顧云雙，王 瑞，蘇 娜，彭 英，阿基業(yè)，王廣基，鄭亦文，孫建國(guó)*

（1江蘇省藥代動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院“中藥復(fù)雜組分PK-PD結(jié)合研究”創(chuàng)新單元，中國(guó)藥科大學(xué)，南京 210009；2新西蘭奧塔哥大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院藥理毒理學(xué)系，達(dá)尼丁 9054）

耳鳴是一種常見(jiàn)的耳部聽(tīng)覺(jué)異常癥狀，其病因較多，機(jī)制復(fù)雜，目前臨床主要采用糖皮質(zhì)激素類藥物［1］、擴(kuò)血管藥物［2］、中藥［3］、局部麻醉藥［4］、針刺［5］、聲治療［6-7］和認(rèn)知行為療法［8］等進(jìn)行干預(yù)治療。耳聾左慈丸是治療腎虛型耳鳴耳聾的經(jīng)典名方，由熟地黃、山茱萸（制）、山藥、茯苓、牡丹皮、竹葉柴胡、澤瀉、磁石（煅）八味藥材制成［9］。有研究表明，耳聾左慈丸對(duì)老年性耳鳴［10］、神經(jīng)性耳鳴［11］、藥物所致耳鳴［12］等多種耳鳴均具有治療作用。但目前還沒(méi)有關(guān)于耳聾左慈丸的定量研究。毛蕊花糖苷和松果菊苷是耳聾左慈丸的君藥熟地黃中的主要成分，氧化芍藥苷和苯甲酰芍藥苷來(lái)源于牡丹皮，為研究其在體內(nèi)的代謝行為，建立了耳聾左慈丸中毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷、苯甲酰芍藥苷的HPLC-MS/MS共檢測(cè)定量分析方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。并以此方法評(píng)價(jià)大鼠血漿中4種物質(zhì)的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為，為后續(xù)耳聾左慈丸的體內(nèi)研究提供參考。

1 材 料

1.1 藥品和試劑

毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)：RH260383，分析對(duì)照品）購(gòu)自羅恩化學(xué)試劑；苯甲酰芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：DST210410-053，HPLC≥98%）、氧化芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：DST201113-074，HPLC≥98%）、松果菊苷對(duì)照品（批號(hào)：DSTDS003801，HPLC≥98%）購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；耳聾左慈丸原料藥粉末（批號(hào)：20210309）受贈(zèng)于杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司；甲酸（色譜純）購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；甲醇（梯度級(jí)）購(gòu)自Merck 公司；水為超純水。

1.2 儀 器

高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（含日本島津高效液相色譜系統(tǒng)LC-30AD；美國(guó)AB Sciex質(zhì)譜系統(tǒng)API5000、電噴霧離子源及Analyst 1.5.1工作站）；Thermo Sorvall Biofuge Stratos 臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾公司）；Eppendorf Mix-Mate 混勻小精靈、Eppendorf Minispin AG22331 臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）；Vortex Mixer XW-80A渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Milli-Q Gradient A1 超純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）。

1.3 動(dòng) 物

健康SD 大鼠18 只，雌雄兼用，日齡42~62 d，購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001。

2 方 法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、松果菊苷的標(biāo)準(zhǔn)品于1.5 mL 離心管中，用甲醇溶解得到質(zhì)量濃度為10 mg/mL的4 份母液，將4 份母液分別用甲醇稀釋到1 mg/mL。分別從質(zhì)量濃度為1 mg/mL的母液中取苯甲酰芍藥苷100 μL、松果菊苷100 μL、毛蕊花糖苷50 μL、氧化芍藥苷50 μL于同一離心管中，用甲醇補(bǔ)足至體積為1 mL，得到苯甲酰芍藥苷和松果菊苷質(zhì)量濃度為100 μg/mL、毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷質(zhì)量濃度為50 μg/mL的混合儲(chǔ)備液，取此混合儲(chǔ)備液100 μL，加入甲醇900 μL，混勻后得到苯甲酰芍藥苷和松果菊苷質(zhì)量濃度為10 μg/mL、毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷質(zhì)量濃度為5 μg/mL的工作液母液，存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；水相（A）：超純水（含0.1%甲酸）；有機(jī)相（B）：甲醇；流速：0.4 mL/min；分析時(shí)間：7 min；梯度洗脫：0~0.5 min 5%B，0.5~1 min 5% ~ 85%B；1 ~ 4.5 min 85%B；4.5 ~ 5 min 85%~5%B；5~7 min 5%B。

2.3 質(zhì)譜條件

選用電噴霧離子源，源參數(shù)如下：噴霧電壓（IS）-4 500 V，輔助氣1（GS1）55 Arb，輔助氣2（GS2）55 Arb，輔助氣加熱溫度（TEM）550 ℃，氣簾氣（CUR）40 Arb，碰撞氣（CAD）6 Pa。

在負(fù)離子、MRM 模式下檢測(cè)，設(shè)定Q0 入口電壓（EP）為-10 V，Q2出口電壓（CXP）為-15 V，用于定量的離子對(duì)及相關(guān)質(zhì)譜信息見(jiàn)表1。

Table 1 Related parameters in MS analysis

2.4 血漿樣品處理方法

取大鼠血漿50 μL，加入含華法林內(nèi)標(biāo)（1 ng/mL）的甲醇溶液150 μL，振蕩5 min，在4 ℃條件下于18 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液130 μL至1.5 mL 離心管中，再次在4 ℃條件下以18 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液100 μL進(jìn)樣分析。

2.5 方法學(xué)考證

2.5.1 專屬性和選擇性 取空白SD 大鼠，按12 mL/kg的劑量（相當(dāng)于原藥6 g/kg劑量）灌胃給予耳聾左慈丸原藥粉末的生理鹽水懸濁液，采集給藥后5 min的眼眶血，置于含肝素的離心管中。在8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，收集上清血漿。取血漿50 μL 按“2.4”項(xiàng)處理后進(jìn)樣分析，得專屬性色譜圖（圖1）。

取6份來(lái)源不同的SD大鼠空白血漿50 μL，按照“2.4”項(xiàng)處理后進(jìn)樣分析；取同樣6 份來(lái)源不同的SD 大鼠空白血漿45 μL，分別加入標(biāo)曲定量下限處的工作液，得到含毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷質(zhì)量濃度0.5 ng/mL、苯甲酰芍藥苷和松果菊苷質(zhì)量濃度為1 ng/mL的加藥血漿，同樣按照“2.4”項(xiàng)處理后進(jìn)樣分析。

2.5.2 定量下限 取若干份45 μL 大鼠空白血漿，加入工作液5 μL，配制毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL，苯甲酰芍藥苷和松果菊苷質(zhì)量濃度為1 ng/mL的含藥大鼠血漿，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析（n=5）。根據(jù)當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線回算各樣品中物質(zhì)濃度，并求算RSD 和RE。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取“2.1”項(xiàng)下的工作液母液，用甲醇逐級(jí)稀釋配制系列工作液。以空白SD 大鼠的血漿作為基質(zhì)，按如下方法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=3）：取空白基質(zhì)45 μL 若干份，依次分別加入工作液5 μL，渦旋30 s 混勻，可得到毛蕊花糖苷和氧化芍藥苷質(zhì)量濃度為50，20，10，5，2.5，1，0.5 ng/mL，松果菊苷和苯甲酰芍藥苷質(zhì)量濃度為100，40，20，10，5，2，1 ng/mL的系列含藥血漿樣本，而后按照“2.4”項(xiàng)的方法處理樣品，進(jìn)樣分析。以所測(cè)生物樣品中的待測(cè)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為因變量（y），待測(cè)物質(zhì)的血漿終濃度為自變量（x），用最小二乘法（權(quán)重系數(shù)為1/x2）進(jìn)行回歸運(yùn)算，得到各物質(zhì)的回歸方程。

2.5.4 精密度和準(zhǔn)確度 取若干份45 μL 大鼠空白血漿，加入工作液5 μL，配制毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷質(zhì)量濃度為0.5，0.8，8，40 ng/mL，松果菊苷、苯甲酰芍藥苷質(zhì)量濃度為1，1.6，16，80 ng/mL的含藥血漿，平行5份，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，連續(xù)測(cè)定3 個(gè)分析批，每個(gè)分析批間隔大于12 h，根據(jù)每批隨行血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中的物質(zhì)濃度，求算批間、批內(nèi)準(zhǔn)確度和批間、批內(nèi)精密度。

2.5.5 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率 取6份來(lái)源不同的空白SD 大鼠血漿，按如下3種方式進(jìn)行處置：第1種處置方式，取若干份45 μL空白大鼠血漿，依次分別加入工作液5 μL，振蕩30 s，配制成毛蕊花糖苷和氧化芍藥苷血漿終濃度分別為0.5 ng/mL、40.0 ng/mL，松果菊苷和苯甲酰芍藥苷血漿終濃度為1 ng/mL、80.0 ng/mL的含藥血漿樣本，加入3 倍體積的含內(nèi)標(biāo)的甲醇沉淀劑，按“2.4”項(xiàng)下處理進(jìn)樣分析。第2 種處置方式，預(yù)先以3 倍體積甲醇沉淀劑對(duì)45 μL的空白大鼠血漿沉淀蛋白處理后，再加入工作液5 μL，振蕩混勻，隨后按“2.4”項(xiàng)下方法兩次離心處理后進(jìn)樣分析；第3 種，用等量超純水代替大鼠空白血漿，依前述第2 種處置方式，平行操作并進(jìn)樣分析。

進(jìn)樣后第1 種處置方式的樣品平均峰面積與第2種處置方式的樣品平均峰面積相比，結(jié)果即為大鼠血漿中4 種物質(zhì)的提取回收率；將第2 種處置方式的樣品平均峰面積與第3 種處置方法進(jìn)樣后的樣品平均峰面積相比，得到大鼠血漿中4種物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)因子。同時(shí)還考察了基質(zhì)因子的變異系數(shù)：用第2 種處置方式的4 種樣品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積與第3種處置方式的樣品和內(nèi)標(biāo)峰面積做比，計(jì)算4 種樣品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的基質(zhì)因子，然后用4 種樣品的基質(zhì)因子與各自的內(nèi)標(biāo)基質(zhì)因子相比，得到經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化后的基質(zhì)因子。

2.5.6 穩(wěn)定性 取若干份空白SD大鼠血漿45 μL，加入工作液5 μL，振蕩30 s 混勻，配制成濃度Ⅰ（毛蕊花糖苷和氧化芍藥苷終濃度為0.5 ng/mL、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷終濃度為1 ng/mL）和濃度Ⅱ（毛蕊花糖苷和氧化芍藥苷終濃度為40 ng/mL、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷終濃度為80 ng/mL）的含藥血漿，平行5 份，將制備樣品分別按照不同處置方法進(jìn)行處置：包括在室溫下放置8 h、超低溫（-60 ℃~-80 ℃）凍存30 d、超低溫冷凍（-60 ℃~-80 ℃）-解凍（37 ℃）3 次循環(huán)，每種考察條件下濃度Ⅰ和Ⅱ平行五份，按“2.4”項(xiàng)下處理進(jìn)樣分析，根據(jù)當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷的含量進(jìn)行回算。另外同樣制備濃度Ⅰ和濃度Ⅱ的含藥血漿，平行5 份，按照“2.4”項(xiàng)下處理，然后置于進(jìn)樣盤中（4 ℃）放置，24 h 后進(jìn)樣，并根據(jù)當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線回算各物質(zhì)含量。

2.6 耳聾左慈丸單次給藥后的藥代動(dòng)力學(xué)研究

2.6.1 制備給藥提取液 稱取耳聾左慈丸粉末80 g，加入超純水150 mL 及無(wú)水乙醇10 mL，超聲提取2 h，提取后在3 000 r/min 下離心10 min，取上清液于18 000 r/min 再次離心5 min，轉(zhuǎn)移出上清液用于給藥。另取上清液1 mL 使用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，用超純水稀釋100倍，取出稀釋后的樣品50 μL于1.5 mL離心管中，加入含華法林內(nèi)標(biāo)（1 ng/mL）的甲醇沉淀劑150 μL，振蕩5 min后，于18 000 r/min離心5 min，取出上清液130 μL，再次在18 000 r/min下離心5 min，取上清液100 μL 進(jìn)樣分析，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各物質(zhì)濃度。

2.6.2 實(shí)驗(yàn)方案 取空白雄性SD 大鼠4 只，按20 mL/kg（相當(dāng)于原藥10 g/kg 劑量）灌胃給予上述提取液。實(shí)驗(yàn)前12 h 禁食不禁水，采集給藥后0、5、10、20、40 min，及1、2、4、6、8 h的大鼠眼眶靜脈血，置于含肝素的離心管中。在8 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min，收集上清血漿，按“2.4”項(xiàng)方法處理后進(jìn)樣分析，根據(jù)隨行標(biāo)曲進(jìn)行濃度計(jì)算。將濃度結(jié)果導(dǎo)入Phoenix WinNonlin8.3 軟件進(jìn)行非房室模型擬合，求算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

3 結(jié) 果

3.1 專屬性和選擇性

在空白基質(zhì)中各物質(zhì)的響應(yīng)均低于空白血漿中各物質(zhì)定量下限的20%，并低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5%，表明4 種物質(zhì)在該方法下的保留情況不受血漿中內(nèi)源物質(zhì)的影響。毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷、苯甲酰芍藥苷和內(nèi)標(biāo)華法林的保留時(shí)間分別是1.93、1.87、1.86、2.08、2.27 min。幾種物質(zhì)的特征性色譜圖如圖1所示。

Figure 1 Characteristic chromatograms of verbascoside,oxypaeoniflorin,echinacoside,benzoylpaeoniflorin and warfarin(IS)

3.2 定量下限

根據(jù)隨行標(biāo)曲計(jì)算濃度，計(jì)算RSD 和RE（相對(duì)偏差），毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷、苯甲酰芍藥苷在定量下限處的RSD 依次為3.8%、5.5%、4.3%、7.0%；RE 依 次 為5.8%、5.7%、-1.5%、6.9%。符合生物樣本分析的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷、苯甲酰芍藥苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線如表2所示，結(jié)果表明各物質(zhì)在線性范圍內(nèi)的線性良好（r＞0.99），可滿足于后續(xù)在此范圍內(nèi)的物質(zhì)含量測(cè)定要求。

Table 2 Standard curves and linear ranges of verbascoside,oxypaeoniflorin,echinacoside and benzoylpaeoniflorin in rat plasma

3.4 精密度和準(zhǔn)確度

在定量下限和高、中、低濃度質(zhì)控濃度下，毛蕊花糖苷的批內(nèi)精密度RSD 在2.0% ~ 5.7%之間，批間精密度為6.3% ~ 7.2%；氧化芍藥苷的批內(nèi)精密度為3.3% ~ 7.0%，批間精密度為6.2% ~9.0%；松果菊苷的批內(nèi)精密度為3.9%~6.6%，批間精密度為6.1%~8.0%；苯甲酰芍藥苷的批內(nèi)精密度為2.2%~5.7%，批間精密度為5.0%~8.5%間。4 種物質(zhì)的批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度也都在標(biāo)示值的±15%之內(nèi)，表明該方法具有良好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，符合生物樣本測(cè)定相關(guān)原則。

Table 3 Accuracies and precisions of verbascoside,oxypaeoniflorin,echinacoside and benzoylpaeoniflorin in rat plasma

3.5 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率

在高、低兩個(gè)濃度下，毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷的平均提取回收率內(nèi)標(biāo)歸一化后的基質(zhì)因子列于表4。結(jié)果表明這4 種物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)的RSD 均小于15%，基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率均符合要求。

Table 4 Matrix effects and extraction recoveries of verbascoside, oxypaeoniflorin,echinacoside and benzoylpaeoniflorin in rat plasma

3.6 穩(wěn)定性

在考察的幾種條件下，毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷的低、高兩種濃度的RE 均小于15%，說(shuō)明在室溫放置8 h、進(jìn)樣盤放置24 h、以及超低溫-80 ℃凍存30 d 和3 次凍存凍融（-80 ℃~37 ℃）的條件下，4 種物質(zhì)都能夠保持足夠的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，可以滿足生物樣本測(cè)定的要求，數(shù)據(jù)結(jié)果如表5所示。

3.7 單次給藥后的藥代動(dòng)力學(xué)

將用于給藥的提取液進(jìn)樣測(cè)定了濃度，其中毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度為32 μg/mL，氧化芍藥苷質(zhì)量濃度為46.3 μg/mL，松果菊苷質(zhì)量濃度為23.3 μg/mL，苯甲酰芍藥苷質(zhì)量濃度為23.8 μg/mL。按照20 mL/kg的給藥劑量換算后毛蕊花糖苷的實(shí)際給藥濃度為640 μg/kg，氧化芍藥苷、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷的實(shí)際給藥濃度分別為926、466 和476 μg/kg。

Table 5 Stabilities of verbascoside,oxypaeoniflorin,echinacoside and benzoylpaeoniflorin in rat plasma(± s,n = 5)

Table 5 Stabilities of verbascoside,oxypaeoniflorin,echinacoside and benzoylpaeoniflorin in rat plasma(± s,n = 5)

Compd.Verbascoside Oxypaeoniflorin Echinacoside Benzoylpaeonifl-orin c/（ng/mL）0.8 40 0.8 40 1.6 80 1.6 80 Room temperature 8 h RSD/%5.2 3.2 5.8 3.4 4.6 2.8 2.3 2.6 RE/%-3.0-6.0 5.3-2.4-1.0-6.1 0.6-2.0 Automatic(24 h)RSD/%4.1 2.8 6.3 3.0 4.3 4.9 9.2 2.3 RE/%-3.1-0.8 2.6-1.4-2.3-0.4 1.9 5.8 Freeze(-70°C for 30 d)RSD/%5.1 3.4 4.9 2.4 7.3 4.3 8.0 1.8 RE/%0.3 1.7 7.6-2.6 4.4 4.5 0.5 0.2 Freeze-thaw(three times)RSD/%2.0 3.2 3.1 1.4 5.5 4.5 5.2 2.5 RE/%1.0 1.3 10.1-0.9 0.4 1.9 5.0 0.6

通過(guò)軟件計(jì)算得到4 種物質(zhì)在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表6所示。在給予耳聾左慈丸提取液后，氧化芍藥苷在大鼠體內(nèi)濃度較高，cmax1為（24.40 ± 4.78）ng/mL，cmax2為（22.50 ±2.70）ng/mL；毛蕊花糖苷和松果菊苷在大鼠體內(nèi)消除較快，半衰期在1.8 h 左右，苯甲酰芍藥苷的半衰期在3 h 左右。并且繪制了4 種物質(zhì)的血藥濃度-時(shí)間曲線，如圖2 所示，毛蕊花糖苷在給藥后6 min 左右時(shí)達(dá)峰，而氧化芍藥苷、松果菊苷、苯甲酰芍藥苷均在給藥后出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象。

Table 6 Pharmacokinetic parameters of verbascoside,oxypaeoniflorin,echinacoside and benzoylpaeoniflorin in rats after single-dose i.g administration(± s,n = 4)

Table 6 Pharmacokinetic parameters of verbascoside,oxypaeoniflorin,echinacoside and benzoylpaeoniflorin in rats after single-dose i.g administration(± s,n = 4)

Parameter AUC(0-t)/(ng/mL·h)AUC(0-∞)/(ng/mL·h)cmax1/(ng/mL)cmax2/(ng/mL)tmax1/h tmax2/h t1/2z/h CLz/F(L/h/kg)Vz/F(L/kg)14.06±2.24 15.55±3.46 6.14±1.92/0.104±0.036/1.88±0.52 42.91±7.91 111.36±17.87 88.32±19.30 111.66±14.19 24.40±4.78 22.50±2.70 0.083 0.667 2.63±0.69 8.42±0.99 31.55±8.06 18.53±2.53 21.48±2.81 4.71±1.88 3.92±1.00 0.083 0.667 1.82±0.15 22.07±2.87 74.26±26.31 11.88±3.11 15.32±1.89 4.15±1.84 3.51±2.91 0.083 0.667 3.04±1.37 31.54±3.79 142.63±78.63 Verbascoside Oxypaeoniflorin Echinacoside Benzoylpaeoniflorin

4 討 論

4.1 耳聾左慈丸的提取方法

中藥具有服用量大的特點(diǎn)，在動(dòng)物給藥時(shí)，直接研磨灌胃困難難以在合適的給藥體積內(nèi)保證給藥劑量，需要進(jìn)行提取，目前耳聾左慈丸常用的的提取方式是高溫煎煮［13］，但是高溫會(huì)影響物質(zhì)穩(wěn)定性，導(dǎo)致提取后成分的組成和含量與原藥出現(xiàn)差異。在本實(shí)驗(yàn)中，采用水醇混合超聲提取，溶解范圍更廣泛，并且能保證某些熱不穩(wěn)定組分的含量不發(fā)生明顯變化，使提取液的成分組成更接近原藥的成分組成。

4.2 藥代動(dòng)力學(xué)行為分析

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠在耳聾左慈丸提取液灌胃給藥后，毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷、苯甲酰芍藥苷均能夠在體內(nèi)迅速分布并進(jìn)行快速消除，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［14-17］。與其他3 種物質(zhì)相比，氧化芍藥苷在大鼠血中的濃度較高。此外，氧化芍藥苷、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷在給藥后都出現(xiàn)了雙峰，3 種物質(zhì)在給藥后5 min 就出現(xiàn)了1次吸收峰，隨后在40 min左右出現(xiàn)第2次吸收峰，腸肝循環(huán)導(dǎo)致雙峰需要更長(zhǎng)時(shí)間，所以腸肝循環(huán)引起雙峰的可能性不大。提取液在給藥時(shí)為濁液，所以存在部分藥物溶解在溶液中的現(xiàn)象，而這部分溶解形式的藥物更易通過(guò)胃快速吸收，產(chǎn)生1 次快速吸收相。因此推測(cè)與其在體內(nèi)的吸收過(guò)程有關(guān)，由于吸收不均勻出現(xiàn)雙峰。相關(guān)研究表明［18-19］在灌胃給予氧化芍藥苷和松果菊苷的溶液時(shí)，均未出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，而Zhou等［20］在進(jìn)行苯甲酰芍藥苷的藥代動(dòng)力學(xué)研究時(shí)灌胃給予了苯甲酰芍藥苷的混懸液，其中部分藥物溶解，部分未溶解，給藥后也出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象，并且第1 個(gè)吸收峰也是在給藥5 min 后出現(xiàn)的，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，所以推測(cè)這種雙峰現(xiàn)象是由于部分溶解的分子形式在灌胃后首先被胃迅速吸收，造成了5 min 處的第1 個(gè)吸收峰，而第2 個(gè)吸收峰則是由未溶解部分的吸收產(chǎn)生的。

Figure 2 Plasma concentration-time curves of verbascoside(A),oxypaeoniflorin(B),echinacoside(C)and benzoylpaeoniflorin(D)(± s,n = 4 )

5 結(jié) 論

耳聾左慈丸是治療耳聾耳鳴的經(jīng)典方，目前還未有耳聾左慈丸在體內(nèi)的定量研究結(jié)果報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)耳聾左慈丸進(jìn)行了提取，并且首次建立了毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷這4種物質(zhì)在大鼠血漿中的LC-MS/MS共檢測(cè)方法并用于評(píng)價(jià)耳聾左慈丸提取液在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用于指導(dǎo)在相同的給藥劑量下灌胃給予耳聾左慈丸提取液后毛蕊花糖苷、氧化芍藥苷、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為，但實(shí)驗(yàn)中毛蕊花糖苷、松果菊苷和苯甲酰芍藥苷的濃度較低，可考慮在保證物質(zhì)穩(wěn)定性的前提下進(jìn)一步優(yōu)化提取方法，提高提取效率。