孟泳

河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002

支氣管哮喘簡(jiǎn)稱哮喘，是呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)的氣道慢性炎癥疾病，由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與，嚴(yán)重危害公眾健康[1-3]。氣道炎癥、黏液高分泌與嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)是支氣管哮喘的主要特征[4-6]，亦是誘發(fā)其反復(fù)發(fā)作的重要因素。小青龍湯出自《傷寒論》，具有溫肺化痰、止咳平喘之功?！秱摗け嫣?yáng)病脈證并治》曰：“傷寒表不解，心下有水氣……少腹?jié)M，或喘者，小青龍湯主之?！毖芯匡@示，小青龍湯可有效緩解支氣管哮喘患者的癥狀，改善哮喘患者肺功能，降低氣道炎癥[7-9]。現(xiàn)代藥理研究表明，小青龍湯具有抗感染、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗過(guò)敏、緩解氣道痙攣等功效[10-11]。既往研究發(fā)現(xiàn)，黏蛋白(mucin，Muc)5ac和Muc5b在哮喘模型中的高表達(dá)往往與氣道黏液高分泌呈正相關(guān)[12-13]。而關(guān)于小青龍湯是否通過(guò)調(diào)控Muc5ac與Muc5b緩解哮喘癥狀鮮有報(bào)道，基于此，本研究以哮喘大鼠為研究對(duì)象，探討小青龍湯對(duì)Muc5ac與Muc5b表達(dá)及氣道炎癥的影響，為小青龍湯防治哮喘提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物60只3月齡SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20) g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(豫)2019-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)條件為實(shí)驗(yàn)室室溫：(25±1)℃；相對(duì)濕度：(50±10)%；使用滅菌飼料與純水進(jìn)行喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)由河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)，倫理批號(hào)：PZ-HNSZYY-2022-020。所有實(shí)驗(yàn)大鼠的飼養(yǎng)、霧化、灌胃等嚴(yán)格遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理協(xié)會(huì)規(guī)定的動(dòng)物倫理福利條款進(jìn)行。

1.2 藥物與試劑氨溴索(規(guī)格：15 g/2 L，上海信誼藥業(yè)，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20057982)；雞卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)、氫氧化鋁[Al(OH)3](美國(guó)Sigma Aldrich公司，批號(hào)：SLBK6455V、WXBB1151V)；白細(xì)胞介素-13(interleukin-13，IL-13)、IL-6、IL-10、免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)、Muc5ac、Muc5b ELISA試劑盒(美國(guó)Cusabio公司、批號(hào)：CSB-E04602m、CSB-E04640r、CSB-E04594m、CSB-E08914m、CSB-E11040m、CSB-E15067m)；SYBR Green qPCR Mix熒光定量PCR試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司，批號(hào)：SJ6038-5)。

1.3 儀器RM2145 型自動(dòng)切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)；OLYMPUS-DP70 型顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)(日本奧林巴斯株式會(huì)社)；Image-Pro Plus 6.0 型專業(yè)圖像分析系統(tǒng)(美國(guó) Media Cybernetics公司)；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；LABOFUGE 400 R型低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Fine Pointe PFT型動(dòng)物肺功能檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Buxco公司)。

2 方法

2.1 藥物制備由河南省中醫(yī)院藥理實(shí)驗(yàn)室按小青龍湯的組成比例用水煎醇沉法制備小青龍湯提取液，具體如下：取小青龍湯組方藥材麻黃10 g，桂枝10 g，干姜15 g，細(xì)辛3 g，姜半夏15 g，甘草6 g，白芍10 g，五味子9 g，將上述藥品粉碎，水煎2次，合并濾液并蒸發(fā)水分成膏狀，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇沉淀，蒸干濾液，過(guò)大孔樹(shù)脂。再用水和體積分?jǐn)?shù)40%乙醇、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫后，除盡溶劑，配制成2 kg·L-1(含生藥)水溶液，備用。

2.2 動(dòng)物分組、造模與給藥60只SPF級(jí)SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、氨溴索組、小青龍湯高劑量組、小青龍湯中劑量組及小青龍湯低劑量組，每組10只。除對(duì)照組外，其余組大鼠建立支氣管哮喘模型[14]，具體如下：造模大鼠分別于第1天、第7天及第14天腹腔注射質(zhì)量濃度10%OVA/Al(OH)3混懸液[0.1 g OVA和0.1 g Al(OH)3溶于生理鹽水混合液]1 mL致敏，并于第15天開(kāi)始霧化吸入含1%OVA的生理鹽水霧化激發(fā)，隔日1次，每次 30 min，共計(jì)2周，以大鼠出現(xiàn)呼吸急促、抓耳撓腮、行動(dòng)遲緩等行為為模型建立成功。對(duì)照組大鼠分別使用生理鹽水進(jìn)行腹腔注射和霧化。造模成功后，小青龍湯低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠分別給予 14 g·kg-1、7 g·kg-1、3.5 g·kg-1的小青龍湯溶液灌胃[15]，氨溴索組大鼠灌胃給予15 mg·kg-1氨溴索，對(duì)照組及模型組灌胃給予等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 肺功能及氣道阻力末次灌胃給藥24 h后，腹腔注射水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉大鼠。將大鼠固定在操作臺(tái)上，局部消毒頸部皮膚，沿中線剪開(kāi)胸腹腔皮膚直至頸部，鈍性分離皮下組織，暴露氣管。在氣管環(huán)狀軟骨下剪小口，插入18 G注射器針頭(尖頭磨平)并結(jié)扎固定，連接大鼠肺功能儀檢測(cè)大鼠肺功能，記錄第0.3秒用力呼氣容積(forced expiratory volume，F(xiàn)EV0.3)、用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)和呼氣峰流量(peak expiratory flow，PEF)值。通氣數(shù)分鐘后，測(cè)大鼠呼吸道阻力(air way resistance，R)作為基礎(chǔ)值，給予大鼠霧化，依次吸入蒸餾水、不同濃度(0 g·L-1，4 g·L-1，8 g·L-1，12 g·L-1、16 g·L-1)的乙酰甲膽堿各15 s后記錄氣道阻力值。

2.3.2 肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞分類計(jì)數(shù)在取材前將大鼠禁食不禁水12 h，處死動(dòng)物，剝離出肺組織和氣管，用4 ℃生理鹽水注入左支氣管進(jìn)行灌注，每次2 mL，灌注3次，每次灌注完成后反復(fù)抽吸3次，回收肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid，BALF)并離心，去上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆?，底層?xì)胞用瑞氏-姬姆薩進(jìn)行復(fù)合染色，計(jì)數(shù)BALF中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目。

2.3.3 BALF中細(xì)胞因子水平采用ELISA試劑盒檢測(cè)BALF中IL-13、IL-6、IgE、IL-10、Muc5ac以及Muc5b水平，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求。

2.3.4 肺組織Muc5acmRNA、Muc5bmRNA表達(dá)水平采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)肺組織Muc5acmRNA、Muc5bmRNA表達(dá)水平。稱取肺組織50 mg，加入1 mL Trizol，在液氮中充分研碎后室溫靜置5 min；加入 0.2 mL 氯仿，充分震蕩，靜置3 min；4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，移上清至新的EP管；加入與上清等量的-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，混勻，冰浴10 min；4 ℃ 12 000 r·min-1離心 15 min，棄上清；加入1 mL 75%乙醇，混勻，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min，棄上清；75%乙醇重復(fù)洗滌1次，棄上清，室溫晾干20 min，加入20 μL DEPC水，將得到的RNA充分溶解。進(jìn)行總RNA提取及RNA樣本純度測(cè)定后將提取得到的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green qPCR Mix試劑進(jìn)行熒光定量PCR。引物由深圳市豪地華拓生物科技有限公司合成，引物序列如下：Muc5ac正向：5′-GTGTCGGCCGGAGAAA-GTTGGT-3′，反向5′-GTCCTGTTGAGCCTGGCCTGTG-3′；Muc5b正向：5′-TTACACCTGGCACACAATGG-3′，反向5′-TCCAGCTTCTGCAAGTTTCC-3′；β-actin正向5′-CTGTGTACTGAGCATTCCTGTGACT-3′，β-actin反向 5′-AGCCTCCTGTAGAGCTGTGACTGAA-3′。反應(yīng)體系：正向引物 1 μL、反向引物1 μL、cDNA 2 μL、SYBR Green qPCR Mix 3 μL、雙蒸水(ddH2O)8 μL。PCR循環(huán)條件如下：95℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 10 s，60 ℃退火、延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。使用β-actinmRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以 2-ΔΔCt表示待測(cè)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肺功能比較與對(duì)照組比較，模型組大鼠FEV0.3、FVC和PEF降低；與模型組比較，小青龍湯各劑量組FEV0.3、FVC和PEF升高，且呈劑量依賴性，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組哮喘大鼠肺功能指標(biāo)比較

3.2 小青龍湯對(duì)大鼠氣道反應(yīng)性的影響激發(fā)前，與對(duì)照組比較，模型組大鼠氣道阻力升高；與模型組比較，各給藥組大鼠氣道阻均降低。在經(jīng)不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)后，與對(duì)照組比較，模型組哮喘大鼠氣道阻力值升高；與模型組比較，小青龍湯各劑量組哮喘大鼠氣道阻力值降低，且呈劑量依賴性；與 0 g·L-1乙酰甲膽堿激發(fā)比較，隨著乙酰甲膽堿濃度的升高，模型組、氨溴索組及不同濃度的小青龍湯組氣道阻力均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 小青龍湯對(duì)不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)后各組哮喘大鼠氣道阻力的影響

3.3 各組哮喘大鼠BALF中炎性細(xì)胞數(shù)量比較與對(duì)照組比較，模型組哮喘大鼠BALF中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目均升高；與模型組比較，小青龍湯各劑量組哮喘大鼠BALF中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目降低，且呈劑量依賴性，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組哮喘大鼠BALF中炎性細(xì)胞數(shù)量比較

3.4 各組哮喘大鼠BALF中IL-13、IL-6、IgE及IL-10水平比較與對(duì)照組比較，模型組哮喘大鼠BALF中IL-13、IL-6、IgE的水平升高，IL-10的水平降低；與模型組比較，小青龍湯各劑量組哮喘大鼠BALF中IL-13、IL-6、IgE的水平降低，IL-10的水平升高，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組哮喘大鼠BALF中IL-13、IL-6、IgE及IL-10水平比較

3.5 各組哮喘大鼠BALF中Muc5ac、Muc5b蛋白

表達(dá)含量比較與對(duì)照組比較，模型組哮喘大鼠BALF中Muc5ac、Muc5b蛋白表達(dá)水平升高；與模型組比較，小青龍湯各劑量組哮喘大鼠BALF中Muc5ac、Muc5b蛋白表達(dá)水平降低，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組哮喘大鼠BALF中Muc5ac、Muc5b蛋白表達(dá)含量比較

3.6 各組哮喘大鼠肺組織Muc5acmRNA與Muc5bmRNA表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較，模型組哮喘大鼠肺組織Muc5acmRNA、Muc5bmRNA水平升高；與模型組比較，小青龍湯各劑量組哮喘大鼠肺組織Muc5acmRNA、Muc5bmRNA水平降低，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 各組哮喘大鼠肺組織Muc5ac mRNA與Muc5b mRNA表達(dá)水平比較

4 討論

哮喘屬中醫(yī)學(xué)的“哮病”“喘證”等范疇，其病位在肺，常累及脾腎二臟，痰為其主要病理因素。哮喘以正氣虛弱、肺衛(wèi)不固為主，又受六淫邪氣、飲食勞倦等因素刺激，導(dǎo)致痰濁壅塞氣道，肺的宣發(fā)肅降功能失常，臨床以“咳嗽、胸悶、氣短”等癥狀為主?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，黏液高分泌、氣管高反應(yīng)性與氣道炎癥等特征是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要因素[16]。既往研究發(fā)現(xiàn)，氨溴索對(duì)哮喘氣道黏液高分泌有明顯抑制作用[17]。因此，選用氨溴索作為本研究的陽(yáng)性對(duì)照藥物。

小青龍湯由麻黃、桂枝、干姜、細(xì)辛、姜半夏、甘草、白芍、五味子組成，具有溫肺化痰、止咳平喘之功?！夺t(yī)宗金鑒》所載：“表實(shí)無(wú)汗，故合麻桂二方以解外，佐干姜、細(xì)辛，極溫極散使寒與水俱得以汗而解；佐半夏逐痰飲，以清不盡之飲；佐五味收肺氣，以斂耗傷之氣”。麻黃，首次記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有發(fā)汗平喘、抗氧化等藥理活性[18]。桂枝具有抗菌、調(diào)節(jié)免疫功能、抗感染、抗過(guò)敏等藥理作用[19]。干姜成分復(fù)雜，具有抗炎殺菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等功效[20]。細(xì)辛的揮發(fā)油作為其主要的有效成分，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗感染等藥理作用[21]。姜半夏中含有有機(jī)酸、多糖等多種有效化學(xué)成分，具有止咳平喘、抗炎等藥理作用[22]。白芍可通過(guò)調(diào)節(jié)Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)/核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)等多種炎癥通路達(dá)到免疫調(diào)節(jié)、抗炎等作用[23]。五味子作為臨床常用的中藥之一，《神農(nóng)本草經(jīng)》中所載：“主益氣，咳逆上氣”，對(duì)免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)都有良好的調(diào)節(jié)作用[24]?，F(xiàn)代藥理研究表明，小青龍湯的藥效在于對(duì)氣道異常分泌進(jìn)行抑制，同時(shí)刺激氣道平滑肌的擴(kuò)張，減輕毛細(xì)血管通透性[25]，對(duì)炎癥水平、氣道重塑都有一定的抑制作用[26-27]。

哮喘作為一種氣道慢性炎癥性疾病，在疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，炎癥反應(yīng)發(fā)揮著重要作用，BALF中的IL-13、IL-6、IgE及IL-10等細(xì)胞因子水平與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目可直接反映大鼠肺組織的炎癥水平。當(dāng)機(jī)體接觸變應(yīng)原后，輔助性T細(xì)胞(helper T cells，Th)亞群釋放IL-13等細(xì)胞因子，在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。IL-6 主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)其分化，參與炎癥損傷和免疫應(yīng)答過(guò)程[28]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可刺激T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-4等炎癥因子，可使肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞遷移至呼吸道，參與氣道炎癥反應(yīng)[29]。此外，臨床研究證實(shí)，痰中IL-6水平升高提示患者哮喘控制不佳，肺功能下降[30]。在哮喘的發(fā)病中，作為免疫球蛋白的一種，IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)起著重要的作用，并且IgE水平與氣道炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性有關(guān)，血清IgE水平增高，則提示有氣道高反應(yīng)性存在[31]。鐘志娟等研究者發(fā)現(xiàn)，抑制IgE水平的表達(dá)，患者哮喘癥狀及體征明顯減輕[32]。既往文獻(xiàn)顯示，哮喘患者通常伴隨不同程度的氣道炎癥反應(yīng)，體內(nèi)的IL-6、IL-13等促炎性因子會(huì)以不同方式參與哮喘的發(fā)生發(fā)展；而IL-10作為抗炎因子，其升高可抑制機(jī)體內(nèi)的過(guò)度炎性反應(yīng)[33]。哮喘大鼠的肺功能指標(biāo)可反映哮喘大鼠的氣道高反應(yīng)性，本研究采用腹腔注射OVA致敏與霧化吸入OVA激發(fā)誘導(dǎo)建立哮喘大鼠模型，可發(fā)現(xiàn)大鼠呼吸急促，撓鼻、打噴嚏及喘息等行為，大鼠的氣道阻力值升高，且BALF上清液中IL-13、IL-6、IgE及 IL-10 等細(xì)胞因子水平含量明顯變化，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目升高，哮喘大鼠出現(xiàn)肺組織炎癥反應(yīng)，提示哮喘模型建立成功。給予小青龍湯干預(yù)后，能有效降低氣道高反應(yīng)性，改善肺功能指標(biāo)(FEV0.3、FVC和PEF)，減輕炎癥反應(yīng)(巨噬細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞)，下調(diào)IL-13、IL-6、IgE水平，上調(diào) IL-10 水平。

本研究從中醫(yī)哮病以痰為病理因素著手，從黏液高分泌這一角度探討小青龍湯治療哮喘的作用機(jī)制。黏液高分泌是哮喘復(fù)發(fā)與加重的重要因素。黏液的主要組分為分泌細(xì)胞分泌的黏蛋白，Muc5ac和Muc5b是兩種分泌型黏蛋白聚合復(fù)合物，位于氣道上皮杯狀細(xì)胞內(nèi)，氣道杯狀細(xì)胞異常增生及氣道黏液的高分泌狀態(tài)可體現(xiàn)其高表達(dá)水平[34]。Muc5ac在哮喘模型中的高表達(dá)與氣道的黏液高分泌呈正相關(guān)，可加重氣道平滑肌收縮，并誘發(fā)氣道高反應(yīng)；而Muc5b則更傾向于體現(xiàn)氣道的黏液清除力和氣道防御能力。研究顯示，Muc5b缺陷的小鼠會(huì)誘發(fā)氣道的慢性細(xì)菌感染，并進(jìn)一步導(dǎo)致嚴(yán)重的氣道炎癥，甚則氣道阻塞[35-37]。本研究發(fā)現(xiàn)，小青龍湯可明顯抑制Muc5ac、Muc5b的表達(dá)，減輕哮喘大鼠黏液高分泌，改善哮喘癥狀。

綜上所述，小青龍湯可有效抑制哮喘大鼠的黏液分泌及氣道炎癥，緩解哮喘大鼠癥狀，其作用機(jī)制可能與抑制黏蛋白Muc5ac、Muc5b的水平而降低黏液高分泌有關(guān)，為臨床防治哮喘提供了新的思路。