何世成，王紫微,2，田艷群，胡巧云，唐小明，王衛(wèi)國(guó)，謝怡靈，王昌建*

(1.湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長(zhǎng)沙 410014；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙 410128；3.永定區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南張家界 427000)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)是具有環(huán)狀單股負(fù)鏈的DNA基因組，是最小的動(dòng)物病毒之一[1]。PCV可分為豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)及豬圓環(huán)病毒4型(PCV4)[2]。PCV1在豬腎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[3]，對(duì)豬無(wú)致病性。PCV2具有很強(qiáng)致病性[4]。PCV3在急性病死母豬中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)[5]。PCV3的基因組全長(zhǎng)為2 000 bp，包含3個(gè)ORF，ORF1編碼復(fù)制相關(guān)蛋白及一種特殊啟動(dòng)子(非ATG)，被認(rèn)為是最保守的區(qū)域，與PCV2的相關(guān)蛋白同源性為48%；ORF2編碼衣殼蛋白(Cap蛋白)，位于負(fù)鏈DNA，與PCV2 Cap氨基酸同源性為37%；ORF3編碼的蛋白功能還未清楚[6]。2016年美國(guó)首次報(bào)道PCV3以來(lái)，亞洲、歐洲和美洲的許多地區(qū)也相繼檢測(cè)到PCV3的存在。2017年3月我國(guó)首次報(bào)道PCV3感染[7-8]，且隨后呈逐年上升的趨勢(shì)，PCV3的陽(yáng)性率最高達(dá)到84%[9-10]。了解湖南省PCV3的遺傳變異情況，為湖南省PCV3的免疫防控、疫苗研究和實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 采自湖南省多個(gè)地區(qū)821份臨床病料和屠宰場(chǎng)豬淋巴結(jié)樣品中檢測(cè)PCV3陽(yáng)性Ct值≤30的25份核酸樣品。

1.1.2 主要試劑和儀器設(shè)備 2×TaqMaster Mix，安諾論生物科技有限公司產(chǎn)品；50×TAE緩沖液，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；Agarose，Biowest公司產(chǎn)品；Super GelRed核酸凝膠染料,蘇州宇恒生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000和DNA凝膠回收試劑盒，東盛生物科技有限公司產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增儀，西安天隆科技有限公司產(chǎn)品；電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；紫外凝膠成像儀，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) PCV3全基因擴(kuò)增引物對(duì)P1和P2根據(jù)文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)的引物合成(表1)。

表1 PCR擴(kuò)增引物

1.2.2 PCV3全基因組的擴(kuò)增及測(cè)序 PCV3擴(kuò)增反應(yīng)總體系為25 μL：無(wú)菌無(wú)核酸酶水7.5 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板3 μL。

PCV3擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃ 10 min；95℃ 20 s，64℃ (P1) /62℃ (P2) 退火30 s，72℃ 1 min，共37個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)完成后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于10 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳35 min，紫外凝膠成像儀中觀察結(jié)果、拍照。陽(yáng)性條帶切膠回收后編號(hào)，送擎科生物有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 遺傳進(jìn)化分析 將同一編號(hào)的4個(gè)不同測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNAStar中的SeqMan軟件進(jìn)行拼接獲得全基因序列，用NCBI的Blast比對(duì)分析。選取國(guó)內(nèi)外21株P(guān)CV3序列作為參考(表2)。全基因及ORF2的核苷酸序列同源性用DNAStar中的MegAlign軟件進(jìn)行比對(duì)；系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹使用MEGA-X64生物軟件繪制，通過(guò)軟件中Clustal W的比對(duì)方法進(jìn)行比對(duì),構(gòu)建進(jìn)化樹時(shí)采用Neighbor-Joining法。

表2 PCV3參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 豬圓環(huán)病毒3型全基因組擴(kuò)增結(jié)果

用P1、P2引物對(duì)PCV3陽(yáng)性樣品進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出條帶，產(chǎn)物大小與預(yù)期片段大小一致，分別為1 257 bp和1 075 bp(圖1)。共獲得7株P(guān)CV3全基因組序列和3株ORF2序列(表3)。

表3 PCV3分離株的來(lái)源信息Table 3 The information of PCV3 isolated strain

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.P6引物擴(kuò)增產(chǎn)物(1 075 bp)；2.P5引物擴(kuò)增產(chǎn)物(1 257 bp)

2.2 PCV3的遺傳進(jìn)化分析

對(duì)獲得的7株P(guān)CV3與國(guó)內(nèi)外上傳至GenBank中的21株P(guān)CV3全基因組序列用MEGA-X64生物軟件繪制系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹(圖2、圖3)。

●本研究獲得的PCV3全基因序列；◇GenBank中國(guó)外的PCV3全基因序列●The genome sequences of PCV3 obtained in this study；◇The genome sequences of PCV3 in GenBank outside China

●本研究獲得的PCV3 ORF2序列；◇GenBank中國(guó)外的PCV3 ORF2序列●The sequences of PCV3 ORF2 obtained in this study；◇The sequences of PCV3 ORF2 in GenBank outside China

本研究擴(kuò)增的PCV3全基因的遺傳關(guān)系均較近,全部分離株被分為3個(gè)分支。10株P(guān)CV3的ORF2序列在3個(gè)小分支中均有分布。其中2株2018年及1株2017年的分離株位于同一分支中，2株2020年分離株及1株2017年分離株在另一分支中，另一分支中存在3株2020年分離株及1株2017年分離株。說(shuō)明2017年-2020年湖南省的PCV3毒株存在不同的兩種進(jìn)化方向。

2.3 PCV3全基因組同源性分析

對(duì)7株P(guān)CV3分離株及國(guó)內(nèi)外上傳至GenBank中的21株P(guān)CV3全基因序列用DNAStar軟件中的MegAlign軟件進(jìn)行同源性分析(圖4)。發(fā)現(xiàn)7株P(guān)CV3全基因組核苷酸序列同源性為98.8%～99.7%，與國(guó)內(nèi)外的PCV3全基因組同源性為98.7%～99.9%。PCV3-CZ244-2020分離株與國(guó)內(nèi)分離株P(guān)CV3/CN/GDHE2/2016(MF069116.1)的核苷酸同源性最高(99.9%)；PCV3-XX19-2017分離株與國(guó)內(nèi)分離株P(guān)CV3/CN/Anhui-14/201611(MF084994.1)的核苷酸同源性最低(98.7%)。PCV3的同源性比對(duì)結(jié)果相較于PCV2來(lái)說(shuō)同源性更高，說(shuō)明變異程度較低，更加保守。

1～7.本研究獲得PCV3全基因組；8～28.GenBank中的21株P(guān)CV3全基因組1-7.The genome sequences of PCV3 obtained in this study；8-28.The genome sequences of PCV3 in GenBank

2.4 PCV3 ORF2序列同源性分析

本試驗(yàn)共獲得10株ORF2序列，將其與國(guó)內(nèi)外上傳至GenBank中的21株P(guān)CV3分離株的ORF2序列進(jìn)行同源性分析(圖5)。10株P(guān)CV3 ORF2的核苷酸序列同源性為97.8%～99.8%，與國(guó)內(nèi)外的PCV3 ORF2同源性為97.5%～100%。PCV3-HN137-2018分離株與國(guó)內(nèi)分離株P(guān)CV3/CN/Anhui-14/201611(MF084994.1)的核苷酸序列同源性最低(97.5%)；有2個(gè)分離株同源性為分別是PCV3-SY404-2020分離株與韓國(guó)2016年分離的PCK3-1701(MF611876.1)分離株，以及PCV3-YZ585-2020分離株與國(guó)內(nèi)2017年分離株P(guān)CV3-HBWH-201703(MG868941.1)。

1～10.本試驗(yàn)獲得的PCV3 ORF2序列；11～31.GenBank中的16株P(guān)CV3 ORF2序列1-10.The sequences of PCV3 ORF2 obtained in this study；11-31.The sequences of PCV3 ORF2 in GenBank

2.5 PCV3 ORF2氨基酸序列比對(duì)

本研究獲得的10株P(guān)CV3分離株的ORF2序列編碼的Cap蛋白均由214個(gè)氨基酸組成。根據(jù)PCV3 ORF2遺傳進(jìn)化樹不同分支將氨基酸序列，在第27位氨基酸存在K和R的差異。PCV3-XX19-2017分離株所在的分支存在1個(gè)獨(dú)特的位點(diǎn)，第24位氨基酸位點(diǎn)的氨基酸出現(xiàn)由A突變?yōu)閂的情況。在PCV3-HH59-2017分離株所在的分支中，第77位氨基酸位點(diǎn)出現(xiàn)由S突變?yōu)門的情況。僅有PCV3-HN137-2018在抗原表位第56位氨基酸和第98位氨基酸位點(diǎn)，PCV3-YY65-2017在抗原表位第150位氨基酸位點(diǎn)和PCV3-YY264-2020在第75位氨基酸位點(diǎn)存在ORF2的氨基酸序列存在位點(diǎn)突變，其他分離株參考序列無(wú)太大差異。

3 討論

在PCV3的亞型分型的研究中，有研究將PCV3序列中PCV3-IT/CO2017(MF162298.1)劃分為PCV3b，PCV3/CH/HB/CZ-1/2017(MG727539.1)為PCV3c，PCV3/CN/Anhui-14/201611(MF084994.1)為PCV3a[12]；有研究將參考序列PCV3-IT/CO2017(MF162298.1)劃分為PCV3c-1，PCV3/KU-1602(KY996338.1)和PCV3/CN/Heilongjiang/2017(MG372483.1)劃分為PCV3c-2[13]。本研究使用了以上5株參考毒株，從進(jìn)化樹中可以看出，如按文獻(xiàn)[13]的劃分標(biāo)準(zhǔn)，PCV3/KU-1602(KY996338.1)和PCV3/CN/Heilongjiang/2017(MG372483.1)本該在同一分支中，但在本研究遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建方法下卻分別處于兩個(gè)分支中，由此可見，對(duì)PCV3的劃分還不能進(jìn)行準(zhǔn)確的描述。根據(jù)本研究的系統(tǒng)發(fā)育樹，全部分離株可分為3個(gè)分支，所有分離株的遺傳關(guān)系均較近，無(wú)法對(duì)亞型進(jìn)行分類。

本研究獲得7株P(guān)CV3分離株全基因組，全基因大小均為2 000 bp，3株P(guān)CV3 ORF2序列，大小均為645 bp，10株ORF2序列均編碼214個(gè)氨基酸。7株P(guān)CV3全基因組的核苷酸序列同源性為98.8%～99.7%，與國(guó)內(nèi)外的PCV3全基因組同源性為98.7%～99.9%。本研究獲得的10株P(guān)CV3 ORF2的核苷酸序列同源性為97.8%～99.8%，與國(guó)內(nèi)外的PCV3 ORF2同源性為97.5%～100%。

PCV3具有9個(gè)氨基酸抗原表位，分為位于氨基酸第10-18位、第33-43位、第51-61位、第93-103位、第109-110位、第112-146位、第149-160位、第170-181位和第192-203位[8]。本研究中氨基酸序列不同分支存在1個(gè)或2個(gè)獨(dú)特的突變位點(diǎn)，其他參考毒株中未出現(xiàn)的2個(gè)突變位點(diǎn)，98(Q→R)和150(I→F)，均位于PCV3的抗原表位中，對(duì)PCV3的亞型分類無(wú)影響。與PCV2相比，PCV3的同源性較高，遺傳距離較近，突變位點(diǎn)較少，是較為穩(wěn)定的豬圓環(huán)病毒。