V-FITC-/PI+。從圖3可以看出，用不同濃度(0、50、100、200 μg/mL)烏頭堿處理HT22細胞6 h或12 h后，在相同時間下，不同濃度烏頭堿處理組的正常細胞比例明顯下降，凋亡細胞比例顯著上升(P<0.05)；隨烏頭堿濃度的增加，凋亡的HT22細胞顯著增加，呈現(xiàn)明顯劑量-效應關系(圖4)。

A.6 h，0 μg/mL；B.6 h，50 μg/mL；C.6 h，100 μg/mL；D.6 h，200 μg/mL；E.12 h，0 μg/mL；F.12 h，50 μg/mL；G.12 h，100 μg/mL；H.12 h，200 μg/mL

與各自空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01 *P<0.05,**P<0.01,compared to the control group

3 討論

烏頭堿可使中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)先興奮后麻痹，影響細胞內離子和神經(jīng)遞質的濃度，阻止沖動的發(fā)生和傳導，從而損害細胞形態(tài)和功能[14]，造成呼吸困難、全身麻木、意識模糊、反應遲鈍、陣發(fā)性抽搐等癥狀[15]。烏頭堿作用于心肌細胞，使心室內異位起博點的興奮性增高和產生折返激動，形成單源或多源多形室性早搏、室性心動過速、心室顫動等[11,16]。 烏頭堿也可引起細胞凋亡[17]。用烏頭堿給大鼠灌胃后，大鼠心肌細胞、肝細胞、腎小管上皮細胞等均發(fā)生凋亡；細胞凋亡的典型變化包括細胞皺縮，DNA片段化，染色質高度濃縮，細胞核內縮、碎裂、形成新月形，細胞膜內陷和線粒體分解等[18]。Annexin V/PI雙染法可用于檢測凋亡的細胞，Annexin V是Ca2+依賴性的磷脂結合蛋白，能夠與細胞凋亡時外翻至細胞膜外的磷脂酰絲氨酸(PS)結合，Annexin V標記上FITC，可用熒光顯微鏡進行觀察；PI是一種依賴膜通透性的染料分子，通過FITC和PI的聯(lián)合使用，可有效檢測細胞凋亡的發(fā)生。

本研究用DNA特異性染料Hoechst 33258對HT22細胞進行染色，熒光顯微鏡觀察HT22細胞核的形態(tài)學變化，結果顯示各處理組細胞核均有不同程度的致密濃染，核固縮、核碎裂、部分呈顆粒狀、碎塊狀、邊集呈新月形等凋亡細胞特征，不同濃度烏頭堿可引起HT22細胞發(fā)生凋亡。用Annexin V/PI處理HT22細胞不同時間后，用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，烏頭堿致HT22細胞凋亡呈明顯劑量-效應關系，隨著處理時間的延長，HT22細胞的凋亡率呈下降趨勢。烏頭堿可通過清除線粒體活性氧達到保護細胞的目的[13]，可能是烏頭堿致HT22細胞損傷過程中觸發(fā)了某種機制，如自噬、氧化應激等，對細胞凋亡起到拮抗作用，逆轉了部分凋亡[19]。

烏頭堿可以引起HT22細胞凋亡，在HT22細胞凋亡中是否有自噬、壞死等及烏頭堿引起HT22細胞凋亡的信號轉導通路還有待進一步研究。