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        小青龍湯對(duì)支氣管哮喘大鼠黏液高分泌及氣道炎癥的影響*

        2022-09-07 00:54:14孟泳
        河南中醫(yī) 2022年10期
        關(guān)鍵詞:小青龍湯黏液氣道

        孟泳

        河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,河南省中醫(yī)院,河南 鄭州 450002

        支氣管哮喘簡(jiǎn)稱哮喘,是呼吸系統(tǒng)常見的氣道慢性炎癥疾病,由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與,嚴(yán)重危害公眾健康[1-3]。氣道炎癥、黏液高分泌與嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)是支氣管哮喘的主要特征[4-6],亦是誘發(fā)其反復(fù)發(fā)作的重要因素。小青龍湯出自《傷寒論》,具有溫肺化痰、止咳平喘之功?!秱摗け嫣?yáng)病脈證并治》曰:“傷寒表不解,心下有水氣……少腹?jié)M,或喘者,小青龍湯主之。”研究顯示,小青龍湯可有效緩解支氣管哮喘患者的癥狀,改善哮喘患者肺功能,降低氣道炎癥[7-9]?,F(xiàn)代藥理研究表明,小青龍湯具有抗感染、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗過敏、緩解氣道痙攣等功效[10-11]。既往研究發(fā)現(xiàn),黏蛋白(mucin,Muc)5ac和Muc5b在哮喘模型中的高表達(dá)往往與氣道黏液高分泌呈正相關(guān)[12-13]。而關(guān)于小青龍湯是否通過調(diào)控Muc5ac與Muc5b緩解哮喘癥狀鮮有報(bào)道,基于此,本研究以哮喘大鼠為研究對(duì)象,探討小青龍湯對(duì)Muc5ac與Muc5b表達(dá)及氣道炎癥的影響,為小青龍湯防治哮喘提供一定的科學(xué)依據(jù)。

        1 材料

        1.1 動(dòng)物60只3月齡SPF級(jí)SD大鼠,雌雄各半,體質(zhì)量(200±20) g,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK(豫)2019-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)條件為實(shí)驗(yàn)室室溫:(25±1)℃;相對(duì)濕度:(50±10)%;使用滅菌飼料與純水進(jìn)行喂養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)由河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過,倫理批號(hào):PZ-HNSZYY-2022-020。所有實(shí)驗(yàn)大鼠的飼養(yǎng)、霧化、灌胃等嚴(yán)格遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理協(xié)會(huì)規(guī)定的動(dòng)物倫理福利條款進(jìn)行。

        1.2 藥物與試劑氨溴索(規(guī)格:15 g/2 L,上海信誼藥業(yè),國(guó)藥準(zhǔn)字:H20057982);雞卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)、氫氧化鋁[Al(OH)3](美國(guó)Sigma Aldrich公司,批號(hào):SLBK6455V、WXBB1151V);白細(xì)胞介素-13(interleukin-13,IL-13)、IL-6、IL-10、免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)、Muc5ac、Muc5b ELISA試劑盒(美國(guó)Cusabio公司、批號(hào):CSB-E04602m、CSB-E04640r、CSB-E04594m、CSB-E08914m、CSB-E11040m、CSB-E15067m);SYBR Green qPCR Mix熒光定量PCR試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司,批號(hào):SJ6038-5)。

        1.3 儀器RM2145 型自動(dòng)切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司);OLYMPUS-DP70 型顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)(日本奧林巴斯株式會(huì)社);Image-Pro Plus 6.0 型專業(yè)圖像分析系統(tǒng)(美國(guó) Media Cybernetics公司);DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);LABOFUGE 400 R型低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司);Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);Fine Pointe PFT型動(dòng)物肺功能檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Buxco公司)。

        2 方法

        2.1 藥物制備由河南省中醫(yī)院藥理實(shí)驗(yàn)室按小青龍湯的組成比例用水煎醇沉法制備小青龍湯提取液,具體如下:取小青龍湯組方藥材麻黃10 g,桂枝10 g,干姜15 g,細(xì)辛3 g,姜半夏15 g,甘草6 g,白芍10 g,五味子9 g,將上述藥品粉碎,水煎2次,合并濾液并蒸發(fā)水分成膏狀,用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇沉淀,蒸干濾液,過大孔樹脂。再用水和體積分?jǐn)?shù)40%乙醇、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫后,除盡溶劑,配制成2 kg·L-1(含生藥)水溶液,備用。

        2.2 動(dòng)物分組、造模與給藥60只SPF級(jí)SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、氨溴索組、小青龍湯高劑量組、小青龍湯中劑量組及小青龍湯低劑量組,每組10只。除對(duì)照組外,其余組大鼠建立支氣管哮喘模型[14],具體如下:造模大鼠分別于第1天、第7天及第14天腹腔注射質(zhì)量濃度10%OVA/Al(OH)3混懸液[0.1 g OVA和0.1 g Al(OH)3溶于生理鹽水混合液]1 mL致敏,并于第15天開始霧化吸入含1%OVA的生理鹽水霧化激發(fā),隔日1次,每次 30 min,共計(jì)2周,以大鼠出現(xiàn)呼吸急促、抓耳撓腮、行動(dòng)遲緩等行為為模型建立成功。對(duì)照組大鼠分別使用生理鹽水進(jìn)行腹腔注射和霧化。造模成功后,小青龍湯低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠分別給予 14 g·kg-1、7 g·kg-1、3.5 g·kg-1的小青龍湯溶液灌胃[15],氨溴索組大鼠灌胃給予15 mg·kg-1氨溴索,對(duì)照組及模型組灌胃給予等量生理鹽水,每天1次,連續(xù)14 d。

        2.3 觀察指標(biāo)

        2.3.1 肺功能及氣道阻力末次灌胃給藥24 h后,腹腔注射水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉大鼠。將大鼠固定在操作臺(tái)上,局部消毒頸部皮膚,沿中線剪開胸腹腔皮膚直至頸部,鈍性分離皮下組織,暴露氣管。在氣管環(huán)狀軟骨下剪小口,插入18 G注射器針頭(尖頭磨平)并結(jié)扎固定,連接大鼠肺功能儀檢測(cè)大鼠肺功能,記錄第0.3秒用力呼氣容積(forced expiratory volume,F(xiàn)EV0.3)、用力肺活量(forced vital capacity,F(xiàn)VC)和呼氣峰流量(peak expiratory flow,PEF)值。通氣數(shù)分鐘后,測(cè)大鼠呼吸道阻力(air way resistance,R)作為基礎(chǔ)值,給予大鼠霧化,依次吸入蒸餾水、不同濃度(0 g·L-1,4 g·L-1,8 g·L-1,12 g·L-1、16 g·L-1)的乙酰甲膽堿各15 s后記錄氣道阻力值。

        2.3.2 肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞分類計(jì)數(shù)在取材前將大鼠禁食不禁水12 h,處死動(dòng)物,剝離出肺組織和氣管,用4 ℃生理鹽水注入左支氣管進(jìn)行灌注,每次2 mL,灌注3次,每次灌注完成后反復(fù)抽吸3次,回收肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid,BALF)并離心,去上清液,-80 ℃保存?zhèn)溆茫讓蛹?xì)胞用瑞氏-姬姆薩進(jìn)行復(fù)合染色,計(jì)數(shù)BALF中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目。

        2.3.3 BALF中細(xì)胞因子水平采用ELISA試劑盒檢測(cè)BALF中IL-13、IL-6、IgE、IL-10、Muc5ac以及Muc5b水平,所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書的要求。

        2.3.4 肺組織Muc5acmRNA、Muc5bmRNA表達(dá)水平采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)肺組織Muc5acmRNA、Muc5bmRNA表達(dá)水平。稱取肺組織50 mg,加入1 mL Trizol,在液氮中充分研碎后室溫靜置5 min;加入 0.2 mL 氯仿,充分震蕩,靜置3 min;4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min,移上清至新的EP管;加入與上清等量的-20 ℃預(yù)冷的異丙醇,混勻,冰浴10 min;4 ℃ 12 000 r·min-1離心 15 min,棄上清;加入1 mL 75%乙醇,混勻,4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min,棄上清;75%乙醇重復(fù)洗滌1次,棄上清,室溫晾干20 min,加入20 μL DEPC水,將得到的RNA充分溶解。進(jìn)行總RNA提取及RNA樣本純度測(cè)定后將提取得到的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用SYBR Green qPCR Mix試劑進(jìn)行熒光定量PCR。引物由深圳市豪地華拓生物科技有限公司合成,引物序列如下:Muc5ac正向:5′-GTGTCGGCCGGAGAAA-GTTGGT-3′,反向5′-GTCCTGTTGAGCCTGGCCTGTG-3′;Muc5b正向:5′-TTACACCTGGCACACAATGG-3′,反向5′-TCCAGCTTCTGCAAGTTTCC-3′;β-actin正向5′-CTGTGTACTGAGCATTCCTGTGACT-3′,β-actin反向 5′-AGCCTCCTGTAGAGCTGTGACTGAA-3′。反應(yīng)體系:正向引物 1 μL、反向引物1 μL、cDNA 2 μL、SYBR Green qPCR Mix 3 μL、雙蒸水(ddH2O)8 μL。PCR循環(huán)條件如下:95℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性 10 s,60 ℃退火、延伸30 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。使用β-actinmRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,以 2-ΔΔCt表示待測(cè)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

        3 結(jié)果

        3.1 各組大鼠肺功能比較與對(duì)照組比較,模型組大鼠FEV0.3、FVC和PEF降低;與模型組比較,小青龍湯各劑量組FEV0.3、FVC和PEF升高,且呈劑量依賴性,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

        表1 各組哮喘大鼠肺功能指標(biāo)比較

        3.2 小青龍湯對(duì)大鼠氣道反應(yīng)性的影響激發(fā)前,與對(duì)照組比較,模型組大鼠氣道阻力升高;與模型組比較,各給藥組大鼠氣道阻均降低。在經(jīng)不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)后,與對(duì)照組比較,模型組哮喘大鼠氣道阻力值升高;與模型組比較,小青龍湯各劑量組哮喘大鼠氣道阻力值降低,且呈劑量依賴性;與 0 g·L-1乙酰甲膽堿激發(fā)比較,隨著乙酰甲膽堿濃度的升高,模型組、氨溴索組及不同濃度的小青龍湯組氣道阻力均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

        表2 小青龍湯對(duì)不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)后各組哮喘大鼠氣道阻力的影響

        3.3 各組哮喘大鼠BALF中炎性細(xì)胞數(shù)量比較與對(duì)照組比較,模型組哮喘大鼠BALF中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目均升高;與模型組比較,小青龍湯各劑量組哮喘大鼠BALF中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目降低,且呈劑量依賴性,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表3。

        表3 各組哮喘大鼠BALF中炎性細(xì)胞數(shù)量比較

        3.4 各組哮喘大鼠BALF中IL-13、IL-6、IgE及IL-10水平比較與對(duì)照組比較,模型組哮喘大鼠BALF中IL-13、IL-6、IgE的水平升高,IL-10的水平降低;與模型組比較,小青龍湯各劑量組哮喘大鼠BALF中IL-13、IL-6、IgE的水平降低,IL-10的水平升高,且呈劑量依賴性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

        表4 各組哮喘大鼠BALF中IL-13、IL-6、IgE及IL-10水平比較

        3.5 各組哮喘大鼠BALF中Muc5ac、Muc5b蛋白

        表達(dá)含量比較與對(duì)照組比較,模型組哮喘大鼠BALF中Muc5ac、Muc5b蛋白表達(dá)水平升高;與模型組比較,小青龍湯各劑量組哮喘大鼠BALF中Muc5ac、Muc5b蛋白表達(dá)水平降低,且呈劑量依賴性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

        表5 各組哮喘大鼠BALF中Muc5ac、Muc5b蛋白表達(dá)含量比較

        3.6 各組哮喘大鼠肺組織Muc5acmRNA與Muc5bmRNA表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較,模型組哮喘大鼠肺組織Muc5acmRNA、Muc5bmRNA水平升高;與模型組比較,小青龍湯各劑量組哮喘大鼠肺組織Muc5acmRNA、Muc5bmRNA水平降低,且呈劑量依賴性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

        表6 各組哮喘大鼠肺組織Muc5ac mRNA與Muc5b mRNA表達(dá)水平比較

        4 討論

        哮喘屬中醫(yī)學(xué)的“哮病”“喘證”等范疇,其病位在肺,常累及脾腎二臟,痰為其主要病理因素。哮喘以正氣虛弱、肺衛(wèi)不固為主,又受六淫邪氣、飲食勞倦等因素刺激,導(dǎo)致痰濁壅塞氣道,肺的宣發(fā)肅降功能失常,臨床以“咳嗽、胸悶、氣短”等癥狀為主。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,黏液高分泌、氣管高反應(yīng)性與氣道炎癥等特征是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要因素[16]。既往研究發(fā)現(xiàn),氨溴索對(duì)哮喘氣道黏液高分泌有明顯抑制作用[17]。因此,選用氨溴索作為本研究的陽(yáng)性對(duì)照藥物。

        小青龍湯由麻黃、桂枝、干姜、細(xì)辛、姜半夏、甘草、白芍、五味子組成,具有溫肺化痰、止咳平喘之功?!夺t(yī)宗金鑒》所載:“表實(shí)無(wú)汗,故合麻桂二方以解外,佐干姜、細(xì)辛,極溫極散使寒與水俱得以汗而解;佐半夏逐痰飲,以清不盡之飲;佐五味收肺氣,以斂耗傷之氣”。麻黃,首次記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有發(fā)汗平喘、抗氧化等藥理活性[18]。桂枝具有抗菌、調(diào)節(jié)免疫功能、抗感染、抗過敏等藥理作用[19]。干姜成分復(fù)雜,具有抗炎殺菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等功效[20]。細(xì)辛的揮發(fā)油作為其主要的有效成分,具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗感染等藥理作用[21]。姜半夏中含有有機(jī)酸、多糖等多種有效化學(xué)成分,具有止咳平喘、抗炎等藥理作用[22]。白芍可通過調(diào)節(jié)Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)/核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)等多種炎癥通路達(dá)到免疫調(diào)節(jié)、抗炎等作用[23]。五味子作為臨床常用的中藥之一,《神農(nóng)本草經(jīng)》中所載:“主益氣,咳逆上氣”,對(duì)免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)都有良好的調(diào)節(jié)作用[24]?,F(xiàn)代藥理研究表明,小青龍湯的藥效在于對(duì)氣道異常分泌進(jìn)行抑制,同時(shí)刺激氣道平滑肌的擴(kuò)張,減輕毛細(xì)血管通透性[25],對(duì)炎癥水平、氣道重塑都有一定的抑制作用[26-27]。

        哮喘作為一種氣道慢性炎癥性疾病,在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中,炎癥反應(yīng)發(fā)揮著重要作用,BALF中的IL-13、IL-6、IgE及IL-10等細(xì)胞因子水平與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目可直接反映大鼠肺組織的炎癥水平。當(dāng)機(jī)體接觸變應(yīng)原后,輔助性T細(xì)胞(helper T cells,Th)亞群釋放IL-13等細(xì)胞因子,在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。IL-6 主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,可刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)其分化,參與炎癥損傷和免疫應(yīng)答過程[28]。研究發(fā)現(xiàn),IL-6可刺激T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-4等炎癥因子,可使肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞遷移至呼吸道,參與氣道炎癥反應(yīng)[29]。此外,臨床研究證實(shí),痰中IL-6水平升高提示患者哮喘控制不佳,肺功能下降[30]。在哮喘的發(fā)病中,作為免疫球蛋白的一種,IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)起著重要的作用,并且IgE水平與氣道炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性有關(guān),血清IgE水平增高,則提示有氣道高反應(yīng)性存在[31]。鐘志娟等研究者發(fā)現(xiàn),抑制IgE水平的表達(dá),患者哮喘癥狀及體征明顯減輕[32]。既往文獻(xiàn)顯示,哮喘患者通常伴隨不同程度的氣道炎癥反應(yīng),體內(nèi)的IL-6、IL-13等促炎性因子會(huì)以不同方式參與哮喘的發(fā)生發(fā)展;而IL-10作為抗炎因子,其升高可抑制機(jī)體內(nèi)的過度炎性反應(yīng)[33]。哮喘大鼠的肺功能指標(biāo)可反映哮喘大鼠的氣道高反應(yīng)性,本研究采用腹腔注射OVA致敏與霧化吸入OVA激發(fā)誘導(dǎo)建立哮喘大鼠模型,可發(fā)現(xiàn)大鼠呼吸急促,撓鼻、打噴嚏及喘息等行為,大鼠的氣道阻力值升高,且BALF上清液中IL-13、IL-6、IgE及 IL-10 等細(xì)胞因子水平含量明顯變化,巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)目升高,哮喘大鼠出現(xiàn)肺組織炎癥反應(yīng),提示哮喘模型建立成功。給予小青龍湯干預(yù)后,能有效降低氣道高反應(yīng)性,改善肺功能指標(biāo)(FEV0.3、FVC和PEF),減輕炎癥反應(yīng)(巨噬細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞),下調(diào)IL-13、IL-6、IgE水平,上調(diào) IL-10 水平。

        本研究從中醫(yī)哮病以痰為病理因素著手,從黏液高分泌這一角度探討小青龍湯治療哮喘的作用機(jī)制。黏液高分泌是哮喘復(fù)發(fā)與加重的重要因素。黏液的主要組分為分泌細(xì)胞分泌的黏蛋白,Muc5ac和Muc5b是兩種分泌型黏蛋白聚合復(fù)合物,位于氣道上皮杯狀細(xì)胞內(nèi),氣道杯狀細(xì)胞異常增生及氣道黏液的高分泌狀態(tài)可體現(xiàn)其高表達(dá)水平[34]。Muc5ac在哮喘模型中的高表達(dá)與氣道的黏液高分泌呈正相關(guān),可加重氣道平滑肌收縮,并誘發(fā)氣道高反應(yīng);而Muc5b則更傾向于體現(xiàn)氣道的黏液清除力和氣道防御能力。研究顯示,Muc5b缺陷的小鼠會(huì)誘發(fā)氣道的慢性細(xì)菌感染,并進(jìn)一步導(dǎo)致嚴(yán)重的氣道炎癥,甚則氣道阻塞[35-37]。本研究發(fā)現(xiàn),小青龍湯可明顯抑制Muc5ac、Muc5b的表達(dá),減輕哮喘大鼠黏液高分泌,改善哮喘癥狀。

        綜上所述,小青龍湯可有效抑制哮喘大鼠的黏液分泌及氣道炎癥,緩解哮喘大鼠癥狀,其作用機(jī)制可能與抑制黏蛋白Muc5ac、Muc5b的水平而降低黏液高分泌有關(guān),為臨床防治哮喘提供了新的思路。

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