劉素彤， 張麗慧， 顧亞嬌， 劉鳴昊， 郭 敏， 趙晨露， 趙文霞

河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 脾胃肝膽科， 鄭州 450000

隨著肥胖的流行和代謝綜合征(MetS)患病率的迅速增長,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成為健康體檢肝臟生化指標異常的首要原因[1]。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是臨床干預的關(guān)鍵節(jié)點，若此階段未加干預，有進展成肝纖維化、肝硬化的風險。目前,尚無治療NASH的特效藥物?；奠顫窕钛绞侨珖嗅t(yī)趙文霞教授的經(jīng)驗方，其治療NASH臨床療效確切[2]，前期動物實驗[3-5]表明，化痰祛濕活血方可降低NASH大鼠肝酶、調(diào)節(jié)脂代謝、提高肝臟抗氧化能力，抑制炎癥反應，防止肝細胞發(fā)生壞死和凋亡。但尚缺乏以線粒體超微結(jié)構(gòu)為切入點，探討其作用機制的研究。因此本研究將以高脂飼料誘導NASH大鼠模型，以臨床常用藥易善復為陽性對照藥。透射電鏡下觀察肝細胞超微結(jié)構(gòu)，探索化痰祛濕活血方在亞細胞水平上的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD 雄性大鼠48只，SPF級，體質(zhì)量(150±10) g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物合格證號：11400700116588；許可證號：SXYK(豫) 2015-0005。

1.2 實驗藥物 化痰祛濕活血方顆粒劑: 澤瀉，批號: 15120135; 丹參，批號: 15060138; 海藻，批號: 15070027; 郁金，批號: 15060128; 決明子，批號: 15090036; 山楂，批號: 15060020；柴胡，批號: 15070208；水飛薊，批號: 15070223; 由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供。多烯磷脂酰膽堿膠囊(易善復): 賽諾菲( 北京) 制藥有限公司，批號: 5JD070。

1.3 主要試劑與儀器 高脂飼料: 普通飼料(84%)、豬油(10%) 、蛋黃粉(5%) 、膽固醇(1%) 。飼料由河南省實驗動物中心加工而成。透射電鏡(FEI，美國)，倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯，日本)

1.4 分組、造模及給藥 48只SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周，第2周分組并開始造模及給藥。大鼠隨機分為空白組，模型組，易善復組，化痰祛濕活血方組(簡稱中藥組)，每組12只。空白組給予普通飼料，另外3組給予高脂飼料。依據(jù)人與動物劑量折算法：化痰祛濕活血方等效劑量為1.26 g/100 g體質(zhì)量，多烯磷脂酰膽堿膠囊(易善復)等效劑量為0.014 18 g/100 g體質(zhì)量。模型組灌胃0.9%氯化鈉溶液，易善復組灌胃多烯磷脂酰膽堿混懸液，中藥組給予灌胃化痰祛濕活血方顆?；鞈乙海?次/d，連續(xù)10周。

1.5 透射電子顯微鏡觀察各組大鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)及定量分析 實驗步驟：灌胃10周結(jié)束后，用電子秤稱取鼠重，大鼠予10%水合氯醛麻醉，迅速取出各組肝組織，修成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，置于4℃，2.5%的戊二醛固定，4℃、1%鋨酸后固定。以乙醇及丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制成1 μm厚的半薄片，用鉆石刀切制成70 nm厚的超薄切片，鈾鉛染色后透射電鏡觀察肝細胞線粒體形態(tài)數(shù)量及其他細胞器等超微結(jié)構(gòu)。定量分析：采用國際上通用的細胞立體計量學點分析法，對實驗各組選擇2只動物，每只動物取3塊肝組織，每塊組織觀察5個細胞進行定量測定，測定肝細胞內(nèi)脂滴和線粒體的指標為體密度。

2 結(jié)果

2.1 化痰祛濕活血方對肝細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 空白組表現(xiàn) 電鏡下可見大鼠肝細胞形態(tài)正常，細胞膜完整，細胞核較大居中，核膜完整，核仁清晰，胞內(nèi)有大量豐富的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高倍鏡下可見結(jié)構(gòu)清晰完整的線粒體及大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖1)。

2.1.2 模型組表現(xiàn) 低倍鏡下可見模型組大鼠肝細胞內(nèi)有大量脂滴積累，占細胞面積1/2～2/3，部分肝細胞核被脂滴擠壓變形或擠向細胞邊緣。線粒體較正常組體積增大，脂滴與線粒體互相擠壓；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯減少。高倍鏡下可見線粒體周圍圍繞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯少于正常組，結(jié)構(gòu)不清晰；線粒體結(jié)構(gòu)被破壞，雙層膜模糊或消失，與胞質(zhì)分界不清晰；線粒體嵴排列紊亂或數(shù)量減少(圖2)。

注：a，空白組大鼠肝細胞形態(tài)正常(×5000)，箭頭為脂滴；b，放大倍數(shù)后可見清晰完整線粒體及大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(×50 000)，箭頭為線粒體。

注：a,模型組大鼠肝細胞內(nèi)大量脂滴積累(×2500)，箭頭為脂滴;b, 放大倍數(shù)后可見線粒體結(jié)構(gòu)破壞、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少(×50 000)， 箭頭為線粒體。圖2 電鏡下模型組大鼠肝細胞超微結(jié)構(gòu)Figure 2 Ultrastructure of rat liver cells in model groupunder electron microscope

2.1.3 中藥組表現(xiàn) 低倍鏡下可見細胞內(nèi)脂滴沉積較模型組明顯減少，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較模型組增多，且結(jié)構(gòu)較清晰。高倍鏡下可見線粒體形態(tài)明顯較模型組好轉(zhuǎn)，雙層膜結(jié)構(gòu)較完整(圖3)。

注：a，中藥組大鼠肝細胞內(nèi)脂滴明顯減少(×2500)；b，放大倍數(shù)后可見線粒體膜較完整(×50 000)，箭頭為線粒體。

2.1.4 易善復組表現(xiàn) 低倍鏡下可見大鼠肝細胞內(nèi)脂滴沉積，數(shù)量較模型組減少，占細胞面積1/3 以下；線粒體數(shù)量較模型組明顯增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，線粒體結(jié)構(gòu)清晰。 高倍鏡下可見大部分線粒體結(jié)構(gòu)完整，雙層膜清晰，線粒體嵴排列整齊，少數(shù)線粒體雙層膜破壞，或雙層膜結(jié)構(gòu)完整，但線粒體嵴被破壞(圖4)。

2.2 化痰祛濕活血方對大鼠肝細胞線粒體影響的定量分析 與空白組相比，模型組脂滴面積明顯增多，線粒體減少，體密度比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01) ；藥物干預后，易善復組脂滴面積減少、線粒體數(shù)目增多，與模型組體密度比較差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)；中藥組較易善復組脂滴面積減少更多、線粒體數(shù)目明顯增加，體密度比較差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表1)。

注：a,對照組大鼠肝細胞內(nèi)脂滴減少(×2500)，箭頭為脂滴;b，放大倍數(shù)后可見線粒體結(jié)構(gòu)較完整(×50 000)，箭頭為線粒體。

表1 各組大鼠脂滴和線粒體體密度比較Table 1 Lipid droplet and mitochondrial body densitywere compared in each group

3 討論

線粒體是肝臟脂肪酸β氧化最主要的細胞器。非酒精性脂肪性肝病初期肝細胞內(nèi)脂滴沉積，誘發(fā)脂肪變性，肝細胞內(nèi)大量游離脂肪酸轉(zhuǎn)變成脂酰輔酶A，然后進入線粒體進行β氧化[6]。脂質(zhì)貯積增多，肝臟對游離脂肪酸攝取的增加使線粒體β氧化速度代償性增加，進而增加活性氧(ROS)的產(chǎn)出，當超過抗氧化物質(zhì)的清除能力導致ROS蓄積時，此時ROS與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的多聚不飽和脂肪酸的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)反應形成有毒的脂質(zhì)，從而使線粒體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，并破壞線粒體膜的穩(wěn)定性，引發(fā)肝細胞程序性死亡，通過亞致死性和致死性應激效應引起肝細胞的損傷。因此，維持肝細胞線粒體結(jié)構(gòu)、數(shù)量、功能的正常，在NASH治療中不可忽視。

NASH病因與飲食不節(jié)、形體肥胖、多臥少動密切相關(guān)，脾氣虧虛，運化失職致肝失條達、痰濕內(nèi)停、瘀血阻絡(luò)是本病的主要病機[7]?；颊哌^食肥甘厚味、勞逸失度、情志失調(diào)，導致肝失疏泄、脾失健運，脾胃運化失職，水濕內(nèi)停，濕煉為痰，痰阻氣機，氣滯血瘀，“濕、痰、瘀”交阻肝絡(luò)而發(fā)病。探索“痰濕瘀”的病理生理物質(zhì)基礎(chǔ)，進一步闡明針對痰、濕、瘀的“化痰祛濕活血”干預NASH形成的微觀聯(lián)系具有重要意義。

筆者依據(jù)NASH“痰濕內(nèi)停、瘀血阻絡(luò)、肝失條達”的主要病機創(chuàng)立了化痰祛濕活血方(澤瀉、丹參、郁金、海藻、決明子、山楂、水飛薊、柴胡)。前期研究[8]已證實化痰祛濕活血方可顯著降低NASH患者血清ALT、胰島素抵抗，提高肝/脾CT值，降低甘油三酯、BMI，改善臨床癥狀方面均明顯優(yōu)于對照組。同時筆者的基礎(chǔ)研究[3,5]也發(fā)現(xiàn)，化痰祛濕活血方能夠降低NASH模型大鼠相關(guān)炎癥因子、氧化應激因子，從而改善肝組織炎癥損傷及肝纖維化程度，具有良好的抗NASH作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，電鏡下模型組的肝細胞線粒體形態(tài)較正常組大，定量分析發(fā)現(xiàn)線粒體體密度減少，說明氧化應激損傷導致線粒體膜通透性增加，細胞器水腫。 經(jīng)化痰祛濕活血方干預后，線粒體數(shù)量增加，形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，腫脹減輕或消失，雙層膜結(jié)構(gòu)較完整，膜密度增加。說明化痰祛濕活血方有減輕線粒體腫脹、改善線粒體膜通透性、恢復線粒體形態(tài)的作用。 經(jīng)過化痰祛濕活血方干預后，NASH大鼠肝臟內(nèi)脂滴明顯減少，提示該方可能通過減輕肝細胞脂質(zhì)沉積來降低胞內(nèi)氧化應激反應，進而減輕線粒體功能的損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)化痰祛濕活血方組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較模型組明顯增多，分布廣泛，提示本方有改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、增加其數(shù)量和改善其結(jié)構(gòu)的功能和作用。 易善復可以增加膜穩(wěn)定性，修復膜功能抗脂質(zhì)過氧化的作用，臨床常用于治療非酒精性脂肪性肝病。 本研究發(fā)現(xiàn)，易善復組大鼠脂滴數(shù)量較模型組減少，線粒體數(shù)量較模型組明顯增多，大部分線粒體結(jié)構(gòu)完整，雙層膜清晰，線粒體嵴排列整齊，少數(shù)線粒體膜結(jié)構(gòu)破壞。提示在使用化痰祛濕活血方同時可以結(jié)合現(xiàn)代藥理研究增加有修復生物膜作用的藥物，以提高療效。

綜上所述，本研究從亞細胞水平觀察了化痰祛濕活血方對肝細胞超微結(jié)構(gòu)的影響，為中醫(yī)藥防治NASH的機制研究提供了實驗依據(jù)。后續(xù)還會開展針對線粒體損害導致的細胞程序性死亡方面探究化痰祛濕活血方的作用靶點，為該方的臨床使用提供更多實驗證據(jù)。

倫理學聲明：本研究方案于2016年7月經(jīng)由河南中醫(yī)藥大學審批，批號: DWLL15010018，符合實驗室動物管理與使用準則，通過河南中醫(yī)藥大學動物倫理審查。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：趙文霞負責課題設(shè)計；劉素彤負責資料分析，撰寫論文；張麗慧參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；劉鳴昊負責擬定寫作思路；顧亞嬌、郭敏、趙晨露負責指導撰寫文章并最后定稿。