成敏蓉， 劉杭豐， 高書華， 鄭錦秀,3)， 楊 濤,3)*

(1)山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 太原 030001；2)山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室， 太原 030001；3)山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 太原 030001)

唾液酸免疫球蛋白型凝集素-15(sialic acid-binding immunoglobulin-type lectin-15, Siglec-15)是唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素家族成員，主要在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和破骨細(xì)胞中表達(dá)，通過細(xì)胞表面受體與配體相結(jié)合而發(fā)揮不同的作用[1, 2]。早期研究表明，Siglec-15參與破骨細(xì)胞分化[3-5]，且可作為骨質(zhì)疏松癥的潛在治療靶標(biāo)[6, 7]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，Siglec-15是一種新的免疫抑制分子，主要通過抑制T細(xì)胞功能促進(jìn)腫瘤發(fā)生免疫逃逸。其序列與程序性死亡配體1(Programmed cell death ligand 1,PD-L1)相似，但免疫抑制功能獨(dú)立于PD-1/PD-L1，有望成為免疫治療新靶點(diǎn)[8-10]。Siglec-15在肺癌、膀胱癌等多種腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中廣泛上調(diào)[10-12]。在骨肉瘤和肝癌中，分別具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的作用[13, 14]。然而，Siglec-15在結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)中，是否異常表達(dá)及其對CRC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響尚不明確。

腫瘤微環(huán)境中，免疫細(xì)胞浸潤與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。T淋巴細(xì)胞在介導(dǎo)抗腫瘤免疫中扮演重要的角色[15-17]。T淋巴細(xì)胞主要分為 CD4+T細(xì)胞亞群及CD8+T細(xì)胞亞群，其浸潤水平在一定程度上反映了機(jī)體抗腫瘤反應(yīng)的強(qiáng)度[18-20]。有研究證實(shí)，Siglec-15在腎上腺皮質(zhì)癌中，與CD8+T細(xì)胞浸潤成正相關(guān)，在子宮癌肉瘤中則相反[11]。而在結(jié)直腸癌中，Siglec-15與腫瘤微環(huán)境CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞浸潤的相關(guān)性尚不清楚。

基于這些現(xiàn)狀，本文通過CCK8、劃痕愈合、ELISA以及小鼠荷瘤等實(shí)驗(yàn)，探究了Siglec-15異常表達(dá)對CRC細(xì)胞功能、CD8+T細(xì)胞功能及小鼠腫瘤生長的影響。同時(shí)，結(jié)合生物信息學(xué)分析與臨床組織樣本檢測分析了Siglec-15表達(dá)與CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞浸潤的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞株MC38購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細(xì)胞庫；人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460購自山西哲源科學(xué)儀器有限公司。4～6周齡雌性C57BL/6購買自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。收集山西省腫瘤醫(yī)院病理科2015年1月4日至2015年12月30日存檔的52例的結(jié)直腸癌及其配對癌旁正常黏膜組織的石蠟標(biāo)本。本研究已通過山西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，病人和家屬均已簽署知情同意書。

RPMI1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；L-15培養(yǎng)基購自Boster公司；胎牛血清(FBS)購自Moregate Biotech公司；過表達(dá)Siglec-15慢病毒及其陰性對照病毒購自吉凱基因公司；CCK8試劑盒購自Boster公司；小鼠CD8+T細(xì)胞磁珠陰選試劑盒購自STEMCELL Technologies公司；Siglec15抗體(NBP2-41162)購自Novus公司；Siglec15抗體(PA5-50759)購自Thermo fisher公司；CD4抗體(ab183685，ab133616)、CD8抗體(ab209775)均購自abcam公司；CD8抗體(70306s)購自Cell Signaling Technology公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；通用型試劑盒(小鼠/兔聚合物法檢測系統(tǒng))、二氨基聯(lián)苯(DAB)顯色試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。ELISA 試劑盒(abs520010、abs520007)購自Absin公司，細(xì)胞毒性試劑盒(G9290)購自Promega公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫來源的568例結(jié)直腸癌與44例正常組織樣本中Siglec-15表達(dá)數(shù)據(jù)；通過單樣本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA)，評估UCSC Xena數(shù)據(jù)庫中CRC樣本免疫細(xì)胞的浸潤水平。

1.3 Western印跡檢測

RIPA裂解混合液(RIPA∶PIC∶PMSF=100∶2∶1)提取總蛋白質(zhì)。BCA法對蛋白質(zhì)定量分析，通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉1 h，加入一抗4℃過夜孵育。次日，二抗室溫孵育1 h，加入適量ECL發(fā)光液，凝膠成像儀顯影。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

設(shè)計(jì)Siglec-15 shRNA引物，shSiglec-15-1上游引物：5′-GATCGTCAACATCTCGGTGCT-3′，下游引物：5′-AGCACCGAGATGTTGACGATC-3′；shSiglec-15-2上游引物：5′-GACAGGCTCATTTGTGAGAAC-3′，下游引物5′-GTTCTCACAAATGAGCCTGTC-3′。引物退火形成雙鏈，用BamHⅠ、EcoRⅠ對載體37℃雙酶切，將退火片段與載體按質(zhì)量比4∶1混合，加入T4 DNA連接酶16℃過夜連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。挑取單克隆菌落，接種于含氨芐的液體LB培養(yǎng)基，37℃搖菌12～14 h。收集菌液送至西安擎科生物技術(shù)有限公司測序。按照LipofectamineTM2000說明，轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞。6 h，更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后觀察轉(zhuǎn)染效率并加入遺傳霉素(Geneticin，G418)篩選。

1.5 細(xì)胞增殖檢測

取對數(shù)增殖期的細(xì)胞，按5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種至96孔板中。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔加入10 μL CCK8。1～2 h后檢測450 nm處的吸光度值。

1.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)增殖期的細(xì)胞接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞完全匯合后，用200 μL槍頭在孔板內(nèi)行“井”字劃痕，保證每孔劃痕寬度一致。PBS清洗脫落細(xì)胞后，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0 h、24 h和48 h時(shí)，在相同位置拍照觀察劃痕愈合情況，并用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)與病毒感染

SW480、MC38和NCM460細(xì)胞分別使用L15、RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)基均含100 U/mL的青霉素-鏈霉素混合物和10% FBS，細(xì)胞株置于37℃和5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%，用0.25%胰酶消化傳代。在6孔板中接種MC38細(xì)胞(8×104/孔)，待細(xì)胞匯合度為20% ～ 30%時(shí)，將陰性對照慢病毒及過表達(dá)Siglec-15慢病毒按感染系數(shù)MOI=20感染MC38細(xì)胞，12 h后更換新鮮培養(yǎng)基。感染約72 h，觀察感染效率，加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選，并分別命名為“LV-NC”和“LV-Siglec-15”。

1.8 小鼠荷瘤

將4～6周齡雌鼠隨機(jī)分為2組，每組5只，每只小鼠右腿皮下接種2×106個(gè)細(xì)胞。約7 d成瘤后，每隔3 d測量腫瘤的長徑與短徑。按腫瘤體積=(長徑×短徑2)/2計(jì)算體積并繪制腫瘤體積生長曲線。28 d后處死小鼠，分離出腫瘤，測量腫瘤體積并拍攝圖片。

1.9 T細(xì)胞體外殺傷實(shí)驗(yàn)

取荷瘤小鼠脾組織于70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)上，用注射器芯輕壓揉碎，PBS沖洗收集小鼠脾的懸液，按照CD8+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒說明分選出CD8+T細(xì)胞。將CD8+T細(xì)胞、穩(wěn)定過表達(dá)Siglec-15的MC38細(xì)胞株及對照細(xì)胞株以3∶1和5∶1有效靶比加入到96孔板中。共培養(yǎng)24 h，吸去含T細(xì)胞培養(yǎng)基并用PBS洗滌。每孔加入10 μL CCK-8溶液，置37℃孵育1～2 h，測定450 nm處的吸光度值[21]。

1.10 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將CD8+T細(xì)胞、穩(wěn)定過表達(dá)Siglec-15的MC38細(xì)胞株及對照細(xì)胞株，以5∶1的有效效靶比加入到96孔板中，CD8+T 細(xì)胞、MC-38細(xì)胞分別作為效應(yīng)細(xì)胞(effector cells，E)組和靶細(xì)胞(target cells, T)組。共培養(yǎng)24 h, 按照細(xì)胞毒性試劑盒說明書，測定吸光度A值。CD8+T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷率計(jì)算公式：腫瘤細(xì)胞裂解率(%)= (AE+T-AE-AT)/(AEmax-AE)×100%。其中，AEmax=靶細(xì)胞全部裂解后的A值。

1.11 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)

收集腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞懸液。4℃下，12 000 r/min離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新1.5 mL EP管中，分別使用小鼠IFN-γ、TNF-α ELISA試劑盒，測定上清液中IFN-γ與TNF-α含量。簡要步驟如下：配制標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)驗(yàn)樣本加入相應(yīng)孔中，每孔100 μL，封住反應(yīng)孔，室溫孵育2 h，洗板3次；在每個(gè)孔內(nèi)加入100 μL檢測抗體，室溫孵育2 h，洗板3次；在每個(gè)微孔內(nèi)加入100 μL稀釋好的鏈霉親和素-HRP，室溫避光孵育20 min后洗板3次；在每個(gè)微孔內(nèi)加入100 μL顯色底物，室溫避光孵育20 min；隨后在每個(gè)孔內(nèi)加入50 μL終止液，使用酶標(biāo)儀測量450 nm的吸光度值，設(shè)定540 nm或570 nm作為校正波長。

1.12 IHC染色

二甲苯脫蠟，經(jīng)各級濃度乙醇水化，置于枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液中，高壓抗原修復(fù)15 min后晾至室溫，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，5% BSA室溫封閉30 min，一抗37℃孵育1 h，PBS振蕩清洗后加二抗，DAB適度顯色，蘇木素復(fù)染30 s ～ 4 min，鹽酸乙醇溶液分化、脫水、透明和中性樹脂封片。以“染色陽性率評分(0分，陰性；1分，<25%；2分，25%-50%；3分，>50%)”以及“染色強(qiáng)度評分(0分，陰性；1分，弱陽；2分，中陽；3分，強(qiáng)陽)”乘積為總評分[22]進(jìn)行分組。根據(jù)評分中位值，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。所有的IHC染色結(jié)果均由兩位病理醫(yī)師經(jīng)雙盲法獨(dú)立評分。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有圖表使用GraphPad Prism 8制作，t檢驗(yàn)用于計(jì)算兩組之間的差異。所有數(shù)據(jù)以mean ±SD表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 唾液酸免疫球蛋白型凝集素-15在結(jié)直腸癌組織中的高表達(dá)

分析TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌與正常組織中Siglec-15 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Siglec-15 mRNA在癌組織中表達(dá)水平明顯高于正常組織(0.742 ± 1.823vs0.151 ± 0.293，P<0.01，F(xiàn)ig.1A)。為進(jìn)一步明確Siglec-15在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，IHC檢測52對結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中Siglec-15的表達(dá)，Siglec-15在結(jié)直腸癌組織中的免疫評分為5.221 ± 1.751，在癌旁組織中的免疫評分為2.212 ± 0.982。其結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。Sigec-15在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01，F(xiàn)ig.1B)。

Fig.1 Siglec-15 is highly expressed in CRC tissues (A) Expression of Siglec-15 in CRC tumors (n=568) and normal tissues (n=44) obtained from the TCGA database.(B) Representative results of Siglec-15 IHC in CRC tissues (n=52) and paired adjacent tissues (n=52).** P<0.01

2.2 敲減唾液酸免疫球蛋白型凝集素-15抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480的增殖和遷移

首先，研究了Siglec-15對CRC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。與正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞NCM460相比，人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480中Siglec-15的蛋白質(zhì)水平較高(Fig.2A)。穩(wěn)定敲減Siglec-15的細(xì)胞株SW480(Fig.2B)。CCK8結(jié)果顯示，敲減Siglec-15可抑制SW480細(xì)胞的增殖。其中，在72 h時(shí)，對照組A450值為1.266 ± 0.147，敲減Siglec-15組A450值為0.635 ± 0.095(P<0.01，F(xiàn)ig.2C)。劃痕結(jié)果表明，敲減Siglec-15在48 h時(shí)可抑制SW480細(xì)胞的遷移。對照組和敲減Siglec-15組48 h遷移率分別為42.860% ± 7.208%和20.470% ± 5.135%(P<0.05，F(xiàn)ig.2D)。

Fig.2 Knockdown of Siglec-15 inhibits the proliferation and migration of human colon cancer cell SW480 (A) Western blot showed Siglec-15 expression in NCM460 and SW480 cells. (B) Western blot was used to detect Siglec-15 knockdown efficiency in SW480 cells. (C) CCK8 assay showed that knockdown of Siglec-15 could inhibit the proliferation of SW480 cells. The data are presented as mean ± SD of three experiments. (D) Wound healing assay showed that Siglec-15 knockdown inhibited the migration of SW480 cells at 48 hours. The data are presented as mean ± SD of three experiments.*P<0.05, **P<0.01

2.3 過表達(dá)唾液酸免疫球蛋白型凝集素-15抑制CD8+T細(xì)胞的體外殺傷

本文探究了Siglec-15對CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的體外殺傷作用的影響。Western印跡檢測MC38細(xì)胞中Siglec-15過表達(dá)效率(Fig.3A)。分選荷瘤小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞與MC38細(xì)胞共培養(yǎng)，CCK8檢測MC38細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞殺傷的敏感性。結(jié)果顯示，以3∶1或5∶1效靶比共培養(yǎng)24 h時(shí)，過表達(dá)Siglec-15組中的MC38細(xì)胞的存活率高于對照組。其中，效靶比3∶1時(shí)，對照組和過表達(dá)Siglec-15組存活率分別為26.630% ± 3.800%和68.530% ± 1.966%(P<0.01)。效靶比5∶1時(shí)，對照組和過表達(dá)Siglec-15組存活率分別為29.600%± 7.532%和81.270% ± 19.360%(P<0.05，F(xiàn)ig.3B)。進(jìn)一步通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測Siglec-15對CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的體外殺傷作用。發(fā)現(xiàn)以效靶比5∶1共培養(yǎng)24 h時(shí)，對照組腫瘤細(xì)胞裂解率(44.530% ± 5.008%)高于過表達(dá)Siglec-15組腫瘤細(xì)胞裂解率(18.400% ± 2.800%)(P<0.01，F(xiàn)ig.3C)。ELISA檢測共培養(yǎng)上清液中的IFN-γ和TNF-α。結(jié)果顯示，過表達(dá)Siglec-15組分泌的IFN-γ和TNF-α含量較對照組分別下降了81.650 ± 10.630 pg/mL和206.300 ± 29.500 pg/mL(P<0.01，F(xiàn)ig.3D)。綜上所述，Siglec-15可能通過促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、遷移和抑制CD8+T細(xì)胞功能影響結(jié)直腸癌的進(jìn)展。

Fig.3 Overexpression of Siglec-15 inhibits the effect of CD8+ T cells in vitro (A) The overexpression of Siglec-15 in MC38 cells was analyzed by Western blot. (B) CCK8 assay was used to detect the killing effect of CD8+ T cells on tumor cells. (C) Cytotoxicity assay was used to detect the killing effect of CD8+ T cells on tumor cells. (D) Co-culture supernatants were subjected to ELISA to measure IFN-γ and TNF-α. Data (B-D) are presented as mean ± SD of three experiments. *P<0.05,**P<0.01

2.4 過表達(dá)唾液酸免疫球蛋白型凝集素-15促進(jìn)小鼠腫瘤生長

本文進(jìn)一步將穩(wěn)定過表達(dá)Siglec-15的MC38細(xì)胞及其對照細(xì)胞接種于C57BL/6雌鼠右腿皮下，在動物水平上研究Siglec-15對CRC腫瘤生長的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，與對照組相比，Siglec-15過表達(dá)組腫瘤生長速度快，體積較大(P<0.05)，對照組中有1只小鼠腫瘤完全消退(Fig.4A，B)。Western印跡結(jié)果顯示，荷瘤小鼠腫瘤組織中過表達(dá)組Siglec-15蛋白水平高(Fig.4C)。IHC分析2組腫瘤組織中Siglec-15的表達(dá)以及CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的浸潤。結(jié)果正如Fig.4D所示，對照組和Siglec-15過表達(dá)組，腫瘤組織中高倍鏡(× 400)5個(gè)隨機(jī)視野下CD4+T平均陽性細(xì)胞數(shù)分別為43.670 ± 4.163和11.670 ± 3.512(P<0.01)，CD8+T陽性細(xì)胞數(shù)分別為53.000 ± 7.937和12.670 ± 3.512(P<0.01)。

Fig.4 Overexpression of Siglec-15 promotes tumor growth in mice (A) Tumor growth curve in control and Siglec-15 overexpression group. (B) Images of subcutaneous tumors in mice. (C) Western blot was used to detect Siglec-15 level in tumor tissues. (D) IHC staining of CD4+ T cells and CD8+ T cells. The data represented mean ±SD (n=3).*P<0.05, ** P<0.01

2.5 唾液酸免疫球蛋白型凝集素-15異常表達(dá)抑制人結(jié)直腸癌組織中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的浸潤

ssGSEA結(jié)果顯示，Siglec-15高表達(dá)組中，CD4+T細(xì)胞浸潤減少(P<0.01)，CD8+T細(xì)胞浸潤也有所減少，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig.5A)。為進(jìn)一步驗(yàn)證生物信息學(xué)分析的結(jié)果，利用IHC對52例人結(jié)直腸癌組織進(jìn)行檢測，根據(jù)免疫評分的中位值分為Siglec-15低表達(dá)組和Siglec-15高表達(dá)組。在Siglec15低表達(dá)組和Siglec15高表達(dá)組中，CD4免疫評分分別為4.983 ± 1.726和3.851 ± 1.494，CD8免疫評分分別為2.800 ± 1.727和1.966 ± 0.972，表明Siglec15高表達(dá)組中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞浸潤明顯減少(P<0.05，F(xiàn)ig.5B)。

Fig.5 Aberrant expression of Siglec-15 inhibits infiltration of CD4+ T cells and CD8+ T cells in human CRC tissues (A) ssGSEA was used to analyze the infiltration level of 23 immune cells in Siglec-15 high and low expression group.(B) IHC staining of Siglec-15 and Immune scores of CD4+ T and CD8+ T cells in 52 cases of CRC, the data represented mean ± SD (n=52), compared with the Siglec15 low expression group. *P<0.05, ** P<0.01

3 討論

針對免疫檢查點(diǎn)開展的腫瘤免疫治療是近年來的研究熱點(diǎn)。Wang等[8]研究表明，Siglec-15有可能是一個(gè)補(bǔ)充治療靶點(diǎn)，可以為anti-PD-1/PD-L1 治療無響應(yīng)的患者提供新的治療選擇。Li等[11]通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CRC中Siglec-15的表達(dá)高于正常組織，但未在臨床組織中進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究除了分析TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌與正常組織中Siglec-15的mRNA表達(dá)水平以外，還對52例CRC患者癌組織及癌旁組織中Siglec-15表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Siglec-15在癌組織中高表達(dá)。此外，敲減Siglec-15能抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480的增殖和遷移，這表明Siglec-15可能有促進(jìn)CRC發(fā)生發(fā)展的作用。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在骨肉瘤細(xì)胞中,Siglec-15過表達(dá)能通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[13]；在肝癌中，Siglec-15 可通過調(diào)節(jié) CD44 蛋白的穩(wěn)定性促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移[14]；Siglec-15與腫瘤相關(guān)唾液酸-Tn抗原之間相互作用，通過DAP12-Syk途徑增強(qiáng)巨噬細(xì)胞TGF-β分泌，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[23]。以上研究表明，Siglec-15可能與多數(shù)腫瘤的惡性進(jìn)展相關(guān)。

作為新型的免疫抑制分子，巨噬細(xì)胞來源的Siglec-15可抑制人和小鼠T細(xì)胞的增殖和活性，并抑制IFN-γ和TNF-α的分泌。Siglec-15抗體阻斷可提高抗腫瘤免疫力，阻礙小鼠腫瘤生長[8]。本研究進(jìn)一步在小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞MC38中探究了Siglec-15對CD8+T細(xì)胞殺傷效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)在MC38細(xì)胞中過表達(dá)Siglec-15可抑制CD8+T細(xì)胞對CRC細(xì)胞的殺傷以及IFN-γ和TNF-α的分泌。綜上，本文的結(jié)果表明，Siglec-15可能通過促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖以及抑制CD8+T細(xì)胞功能從而影響結(jié)直腸癌的進(jìn)展。

腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。其中，CD4+T淋巴細(xì)胞可以表現(xiàn)出抗腫瘤或促腫瘤活性，CD8+T細(xì)胞浸潤與抗PD-1反應(yīng)和患者預(yù)后密切相關(guān)[24-27]。在膀胱癌中，生物信息學(xué)分析及63 例膀胱癌標(biāo)本免疫組化結(jié)果均顯示，Siglec15與腫瘤微環(huán)境中CD8+T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、Th1 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的浸潤水平呈負(fù)相關(guān)[28]；而在非小細(xì)胞肺癌中，Siglec-15表達(dá)與基質(zhì)中的 CD8+T 細(xì)胞密度呈正相關(guān)[29]。將B16-GMCSF腫瘤細(xì)胞移植到Siglec-15敲除小鼠，浸潤的CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞明顯增多，CD8+T細(xì)胞的IFN-γ等細(xì)胞因子的產(chǎn)生也明顯增多[8]。然而，Siglec-15與CRC腫瘤免疫微環(huán)境中，CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系并不明確。本研究表明，在動物水平上，過表達(dá)Siglec-15可促進(jìn)荷瘤小鼠腫瘤生長，并抑制CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的浸潤；生物信息學(xué)分析顯示，與Siglec-15低表達(dá)組相比，Siglec-15高表達(dá)組中CD4+T細(xì)胞浸潤減少，CD8+T細(xì)胞浸潤減少但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在人CRC組織標(biāo)本中，Siglec-15高表達(dá)組中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞浸潤減少且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明Siglec-15可能通過抑制免疫細(xì)胞浸潤促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展。

綜上所述，本研究表明，Siglec-15在CRC中異常表達(dá)，其可能通過促進(jìn)細(xì)胞增殖遷移、抑制CD8+T細(xì)胞功能以及抑制CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞浸潤等多方面因素影響結(jié)直腸癌進(jìn)展。然而，關(guān)于Siglec-15在CRC中異常表達(dá)的分子機(jī)制尚不清楚，Siglec-15與其他免疫檢查點(diǎn)聯(lián)合研究也仍需進(jìn)一步探討。