肖 敏，劉 建*，盧 昌，任 華，溫樹樺，曹華斌，王承寶，王 闖

(1.江西正邦養(yǎng)殖有限公司，江西南昌 330096；2.江西正邦農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西南昌 330096；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西南昌 330045；4.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊凌 712100)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)是巴氏桿菌科(Pasteurellaceae)的一種革蘭氏陰性菌，體積較小，不具有運動性，形態(tài)多樣(從單球桿菌到絲狀鏈)[1]，在生長過程中需要V因子(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD)[2-3]。副豬嗜血桿菌是4周齡～8周齡仔豬上呼吸道的早期寄居菌，母源免疫水平、菌落定居情況及機體免疫系統(tǒng)的變化可以引起豬多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎[4]，臨床癥包括高熱(41.5℃)、咳嗽、腹式呼吸、關(guān)節(jié)腫脹伴有跛行以及側(cè)臥、四肢劃動和震顫等[5]。在感染豬場內(nèi)，副豬嗜血桿菌病的發(fā)病率和死亡率存在著很大的變化，一般豬群副豬嗜血桿菌病發(fā)病率可能從5%～10%不等，在陰性豬群中可達到75%[6]。

副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道內(nèi)的寄生菌，鼻腔和氣管的病原菌檢測并不能對該病菌進行診斷。可以從纖維素滲出物、發(fā)病豬的內(nèi)臟器管實質(zhì)和肺炎病豬的肺臟病變部位對副豬嗜血桿菌進行分離鑒定，從而對該病進行診斷[7]。該菌生長條件十分苛刻，在室溫下僅少量可以存活，對分離得到的病原菌進行抗生素敏感性的測定和病原菌的分型十分重要[8]。本研究主要從副豬嗜血桿菌感染癥狀比較典型的30日齡～50日齡病豬的肺臟組織、關(guān)節(jié)積液、腹腔積液、胸腔積液進行細(xì)菌分離，然后用PCR方法對分離菌株進行初步鑒定及血清型分型，為黑龍江、江西和廣東地區(qū)部分豬場副豬嗜血桿菌的研究提供流行病學(xué)數(shù)據(jù)。同時初步研制了副豬嗜血桿菌的單價滅活疫苗，為副豬嗜血桿菌的多聯(lián)多價疫苗研制奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡～8周齡Balb/c小鼠購自江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。20日齡～25日齡仔豬購自江西某豬場，該豬場未發(fā)生過豬鏈球菌病和副豬嗜血桿菌病，未免疫過豬鏈球菌疫苗和副豬嗜血桿菌疫苗，仔豬無豬鏈球菌病和副豬嗜血桿菌病臨床癥狀。試驗方案和實驗動物福利與倫理均符合相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基和大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；特級新生牛血清，草原綠野生物工程材料有限公司產(chǎn)品；氧化輔酶Ⅰ(NAD)，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；商品化豬鏈球菌病、副豬嗜血桿菌病二聯(lián)滅活疫苗，武漢科前生物股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 分光光度計，上海精科科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品；全自動核酸提取儀，西安天隆科技有限公司產(chǎn)品；PCR儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病料采集 從黑龍江、江西、廣東3個省12個發(fā)病豬場采集疑似副豬嗜血桿菌病料，發(fā)病豬為30日齡～50日齡，主要臨床癥狀為呼吸困難、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、皮膚及黏膜發(fā)紺、站立困難甚至癱瘓。病豬停藥后5 d～10 d，剖檢取病豬完整肺部，如有關(guān)節(jié)積液、腹腔積液、胸腔積液等病料，用一次性注射器吸取，4℃保存用于實驗室細(xì)菌分離。

1.2.2 細(xì)菌分離 用無菌棉簽將肺部病變部位、肺支氣管黏液和其他積液涂布于含有NAD的大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，同時蘸取金黃色葡萄球菌劃線，37℃培養(yǎng)24 h～48 h后觀察；挑取沿金黃色葡萄球菌“衛(wèi)星生長”的菌落，再次在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上，同時蘸取金黃色葡萄球菌劃線，37℃培養(yǎng)24 h～48 h。挑取沿金黃色葡萄球菌“衛(wèi)星生長”的菌落，接種胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h～16 h，用于后續(xù)菌落鑒定。

1.2.3 生化鑒定 無菌條件下用接菌環(huán)刮取多個菌落，進行革蘭氏染色，并分別接種過氧化氫酶、吲哚、蔗糖、乳糖、七葉苷和甘露醇等微量生化鑒定管中，隨后加入3 μL～5 μL的NAD，并設(shè)置對照組，37℃培養(yǎng)24 h～48 h，按照試劑盒說明書進行判定。

1.2.4 PCR鑒定及血清型分型 根據(jù)GenBank公布的豬副豬嗜血桿菌序列，結(jié)合Ologo6.0及Primeer Premier軟件自行設(shè)計1對副豬嗜血桿菌16S rRNA引物以及15對分型引物，引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成(表1)。副豬嗜血桿菌基因組DNA模板提取及PCR反應(yīng)參照文獻[3]。

表1 副豬嗜血桿菌血清型引物核苷酸序列

1.2.5 副豬嗜血桿菌的毒力試驗 選取25只6周齡～8周齡Balb/c小鼠，隨機分成5組，每組5只，分別設(shè)置不同活菌濃度組6×109、6×108、6×107、6×106CFU/mL和未攻毒對照組，皮下注射0.2 mL菌液，未攻毒對照組注射0.2 mL生理鹽水。連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠死亡情況。按照Reed&Muench氏法計算副豬嗜血桿菌的LD50。

1.2.6 疫苗制備 副豬嗜血桿菌菌種(2型、7型、13型)分別接種含有50 mL/L新生牛血清和10 g/L NAD的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10 h。培養(yǎng)的菌液6 000 r/min離心5 min，棄上清，用無菌磷酸緩沖鹽溶液將沉淀重懸至1.2×109CFU/mL。按體積比加入1 mL/L甲醛溶液，37℃靜置滅活24 h～48 h，期間每隔4 h攪拌1次。取滅活后的菌液涂布于大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基平板，進行活菌檢驗，以確保滅活徹底。然后與水包油包水佐劑充分混勻，使得副豬嗜血桿菌的終濃度為6×109CFU/mL。疫苗適用于4周齡～8周齡仔豬，免疫劑量為每頭份2.0 mL。

1.2.7 疫苗安全性試驗 選取20日齡～25日齡仔豬15頭，隨機分成3組，每組5頭，試驗分組分別為試驗Ⅰ組(本試驗疫苗)、試驗Ⅱ組(佐劑組)、試驗Ⅲ組(空白組)，試驗Ⅰ組頸部肌肉注射2 mL的本試驗疫苗，試驗Ⅱ組注射2 mL佐劑，試驗Ⅲ組注射2 mL無菌磷酸緩沖鹽溶液。連續(xù)觀察仔豬7 d，對仔豬體溫、飲食、精神狀況、死亡情況進行記錄，評價疫苗的安全性。

1.2.8 疫苗攻毒保護試驗 選取20日齡～25日齡仔豬40頭，隨機分成4組，每組10頭，試驗分組分別為試驗Ⅰ組(本試驗疫苗)、試驗Ⅱ組(商品疫苗組)、試驗Ⅲ組(不免疫組)、試驗Ⅳ組(未免疫不攻毒組)。免疫組仔豬頸部肌肉免疫2次，首免后35 d進行二免，每次免疫劑量為1 mL/頭。二免后2周，所有免疫組和攻毒對照組口服4 mL(5×109CFU/mL)的副豬嗜血桿菌活菌。在免疫前、攻毒前和攻毒后7 d分別采集仔豬血清和鼻腔拭子。

2 結(jié)果

2.1 菌落和細(xì)菌形態(tài)

大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基上，離金黃色葡萄球菌菌苔越近長勢越好，越遠菌落較小甚至未出現(xiàn)菌落(圖1A)。陰性對照組在大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h～48 h后，可以觀察到金黃色葡萄球菌附近無“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”(圖1B)。

圖1 副豬嗜血桿菌的衛(wèi)星生長現(xiàn)象

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～10.樣品；+.陽性對照；-.陰性對照

2.2 菌株生化鑒定結(jié)果

取副豬嗜血桿菌疑似菌落進行革蘭氏染色，在顯微鏡下可以觀察到革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，具有多種不同形態(tài)，從單個球桿菌到長的、細(xì)長的、甚至絲狀的菌體。將疑似菌落接種于過氧化氫生化鑒定管中，肉眼可見鑒定管中產(chǎn)生明顯的氣泡，而陰性對照組無氣泡產(chǎn)生；接種于蔗糖、乳糖、七葉苷、吲哚和甘露糖微量生化鑒定管中，蔗糖生化鑒定管由淡色變?yōu)辄S色，乳糖、七葉苷、吲哚和甘露糖生化鑒定管顏色沒有變化。

2.3 副豬嗜血桿菌PCR鑒定和分型鑒定結(jié)果

根據(jù)NCBI公布的副豬嗜血桿菌16S rRNA序列設(shè)計引物，對上述分離獲得的副豬嗜血桿菌進行PCR擴增，得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證。由瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可以看出，PCR擴增的目的片段位于750 bp～1 000 bp，與預(yù)期PCR擴增產(chǎn)物片段814 bp大小一致(圖2)。利用15對副豬嗜血桿菌分型引物對上述細(xì)菌進行分型鑒定，部分副豬嗜血桿菌分型瓊脂糖電泳結(jié)果(圖3)，黑龍江H豬場和I豬場副豬嗜血桿菌利用12型引物擴增出508 bp大小的片段，黑龍江G豬場副豬嗜血桿菌利用13型引物擴增出800 bp大小的片段。13個豬場副豬嗜血桿菌的血清型分型情況(表2)。

A.副豬嗜血桿菌12型檢測結(jié)果，M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；+.陽性對照；-.陰性對照；1.黑龍江F豬場Hps；2.黑龍江G豬場；3.黑龍江H豬場

表2 各豬場副豬嗜血桿菌血清型分型情況

2.4 副豬嗜血桿菌的小鼠毒力試驗

Balb/c小鼠皮下接種6×109、6×108、6×107、6×106CFU/mL副豬嗜血桿菌后，均出現(xiàn)精神不振，試驗組小鼠于48 h內(nèi)都出現(xiàn)死亡(圖4)。用Reed &Muench氏法計算副豬嗜血桿菌的50%感染致死量(LD50)，不同血清型副豬嗜血桿菌的50%感染致死濃度為5.0×107CFU/mL～1.0×108CFU/mL。

圖4 小鼠感染副豬嗜血桿菌后的存活情況

2.5 副豬嗜血桿菌滅活疫苗對仔豬免疫保護結(jié)果

副豬嗜血桿菌2型、7型、13型單價滅活疫苗分別經(jīng)頸背部肌肉免疫2 mL(6×109CFU/mL)，隨后逐日觀察仔豬的精神狀態(tài)及死亡情況。副豬嗜血桿菌滅活疫苗免疫組、佐劑免疫組和空白對照組仔豬體溫均正常、精神狀態(tài)良好，沒有死亡情況。副豬嗜血桿菌單價滅活疫苗免疫組利用同源菌株攻毒后沒有出現(xiàn)仔豬死亡情況，鼻腔拭子未檢測出Hsp核酸；而未免疫攻毒組出現(xiàn)仔豬死亡情況，且鼻腔拭子的Hsp核酸為陽性。用副豬嗜血桿菌間接血凝診斷試劑盒對仔豬免疫前和二免后14 d的血清抗體進行檢測，二免后14 d疫苗免疫組仔豬抗體水平較免疫前明顯升高，且副豬嗜血桿菌單價滅活疫苗的抗體水平與商品苗的抗體水平差異不顯著(P>0.05)(圖5)。

圖5 二免后14 d仔豬免疫后抗體水平

3 討論

近年來隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，規(guī)?；i場豬群受豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒等病毒感染后，可以繼發(fā)副豬嗜血桿菌病[9-13]。副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道寄生細(xì)菌，在健康豬群中該細(xì)菌的分離率為0～51.6%，其中仔豬群的分離率高達22.6%[14]。副豬嗜血桿菌有15個血清型，不同血清型的致病力也不相同，其中1型、2型、3型、4型、5型、8型、10型、12型、13型、14型和15型的致病力較強，而6型、7型、9型和11型沒有致病力[15]。副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國豬群中主要的流行血清型為4型、5型、12型、13型和14型[16]。本研究對我國黑龍江、江西和廣東地區(qū)部分豬場的副豬嗜血桿菌疑似病豬進行副豬嗜血桿菌分離，從發(fā)病豬中分離得到19株副豬嗜血桿菌，其中2型2株、4型7株、5型1株、10型1株、12型3株、13型2株、15型1株及低毒力株7型2株。這為黑龍江、江西和廣東地區(qū)副豬嗜血桿菌的防控提供了流行病學(xué)數(shù)據(jù)。

疫苗接種和抗生素是用于副豬嗜血桿菌感染的預(yù)防和控制手段，但是抗生素的長期使用使副豬嗜血桿菌的耐藥性越來越強，疫苗接種成為該病防治最為有效的措施[17]。我國商品化副豬嗜血桿菌以滅活疫苗為主，主要包含血清型1型、4型、5型、12型和13型。副豬嗜血桿菌不同菌株和不同血清型之間僅有部分交叉保護或無交叉保護，這使得目前商品化的滅活疫苗保護效果較差，不能有效的控制豬場副豬嗜血桿菌的流行[18]。

本研究從黑龍江、江西、廣東3個省12個發(fā)病豬場分離得到19株副豬嗜血桿菌，包括2型2株、4型7株、5型1株、7型2株、10型1株、12型3株、13型2株、15型1株，由于廣東、黑龍江、江西副豬嗜血桿菌均有多種血清型流行，且我國的商品化副豬嗜血桿菌滅活疫苗以1、4、5、12、13型為主，故初步研究了副豬嗜血桿菌2、7、13型單價滅活疫苗。本次研制的副豬嗜血桿菌單價滅活疫苗免疫仔豬14 d后，血清中副豬嗜血桿菌抗體濃度達到700 ng/mL，對同血清型的副豬嗜血桿菌的免疫保護率達到100%。副豬嗜血桿菌單價滅活疫苗產(chǎn)生的抗體水平與商品苗的抗體水平之間沒有顯著差別，為副豬嗜血桿菌多聯(lián)多價疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。