鄒惠禎，馮賽祥

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)是豬上呼吸道的常在病原菌，特定條件下可引起仔豬纖維素性胸膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等嚴(yán)重的全身性疾病。HPS的致病機(jī)制研究已取得一定的進(jìn)展，多個毒力相關(guān)基因被鑒定及深入研究，其中包括外膜蛋白、脂寡糖、莢膜等[1-3]。病原菌通過合成和分泌特殊的毒力因子來控制以及破壞宿主細(xì)胞，同時宿主通過天然免疫系統(tǒng)對細(xì)菌定植和感染做出響應(yīng)，產(chǎn)生一些抗菌因子，體現(xiàn)為病原菌與宿主之間的相互作用[4-8]。在這個相互作用中，病原菌的生長和繁殖需要大量的碳源和氮源。病原菌的復(fù)制能力是一個重要的致病因素，對其定植和傳播十分關(guān)鍵。

長鏈脂酰輔酶A合成酶(FACS)對細(xì)菌脂肪酸代謝起到重要作用，與細(xì)菌吸收外源長鏈脂肪酸并產(chǎn)生碳源和能量有關(guān)。FACS屬于腺苷酸激酶ANL超家族成員，這個家族成員催化兩步反應(yīng)：第一步是催化羧酸鹽的腺苷酰化反應(yīng)，形成?；?AMP中間體；第二步是催化硫酯的形成[9]，F(xiàn)ACS能將外源長鏈脂肪酸激活并轉(zhuǎn)化為脂酰輔酶A。HPS基因組中存在2個FACSs基因(fadD1和fadD2)，2個FACSs均具有長鏈脂酰輔酶A合成酶活性，并且HPS需要fadD1或fadD2才能存活，推測FACS在HPS致病過程中發(fā)揮重要作用[9]。2個FACSs的同源性為25%，兩者活性及生理功能存在差異， FadD1突變體對喹諾酮類抗菌藥物的敏感性發(fā)生變化。本研究利用已純化的FadD1和FadD2進(jìn)行體外重構(gòu)生化反應(yīng)，通過質(zhì)譜分析方法對2個脂酰輔酶A合成酶功能作進(jìn)一步的定性分析，為揭示兩者的功能差異提供化學(xué)分析數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步了解FACS在H.parasuis中的作用提供理論基礎(chǔ)。通過建立脂酰輔酶A合成酶活性體外質(zhì)譜分析方法，為病原細(xì)菌相關(guān)基因功能研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 純化蛋白 活性定性分析所用的純化蛋白FadD1和FadD2源于之前的研究[9]。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 所有液相質(zhì)譜所用化學(xué)試劑包括氨水、乙腈等均為分析純試劑，購自生工生物工程(上海)股份有限公司和阿拉丁試劑(上海)有限公司。UPLC(I Class)-MS/MS(三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜，Xevo TQ-S)，美國Waters公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 脂酰CoA合成酶體外重構(gòu)反應(yīng) 配制活性反應(yīng)體系：150 mmol/L Tris-HCl (pH7.2),10 mmol/L MgCl2,2 mmol/L EDTA,0.1% Triton X-100和5 mmol/L ATP，150 μmol/L棕櫚酸(C16:0)及待檢測蛋白20 μg，總體積為405 μL，體系在37℃ 預(yù)熱3 min。然后向體系中加入45 μL在37℃預(yù)熱3 min的還原型輔酶A(CoA)到0.5 mmol/L反應(yīng)60 min獲得反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.2 脂酰CoA合成酶的定性活性分析 脂酰CoA合成酶反應(yīng)產(chǎn)物用液相質(zhì)譜(LC-MS)進(jìn)行分離及定性分析，所用設(shè)備為Waters UPLC(I Class)-MS/MS(三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜，Xevo TQ-S)。色譜條件:色譜柱ACQUITY UPLC? BEH C18 (2.1*100m,1.7 μm)；柱溫35℃；進(jìn)樣量10 μL；流速0.3 mL/min(表1)。

表1 液相梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：ESI正離子，毛細(xì)管噴霧電壓4.0 kV，錐孔電壓30 V，錐孔溫度550℃，脫溶劑氣500 L/h，錐孔反吹氣50 L/h。以下3種檢測模式進(jìn)行信號監(jiān)測：①調(diào)查模式:母離子質(zhì)量掃描范圍200 m/z～1100 m/z，選定CoA、C16:0-CoA的M+H+和M+NH4+分子質(zhì)量大小(表2)進(jìn)行自動子離子掃描(product scan)，子離子范圍50 m/z～1100 m/z，MS1執(zhí)行全掃描，MS2對選定的或者強(qiáng)度排前的離子執(zhí)行進(jìn)一步的碰撞碎片離子掃描。②中性丟失掃描模式：中性丟失507 m/z,掃描范圍700 m/z～1100 m/z，碰撞能為 40 eV，掃描時間0.6 s/循環(huán)。MS1和MS2同時進(jìn)行全掃描，檢測固定目標(biāo)質(zhì)量差的離子。③多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)模式:自動離子駐留時間，監(jiān)測離子及條件(表3)。MS1選擇性通過所設(shè)定的母離子，MS2同時選擇性監(jiān)測多個特征子離子，只對選定的特異子離子進(jìn)行質(zhì)譜信號的采集。

表2 Survey模式下質(zhì)譜監(jiān)測離子信息

表3 MRM模式下質(zhì)譜監(jiān)測離子及條件

2 結(jié)果

2.1 FadD1和FadD2活性的質(zhì)譜定性分析(Survey模式)

以C16:0為底物，按1.2.1方法進(jìn)行體外反應(yīng)，然后按1.2.2方法對FadD1和FadD2的活性進(jìn)行定性確認(rèn)，對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行UPLC-MS/MS分析(圖1)，圖1A表示FadD1反應(yīng)產(chǎn)物在Survey模式下針對目標(biāo)產(chǎn)物分子量檢測的二級質(zhì)譜總離子色譜圖，其中高強(qiáng)度的離子峰主要集中在6 min～7.5 min，強(qiáng)度最高達(dá)到約7×108，圖1B為UPLC中6.5 min下的二級質(zhì)譜圖，C16-CoA被正離子碰撞后所產(chǎn)生的特征碎片離子499.4 m/z和428.0 m/z，說明在添加FadD1的反應(yīng)體系中有明顯的C16:0-CoA生成。在同等條件下，對FadD2的反應(yīng)產(chǎn)物液相質(zhì)譜分析，得到的總離子流色譜見圖1C，圖1D表示強(qiáng)度最高的色譜峰的二級質(zhì)譜圖，F(xiàn)adD2的反應(yīng)產(chǎn)物中同樣有C16:0-CoA生成，但是色譜結(jié)果顯示離子峰的強(qiáng)度要明顯低于FadD1的反應(yīng)產(chǎn)物，說明單位時間內(nèi)FadD2催化生成的C16:0-CoA的量或低FadD1，說明對于棕櫚酸這種底物而言，F(xiàn)adD2酶活性要低于FadD1。

圖A為液相檢測FadD1反應(yīng)產(chǎn)物的總離子流色譜，圖B是圖A中所選目標(biāo)色譜峰的二級質(zhì)譜圖，圖C為液相檢測FadD2反應(yīng)產(chǎn)物的總離子流色譜，圖D是圖C中所選目標(biāo)色譜峰的二級質(zhì)譜圖

2.2 中性丟失掃描模式分析

圖2A表示FadD1反應(yīng)產(chǎn)物在質(zhì)譜中性丟失掃描模式下所檢測得到的總離子流色譜，其中在6 min～7 min附近發(fā)現(xiàn)有高強(qiáng)度的離子信號，強(qiáng)度最高達(dá)到約5×107，C16:0-CoA在正離子的撞擊下產(chǎn)生一個難以被離子化的碎片，其分子質(zhì)量約507 u，而中性丟失掃描只顯示母離子與碎片子離子之間存在507 u固定差距的母離子信號。FadD1產(chǎn)物的中性丟失質(zhì)譜分析結(jié)果表明，有發(fā)生507 u中性丟失的物質(zhì)生成，主要位于色譜洗脫時間6 min～7 min，與之前的Survey掃描結(jié)果一致，加上質(zhì)譜結(jié)果顯示該位置的最強(qiáng)離子峰分子質(zhì)量為1006.368 u，與C16:0-CoA的分子質(zhì)量1006.350 u接近(圖2B)。進(jìn)一步確定FadD1的反應(yīng)產(chǎn)物存在C16:0-CoA。FadD2的反應(yīng)產(chǎn)物也檢測出C16:0-CoA(圖2C、圖2D)，但所檢測到的離子信號明顯低于FadD1所生成的，說明FadD1的活性可能大于FadD2。

圖A為液相檢測FadD1反應(yīng)產(chǎn)物的總離子流色譜，圖B是圖A中所選目標(biāo)色譜峰的二級質(zhì)譜圖，圖C為液相檢測FadD2反應(yīng)產(chǎn)物的總離子流色譜，圖D是圖C中所選目標(biāo)色譜峰的而質(zhì)譜圖

2.3 多反應(yīng)監(jiān)測MRM掃描模式分析

圖3A為FadD1反應(yīng)產(chǎn)物的在質(zhì)譜MRM模式下所檢測得到的總離子色譜，其中在6 min～7 min附近發(fā)現(xiàn)有高強(qiáng)度的離子峰生成，強(qiáng)度最高達(dá)到8×107，而質(zhì)譜結(jié)果顯示離子峰的分子質(zhì)量為1006.350 u，與C16:0-CoA的分子質(zhì)量一致，同時由于MRM模式會檢測目標(biāo)母離子的二級質(zhì)譜中是否含有特定的目標(biāo)子離子，根據(jù)表3的掃描條件，所檢測出有信號的離子峰是同時含有分子質(zhì)量為499.350 u的特征子離子的，進(jìn)一步說明所生成的目標(biāo)產(chǎn)物為C16:0-CoA，H.parasuis的FadD1的確具有轉(zhuǎn)化C16:0為C16:0-CoA的活性。在同等反應(yīng)體系和同等目的蛋白用量的條件下，F(xiàn)adD2也顯示出脂酰CoA合成酶活性(圖3B)，但目標(biāo)反應(yīng)產(chǎn)物的離子峰的面積和強(qiáng)度要明顯低于FadD1，最高僅有1×107，說明對于棕櫚酸這種底物而言，F(xiàn)adD2的活性可能要低于FadD1。

圖A為液相檢測FadD1反應(yīng)產(chǎn)物的總離子流色譜，圖B是圖A中所選目標(biāo)色譜峰的二級質(zhì)譜圖，圖C為液相檢測FadD2反應(yīng)產(chǎn)物的總離子流色譜，圖D是圖C中所選目標(biāo)色譜峰的而質(zhì)譜圖。

通過3種UPLC-MS/MS掃描方式的檢測，均確認(rèn)FadD1和FadD2的反應(yīng)體系中生成有 C16:0-CoA。FadD1和FadD2均具有脂酰輔酶A合成酶的活性，且FadD1的對脂酰輔酶A的轉(zhuǎn)化效率要明顯高于FadD2。本研究成功建立了脂酰輔酶A合成酶體外反應(yīng)的液相質(zhì)譜分析方法。

3 討論

細(xì)菌脂酰輔酶A合成酶具有遺傳多樣性，如大腸埃希氏菌具有2個脂酰輔酶A合成酶，其中EcFadD針對長鏈外源脂肪酸，而EcFadK則針對短碳鏈外源脂肪酸。條件致病菌銅綠假單胞菌甚至擁有多個針對不同鏈的FACSs[11]。但有的病原菌像杜克嗜血桿菌的部分測序菌株基因組則完全沒有編碼FACS的同源基因。HPS存在2個FACSs，其中FadD1與大腸埃希氏菌EcFadD具有一定的同源性，而FadD2與EcFadD無同源性，F(xiàn)adD1和FadD2在底物利用上有一定相似性[9-10]。從本試驗結(jié)果可以看到HPS的FadD1和FadD2均能夠利用長鏈脂肪酸作為底物，這有別于大腸埃希氏菌對外源脂肪酸的利用機(jī)制，也說明單純的序列分析往往無法完全準(zhǔn)確地確定基因的功能，需要具體試驗驗證。

在仔豬宿主環(huán)境中，就脂質(zhì)作為碳源而言，長鏈脂肪酸含量最高，而短鏈脂肪酸含量很低，多個FACSs有利于對宿主資源的利用。脂肪酸作為細(xì)菌膜的重要組成部分，其合成需要消耗大量的能量，相反，如果有現(xiàn)成的外源脂肪酸存在，細(xì)菌不但能節(jié)省資源建造細(xì)胞膜，同時能把脂肪酸作為能源物質(zhì)用于ATP的合成，因此，F(xiàn)adD1和FadD2在HPS存活和致病過程中可能發(fā)揮著重要的作用。HPS在致病過程中FadD1的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)[12]，也有研究認(rèn)為銅綠假單胞菌是通過多個FACSs掠奪肺部磷脂，在引起囊性纖維化過程中起到重要作用[13]。

中性丟失掃描模式和MRM模式能更有效地監(jiān)測出反應(yīng)產(chǎn)物脂酰CoA，檢測效果明顯好于Survey模式，雜峰更小，目標(biāo)峰更加集中。但中性丟失掃描和MRM掃描均需要預(yù)先知道目標(biāo)物質(zhì)的二級碎片信息。本研究結(jié)合FACS的體外重構(gòu)反應(yīng)聯(lián)合UPLC-MS/MS的分析技術(shù)成功建立了FACS的活性定性質(zhì)譜分析方法，并首次用于HPS的FadD1和FadD2活性功能研究。

本研究通過質(zhì)譜分析進(jìn)一步確認(rèn)脂酰輔酶A合成酶的生化功能，表明FACS在HPS存活過程中發(fā)揮重要的生理功能，是其致病的關(guān)鍵蛋白之一。成功建立了脂酰輔酶A合成酶體外質(zhì)譜分析方法，可為病原細(xì)菌相關(guān)基因功能研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。