孟泳

河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002

支氣管哮喘簡稱哮喘，是呼吸系統(tǒng)常見的氣道慢性炎癥疾病，由多種細胞和細胞組分參與，嚴重危害公眾健康[1-3]。氣道炎癥、黏液高分泌與嗜酸性粒細胞浸潤是支氣管哮喘的主要特征[4-6]，亦是誘發(fā)其反復發(fā)作的重要因素。小青龍湯出自《傷寒論》，具有溫肺化痰、止咳平喘之功?！秱摗け嫣柌∶}證并治》曰：“傷寒表不解，心下有水氣……少腹?jié)M，或喘者，小青龍湯主之。”研究顯示，小青龍湯可有效緩解支氣管哮喘患者的癥狀，改善哮喘患者肺功能，降低氣道炎癥[7-9]?，F(xiàn)代藥理研究表明，小青龍湯具有抗感染、調(diào)節(jié)機體免疫、抗過敏、緩解氣道痙攣等功效[10-11]。既往研究發(fā)現(xiàn)，黏蛋白(mucin，Muc)5ac和Muc5b在哮喘模型中的高表達往往與氣道黏液高分泌呈正相關[12-13]。而關于小青龍湯是否通過調(diào)控Muc5ac與Muc5b緩解哮喘癥狀鮮有報道，基于此，本研究以哮喘大鼠為研究對象，探討小青龍湯對Muc5ac與Muc5b表達及氣道炎癥的影響，為小青龍湯防治哮喘提供一定的科學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物60只3月齡SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20) g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(豫)2019-0002。動物飼養(yǎng)條件為實驗室室溫：(25±1)℃；相對濕度：(50±10)%；使用滅菌飼料與純水進行喂養(yǎng)。本實驗由河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院)實驗動物倫理委員會審查通過，倫理批號：PZ-HNSZYY-2022-020。所有實驗大鼠的飼養(yǎng)、霧化、灌胃等嚴格遵照實驗動物倫理協(xié)會規(guī)定的動物倫理福利條款進行。

1.2 藥物與試劑氨溴索(規(guī)格：15 g/2 L，上海信誼藥業(yè)，國藥準字：H20057982)；雞卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)、氫氧化鋁[Al(OH)3](美國Sigma Aldrich公司，批號：SLBK6455V、WXBB1151V)；白細胞介素-13(interleukin-13，IL-13)、IL-6、IL-10、免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)、Muc5ac、Muc5b ELISA試劑盒(美國Cusabio公司、批號：CSB-E04602m、CSB-E04640r、CSB-E04594m、CSB-E08914m、CSB-E11040m、CSB-E15067m)；SYBR Green qPCR Mix熒光定量PCR試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司，批號：SJ6038-5)。

1.3 儀器RM2145 型自動切片機(德國徠卡公司)；OLYMPUS-DP70 型顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)(日本奧林巴斯株式會社)；Image-Pro Plus 6.0 型專業(yè)圖像分析系統(tǒng)(美國 Media Cybernetics公司)；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精密實驗設備有限公司)；LABOFUGE 400 R型低溫高速離心機(德國Heraeus公司)；Multiskan MK3型酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Fine Pointe PFT型動物肺功能檢測系統(tǒng)(美國Buxco公司)。

2 方法

2.1 藥物制備由河南省中醫(yī)院藥理實驗室按小青龍湯的組成比例用水煎醇沉法制備小青龍湯提取液，具體如下：取小青龍湯組方藥材麻黃10 g，桂枝10 g，干姜15 g，細辛3 g，姜半夏15 g，甘草6 g，白芍10 g，五味子9 g，將上述藥品粉碎，水煎2次，合并濾液并蒸發(fā)水分成膏狀，用體積分數(shù)95%乙醇沉淀，蒸干濾液，過大孔樹脂。再用水和體積分數(shù)40%乙醇、體積分數(shù)70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫后，除盡溶劑，配制成2 kg·L-1(含生藥)水溶液，備用。

2.2 動物分組、造模與給藥60只SPF級SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、氨溴索組、小青龍湯高劑量組、小青龍湯中劑量組及小青龍湯低劑量組，每組10只。除對照組外，其余組大鼠建立支氣管哮喘模型[14]，具體如下：造模大鼠分別于第1天、第7天及第14天腹腔注射質(zhì)量濃度10%OVA/Al(OH)3混懸液[0.1 g OVA和0.1 g Al(OH)3溶于生理鹽水混合液]1 mL致敏，并于第15天開始霧化吸入含1%OVA的生理鹽水霧化激發(fā)，隔日1次，每次 30 min，共計2周，以大鼠出現(xiàn)呼吸急促、抓耳撓腮、行動遲緩等行為為模型建立成功。對照組大鼠分別使用生理鹽水進行腹腔注射和霧化。造模成功后，小青龍湯低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠分別給予 14 g·kg-1、7 g·kg-1、3.5 g·kg-1的小青龍湯溶液灌胃[15]，氨溴索組大鼠灌胃給予15 mg·kg-1氨溴索，對照組及模型組灌胃給予等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。

2.3 觀察指標

2.3.1 肺功能及氣道阻力末次灌胃給藥24 h后，腹腔注射水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉大鼠。將大鼠固定在操作臺上，局部消毒頸部皮膚，沿中線剪開胸腹腔皮膚直至頸部，鈍性分離皮下組織，暴露氣管。在氣管環(huán)狀軟骨下剪小口，插入18 G注射器針頭(尖頭磨平)并結扎固定，連接大鼠肺功能儀檢測大鼠肺功能，記錄第0.3秒用力呼氣容積(forced expiratory volume，F(xiàn)EV0.3)、用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)和呼氣峰流量(peak expiratory flow，PEF)值。通氣數(shù)分鐘后，測大鼠呼吸道阻力(air way resistance，R)作為基礎值，給予大鼠霧化，依次吸入蒸餾水、不同濃度(0 g·L-1，4 g·L-1，8 g·L-1，12 g·L-1、16 g·L-1)的乙酰甲膽堿各15 s后記錄氣道阻力值。

2.3.2 肺泡灌洗液中炎性細胞分類計數(shù)在取材前將大鼠禁食不禁水12 h，處死動物，剝離出肺組織和氣管，用4 ℃生理鹽水注入左支氣管進行灌注，每次2 mL，灌注3次，每次灌注完成后反復抽吸3次，回收肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid，BALF)并離心，去上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆?，底層細胞用瑞?姬姆薩進行復合染色，計數(shù)BALF中巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞的數(shù)目。

2.3.3 BALF中細胞因子水平采用ELISA試劑盒檢測BALF中IL-13、IL-6、IgE、IL-10、Muc5ac以及Muc5b水平，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書的要求。

2.3.4 肺組織Muc5acmRNA、Muc5bmRNA表達水平采用實時熒光定量PCR方法檢測肺組織Muc5acmRNA、Muc5bmRNA表達水平。稱取肺組織50 mg，加入1 mL Trizol，在液氮中充分研碎后室溫靜置5 min；加入 0.2 mL 氯仿，充分震蕩，靜置3 min；4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，移上清至新的EP管；加入與上清等量的-20 ℃預冷的異丙醇，混勻，冰浴10 min；4 ℃ 12 000 r·min-1離心 15 min，棄上清；加入1 mL 75%乙醇，混勻，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min，棄上清；75%乙醇重復洗滌1次，棄上清，室溫晾干20 min，加入20 μL DEPC水，將得到的RNA充分溶解。進行總RNA提取及RNA樣本純度測定后將提取得到的RNA反轉錄為cDNA，使用SYBR Green qPCR Mix試劑進行熒光定量PCR。引物由深圳市豪地華拓生物科技有限公司合成，引物序列如下：Muc5ac正向：5′-GTGTCGGCCGGAGAAA-GTTGGT-3′，反向5′-GTCCTGTTGAGCCTGGCCTGTG-3′；Muc5b正向：5′-TTACACCTGGCACACAATGG-3′，反向5′-TCCAGCTTCTGCAAGTTTCC-3′；β-actin正向5′-CTGTGTACTGAGCATTCCTGTGACT-3′，β-actin反向 5′-AGCCTCCTGTAGAGCTGTGACTGAA-3′。反應體系：正向引物 1 μL、反向引物1 μL、cDNA 2 μL、SYBR Green qPCR Mix 3 μL、雙蒸水(ddH2O)8 μL。PCR循環(huán)條件如下：95℃預變性5 min，95 ℃變性 10 s，60 ℃退火、延伸30 s，進行40個循環(huán)。使用β-actinmRNA進行標準化，以 2-ΔΔCt表示待測基因mRNA相對表達量。

3 結果

3.1 各組大鼠肺功能比較與對照組比較，模型組大鼠FEV0.3、FVC和PEF降低；與模型組比較，小青龍湯各劑量組FEV0.3、FVC和PEF升高，且呈劑量依賴性，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組哮喘大鼠肺功能指標比較

3.2 小青龍湯對大鼠氣道反應性的影響激發(fā)前，與對照組比較，模型組大鼠氣道阻力升高；與模型組比較，各給藥組大鼠氣道阻均降低。在經(jīng)不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)后，與對照組比較，模型組哮喘大鼠氣道阻力值升高；與模型組比較，小青龍湯各劑量組哮喘大鼠氣道阻力值降低，且呈劑量依賴性；與 0 g·L-1乙酰甲膽堿激發(fā)比較，隨著乙酰甲膽堿濃度的升高，模型組、氨溴索組及不同濃度的小青龍湯組氣道阻力均升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 小青龍湯對不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)后各組哮喘大鼠氣道阻力的影響

3.3 各組哮喘大鼠BALF中炎性細胞數(shù)量比較與對照組比較，模型組哮喘大鼠BALF中巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞數(shù)目均升高；與模型組比較，小青龍湯各劑量組哮喘大鼠BALF中巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞數(shù)目降低，且呈劑量依賴性，差異均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表3。

表3 各組哮喘大鼠BALF中炎性細胞數(shù)量比較

3.4 各組哮喘大鼠BALF中IL-13、IL-6、IgE及IL-10水平比較與對照組比較，模型組哮喘大鼠BALF中IL-13、IL-6、IgE的水平升高，IL-10的水平降低；與模型組比較，小青龍湯各劑量組哮喘大鼠BALF中IL-13、IL-6、IgE的水平降低，IL-10的水平升高，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組哮喘大鼠BALF中IL-13、IL-6、IgE及IL-10水平比較

3.5 各組哮喘大鼠BALF中Muc5ac、Muc5b蛋白

表達含量比較與對照組比較，模型組哮喘大鼠BALF中Muc5ac、Muc5b蛋白表達水平升高；與模型組比較，小青龍湯各劑量組哮喘大鼠BALF中Muc5ac、Muc5b蛋白表達水平降低，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組哮喘大鼠BALF中Muc5ac、Muc5b蛋白表達含量比較

3.6 各組哮喘大鼠肺組織Muc5acmRNA與Muc5bmRNA表達水平比較與對照組比較，模型組哮喘大鼠肺組織Muc5acmRNA、Muc5bmRNA水平升高；與模型組比較，小青龍湯各劑量組哮喘大鼠肺組織Muc5acmRNA、Muc5bmRNA水平降低，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 各組哮喘大鼠肺組織Muc5ac mRNA與Muc5b mRNA表達水平比較

4 討論

哮喘屬中醫(yī)學的“哮病”“喘證”等范疇，其病位在肺，常累及脾腎二臟，痰為其主要病理因素。哮喘以正氣虛弱、肺衛(wèi)不固為主，又受六淫邪氣、飲食勞倦等因素刺激，導致痰濁壅塞氣道，肺的宣發(fā)肅降功能失常，臨床以“咳嗽、胸悶、氣短”等癥狀為主?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，黏液高分泌、氣管高反應性與氣道炎癥等特征是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要因素[16]。既往研究發(fā)現(xiàn)，氨溴索對哮喘氣道黏液高分泌有明顯抑制作用[17]。因此，選用氨溴索作為本研究的陽性對照藥物。

小青龍湯由麻黃、桂枝、干姜、細辛、姜半夏、甘草、白芍、五味子組成，具有溫肺化痰、止咳平喘之功。《醫(yī)宗金鑒》所載：“表實無汗，故合麻桂二方以解外，佐干姜、細辛，極溫極散使寒與水俱得以汗而解；佐半夏逐痰飲，以清不盡之飲；佐五味收肺氣，以斂耗傷之氣”。麻黃，首次記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有發(fā)汗平喘、抗氧化等藥理活性[18]。桂枝具有抗菌、調(diào)節(jié)免疫功能、抗感染、抗過敏等藥理作用[19]。干姜成分復雜，具有抗炎殺菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等功效[20]。細辛的揮發(fā)油作為其主要的有效成分，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗感染等藥理作用[21]。姜半夏中含有有機酸、多糖等多種有效化學成分，具有止咳平喘、抗炎等藥理作用[22]。白芍可通過調(diào)節(jié)Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)/核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)等多種炎癥通路達到免疫調(diào)節(jié)、抗炎等作用[23]。五味子作為臨床常用的中藥之一，《神農(nóng)本草經(jīng)》中所載：“主益氣，咳逆上氣”，對免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)都有良好的調(diào)節(jié)作用[24]?，F(xiàn)代藥理研究表明，小青龍湯的藥效在于對氣道異常分泌進行抑制，同時刺激氣道平滑肌的擴張，減輕毛細血管通透性[25]，對炎癥水平、氣道重塑都有一定的抑制作用[26-27]。

哮喘作為一種氣道慢性炎癥性疾病，在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥反應發(fā)揮著重要作用，BALF中的IL-13、IL-6、IgE及IL-10等細胞因子水平與巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞的數(shù)目可直接反映大鼠肺組織的炎癥水平。當機體接觸變應原后，輔助性T細胞(helper T cells，Th)亞群釋放IL-13等細胞因子，在炎癥級聯(lián)反應中發(fā)揮關鍵的調(diào)節(jié)作用。IL-6 主要由單核細胞、巨噬細胞產(chǎn)生，可刺激細胞生長、促進其分化，參與炎癥損傷和免疫應答過程[28]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可刺激T淋巴細胞產(chǎn)生IL-4等炎癥因子，可使肥大細胞、嗜酸性粒細胞遷移至呼吸道，參與氣道炎癥反應[29]。此外，臨床研究證實，痰中IL-6水平升高提示患者哮喘控制不佳，肺功能下降[30]。在哮喘的發(fā)病中，作為免疫球蛋白的一種，IgE介導的Ⅰ型變態(tài)反應起著重要的作用，并且IgE水平與氣道炎癥反應和氣道高反應性有關，血清IgE水平增高，則提示有氣道高反應性存在[31]。鐘志娟等研究者發(fā)現(xiàn)，抑制IgE水平的表達，患者哮喘癥狀及體征明顯減輕[32]。既往文獻顯示，哮喘患者通常伴隨不同程度的氣道炎癥反應，體內(nèi)的IL-6、IL-13等促炎性因子會以不同方式參與哮喘的發(fā)生發(fā)展；而IL-10作為抗炎因子，其升高可抑制機體內(nèi)的過度炎性反應[33]。哮喘大鼠的肺功能指標可反映哮喘大鼠的氣道高反應性，本研究采用腹腔注射OVA致敏與霧化吸入OVA激發(fā)誘導建立哮喘大鼠模型，可發(fā)現(xiàn)大鼠呼吸急促，撓鼻、打噴嚏及喘息等行為，大鼠的氣道阻力值升高，且BALF上清液中IL-13、IL-6、IgE及 IL-10 等細胞因子水平含量明顯變化，巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞的數(shù)目升高，哮喘大鼠出現(xiàn)肺組織炎癥反應，提示哮喘模型建立成功。給予小青龍湯干預后，能有效降低氣道高反應性，改善肺功能指標(FEV0.3、FVC和PEF)，減輕炎癥反應(巨噬細胞數(shù)、中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞)，下調(diào)IL-13、IL-6、IgE水平，上調(diào) IL-10 水平。

本研究從中醫(yī)哮病以痰為病理因素著手，從黏液高分泌這一角度探討小青龍湯治療哮喘的作用機制。黏液高分泌是哮喘復發(fā)與加重的重要因素。黏液的主要組分為分泌細胞分泌的黏蛋白，Muc5ac和Muc5b是兩種分泌型黏蛋白聚合復合物，位于氣道上皮杯狀細胞內(nèi)，氣道杯狀細胞異常增生及氣道黏液的高分泌狀態(tài)可體現(xiàn)其高表達水平[34]。Muc5ac在哮喘模型中的高表達與氣道的黏液高分泌呈正相關，可加重氣道平滑肌收縮，并誘發(fā)氣道高反應；而Muc5b則更傾向于體現(xiàn)氣道的黏液清除力和氣道防御能力。研究顯示，Muc5b缺陷的小鼠會誘發(fā)氣道的慢性細菌感染，并進一步導致嚴重的氣道炎癥，甚則氣道阻塞[35-37]。本研究發(fā)現(xiàn)，小青龍湯可明顯抑制Muc5ac、Muc5b的表達，減輕哮喘大鼠黏液高分泌，改善哮喘癥狀。

綜上所述，小青龍湯可有效抑制哮喘大鼠的黏液分泌及氣道炎癥，緩解哮喘大鼠癥狀，其作用機制可能與抑制黏蛋白Muc5ac、Muc5b的水平而降低黏液高分泌有關，為臨床防治哮喘提供了新的思路。