蔚文垚，曹繼剛，鄧超，姜興宇，任方楠

湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061

勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)是指陰莖持續(xù)不能達(dá)到和/或維持足夠的硬度滿足正常的性生活3個月以上[1]。ED的發(fā)生與年齡、軀體疾病、精神心理因素、不良生活方式等相關(guān)，雖不危及生命，但影響著生活質(zhì)量、夫妻關(guān)系等，也可能預(yù)示著某些疾病的發(fā)生。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國山東省ED總患病率為25.8%，40歲及以上人群的患病率為33.83%，且隨其年齡增長而上升，60歲以上上升幅度尤為明顯[2]；東莞市一項流行病學(xué)調(diào)查顯示，1 812例男性中，ED患病率為64.2%[3]，40歲及以上人群的患病率為40.2%[4]。目前，西醫(yī)治療ED的手段主要包括激素類藥物、非激素類口服藥物(如溴隱亭、曲唑酮、西地那非等)、外用藥物、負(fù)壓吸引縮窄裝置等，但仍存在安全性和不良反應(yīng)等問題。

中醫(yī)將ED歸屬于“陽痿”范疇，認(rèn)為本病基本的病機(jī)為肝郁、腎虛、濕熱、血瘀，臨床辨證中實(shí)多虛少[5]。四逆散源于《傷寒論》，記載：“少陰病……或瀉利下重者，四逆散主之”，本方包括柴胡、白芍、枳實(shí)、甘草四味中藥，以疏肝行氣為主，臨床多用于治療咳嗽、心悸、腹痛、泄瀉等疾病[6-8]。《靈樞·經(jīng)脈》：“肝者筋之合也，筋者聚于陰器。”《素問·痿論》云：“筋痿者，生于肝，使內(nèi)也?！敝赋龈沃鹘?，合于陰器，陽痿不用當(dāng)責(zé)之于肝，而四逆散以疏肝理氣為主，與陽痿治療觀念不謀而合。郭漢林認(rèn)同王琦教授“陽痿從肝論治”學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，并運(yùn)用四逆散加味治療81例陽痿患者，有效率達(dá)83.5%[9]。王世勛運(yùn)用四逆散加減治療陽痿患者56例，有效率達(dá)85.7%[10]。日本漢方醫(yī)家細(xì)野氏認(rèn)為四逆散所治之人，性格內(nèi)向、消極、敏感，與陽痿之人多焦慮、抑郁等不謀而合，因此，四逆散亦能兼治陽痿患者的情志病[11-12]。

中醫(yī)用藥多為復(fù)方制劑，雖然歷史悠久、療效明顯，但中藥成分復(fù)雜，難以明確其有效成分和作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，從生物網(wǎng)絡(luò)整體角度系統(tǒng)地分析藥物的成分、靶點(diǎn)及對疾病的作用機(jī)制，是將傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代生物學(xué)結(jié)合的研究[13]?；诖?，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的方法構(gòu)建四逆散治療ED的藥物成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，探索四逆散治療ED的作用機(jī)制，為后續(xù)深入研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 四逆散活性成分及其作用靶點(diǎn)搜集利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/index.php)[14]分別檢索四逆散組方中藥柴胡、白芍、枳實(shí)、甘草的化學(xué)成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為條件，篩選出藥物的活性成分，并提取藥物活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)。以Uniprot數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org)對靶點(diǎn)的名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并運(yùn)用Cytoscape3.9.1軟件可視化“四逆散-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 四逆散治療ED的潛在靶點(diǎn)預(yù)測利用治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/)[15]、人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards?：the human gene database，https：//www.genecards.org/)[16]、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM，http//www.omim.org)[17]、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(https：//www.disgenet.org)[18]，以“erectile dysfunction”為關(guān)鍵詞篩選出疾病靶點(diǎn)，將4個數(shù)據(jù)庫獲得的疾病靶點(diǎn)合并后刪除重復(fù)值得到ED相關(guān)靶點(diǎn)。通過Venny2.1.0將藥物活性成分靶點(diǎn)與ED相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，取交集，即為四逆散治療ED的潛在靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)與對應(yīng)的藥物活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件，構(gòu)建“四逆散-活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.3 潛在靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https：//cn.string-db.org/)[19]，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，minimum required interaction score：high confidence(0.700)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape軟件中CytoNCA插件[20]進(jìn)一步分析，根據(jù)度值(degree，DC)、中介中心性(betweenness，BC)、接近中心性(closeness，CC)、特征向量(eigenvector，EC)等參數(shù)篩選PPI網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點(diǎn)，大于2倍DC中位數(shù)且同時大于BC、CC、EC中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)為核心節(jié)點(diǎn)，即核心靶點(diǎn)。將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape3.9.1可視化。

1.4 核心靶點(diǎn)的生物學(xué)功能及分子通路分析將核心靶點(diǎn)通過Metascape數(shù)據(jù)庫(https：//metascape.org/gp/index.html)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析，篩選條件Min Overlap為3；PValue Cutoff為0.01；Min Enrichment為1.5[21]，并用微生信平臺(http：//www.bioinformatics.com.cn/)可視化分析結(jié)果。

1.5 分子對接選擇“四逆散-活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖中degree值排名前5位的活性成分，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出活性成分的mol2格式，使用Autodock軟件對活性成分進(jìn)行加全氫、設(shè)為配體、檢測扭轉(zhuǎn)鍵、選擇扭轉(zhuǎn)鍵等處理。通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http：//www.rcsb.org)導(dǎo)出PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前5位的核心靶點(diǎn)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，利用Pymol軟件對其去水、清除配體后保存為pdb格式，使用Autodock軟件對蛋白質(zhì)加全氫，導(dǎo)出為PDBQT格式。設(shè)置對接參數(shù)及運(yùn)算方法為默認(rèn)值，運(yùn)行Autodock進(jìn)行分子對接并查看對接結(jié)果。通過配體與受體的結(jié)合能評價活性成分和核心靶點(diǎn)間的對接效果，結(jié)合能<-1.2 Kcal·mol-1為對接狀態(tài)良好，并再次利用Pymol可視化分子對接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 四逆散活性成分及其作用靶點(diǎn)利用TCMSP獲得柴胡活性成分13個，相關(guān)靶點(diǎn)182個；白芍活性成分8個，相關(guān)靶點(diǎn)86個；枳實(shí)活性成分18個，相關(guān)靶點(diǎn)116個；甘草活性成分88個，相關(guān)靶點(diǎn)221個；其中重復(fù)活性成分7個，重復(fù)靶點(diǎn)356個，去重后共獲得120個活性成分及249個相關(guān)靶點(diǎn)，見表1。將篩選的藥物活性成分與預(yù)測靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件，構(gòu)建“四逆散-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。該圖包含373個節(jié)點(diǎn)(4味中藥，120個活性成分，249個預(yù)測靶點(diǎn))，2 093條邊，其中藍(lán)色圓形代表藥物，橙色平行四邊形代表柴胡活性成分，紫色代表甘草活性成分，紫紅色代表枳實(shí)活性成分，橙色三角形代表白芍活性成分，綠色箭頭形代表共有活性成分；藏青色圓形代表相關(guān)靶點(diǎn)。見圖1。

表1 四逆散組方中藥活性成分及預(yù)測靶點(diǎn)數(shù)目

圖1 “四逆散-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 四逆散治療ED的作用靶點(diǎn)以“erectile dysfunction”為關(guān)鍵詞在GeneCards、OMIM、TTD、DisGeNET數(shù)據(jù)庫中檢索ED疾病靶點(diǎn)，合并并去除重復(fù)值后得到1 846個ED疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將ED疾病相關(guān)靶點(diǎn)與四逆散活性成分靶點(diǎn)映射，取交集，得到156個四逆散治療ED的作用靶點(diǎn)，并用韋恩圖進(jìn)行可視化。見圖2。將交集靶點(diǎn)與對應(yīng)的藥物活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件，構(gòu)建“四逆散-活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。該網(wǎng)絡(luò)圖共有278個節(jié)點(diǎn)(4個中藥節(jié)點(diǎn)，1個疾病節(jié)點(diǎn)，156個靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，117個活性成分節(jié)點(diǎn))和1 699條邊，圖中橙色大圓形代表潛在靶點(diǎn)，黃色六邊形代表藥物，紅色三角形代表甘草活性成分，藍(lán)色平行四邊形代表枳實(shí)活性成分，紫紅色正方形代表柴胡活性成分，藍(lán)色箭頭形代表白芍活性成分，藍(lán)色圓形代表疾病，綠色菱形代表共有活性成分，藍(lán)色正方形代表共有活性成分標(biāo)記。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊Y選出排名前5位的活性成分分別是槲皮素(MOL000098)、木犀草素(MOL000006)、山柰酚(MOL000422)、芒柄花素(MOL000392)、7-甲氧基-2-甲基異黃酮(MOL003896)。見圖3及表2。

2.3 潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)將156個潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)出分析數(shù)據(jù)，利用Cytoscape3.9.1對結(jié)果進(jìn)行可視化，并用CytoNCA進(jìn)行拓?fù)浞治龅贸?，DC中位數(shù)為15，EC中位數(shù)為0.05，BC中位數(shù)為84.72，CC中位數(shù)為0.43，篩選出大于2倍DC中位數(shù)且大于EC、BC、CC中位數(shù)的靶點(diǎn)共23個，排名前5位的核心靶點(diǎn)分別是絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(AP-1 transcription factor subunit，JUN)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase 1，AKT1)、腫瘤抗原p53(tumor protein p53，TP53)。將23個核心靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape進(jìn)行可視化。圖中顏色越紅、透明度越小、面積越大的靶點(diǎn)則其degree值越大，說明該靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)相關(guān)度越高。見圖4，圖5及表2。

圖2 四逆散活性成分靶點(diǎn)與ED疾病靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 “四逆散-活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 四逆散治療ED的潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 四逆散治療ED的核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 核心靶點(diǎn)GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析通過Metascape數(shù)據(jù)庫對23個核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。GO功能富集分析得到719個生物過程(biological process，BP)，18個細(xì)胞組分(cellular component，CC)及41個分子功能(molecular function，MF)，其中BP主要涉及細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)(cellular response to chemical stress)、對活性氧的反應(yīng)(response to reactive oxygen species)、腺體發(fā)育(gland development)等；CC主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物(transcription regulator complex)、轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物(transcription repressor complex)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物(RNA polymerase II transcription regulator complex)等；MF主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(transcription factor binding)等。將結(jié)果分別按照P值排序，使用微生信繪制出前10個結(jié)果的柱狀圖。見圖6。KEGG信號通路富集分析得到149條信號通路，主要涉及脂質(zhì)和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、絲裂原活化蛋白激酶信號通路(MAPK signaling pathway)、癌癥通路(pathways in cancer)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)等。用微生信繪制出前20條信號通路氣泡圖。見圖7。

表2 排名前5位的活性成分及核心靶點(diǎn)信息

圖6 四逆散治療ED核心靶點(diǎn)的GO富集分析

2.5 分子對接通過AutoDock軟件對degree值排名前5位的活性成分及核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，其中活性成分配體與核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)受體結(jié)合活性越高，其結(jié)合能值越低。通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫選取核心靶點(diǎn)AKT1、TP53、MAPK3、STAT3、JUN的蛋白晶體結(jié)構(gòu)。AutoDockTools設(shè)為默認(rèn)值，將各成分與靶點(diǎn)加氫后進(jìn)行分子對接，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四逆散活性成分與核心靶點(diǎn)對接良好。見表3及圖8。

圖7 四逆散治療ED核心靶點(diǎn)的KEGG富集分析

圖8 四逆散活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接示意圖

表3 四逆散治療ED的活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果 ( Kcal·mol-1)

3 討論

陰莖勃起是一種神經(jīng)血管現(xiàn)象，解剖發(fā)現(xiàn)陰莖海綿體3/4是由血管結(jié)締組織組成，組織間有復(fù)雜且相互連接的腔隙，相當(dāng)于一種單一的血液儲存器，當(dāng)受到刺激時，腔隙組織松弛，腔隙擴(kuò)大，小動脈擴(kuò)張，從而使得陰莖海綿體內(nèi)血管壓力降低，動脈血液內(nèi)流增多；而腔隙擴(kuò)大又壓迫其壁及白膜間的小靜脈，周圍白膜張力增大牽拉，導(dǎo)致靜脈受壓回流受阻，陰莖海綿體入血量增加、出血量減少及白膜的限制使得陰莖勃起增粗，硬度增強(qiáng)。陰莖疲軟時，腔隙變小，靜脈受壓減小，小靜脈出血量增加。血管病變是ED發(fā)生的重要病理機(jī)制，血管內(nèi)皮慢性損傷、高血壓、動脈粥樣硬化、一氧化氮(nitric oxide，NO)/環(huán)磷酸鳥苷(3′-5′-cyclic guanosine monophosphate，cGMP)通路受損等均可影響陰莖勃起功能[22-23]。陰莖正常勃起需要神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控，副交感神經(jīng)系統(tǒng)可向陰莖傳遞興奮性神經(jīng)沖動，促進(jìn)其勃起，交感神經(jīng)多控制陰莖的疲軟，作為神經(jīng)遞質(zhì)的NO在陰莖勃起機(jī)制中起到了重要作用。神經(jīng)病變不僅會導(dǎo)致性刺激減弱，也會減少NO的合成[24]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)控制陰莖勃起多涉及反射性刺激和心理性刺激兩方面，研究發(fā)現(xiàn)，心理性ED是最常見的一種ED類型，并且這種由心理因素引起的ED可以通過患者腦網(wǎng)絡(luò)分析得到證實(shí)，這對于深入理解心理因素誘導(dǎo)ED的發(fā)病機(jī)制有著重要的意義[25]。此外，內(nèi)分泌紊亂也是ED的重要致病因素，腺體受損、代謝紊亂、低性腺激素、糖尿病等均可導(dǎo)致ED[26]。

中醫(yī)對陽痿的認(rèn)識同中有異，如《素問·五常政大論》：“氣大衰而不起不用”，認(rèn)為氣不足可導(dǎo)致陽痿不用；《諸病源候論》：“勞傷于腎，腎虛不能榮于陰器，故痿弱也”，認(rèn)為過度勞作、腎虛不足會造成陽痿；現(xiàn)代部分中醫(yī)家認(rèn)為本病與肝密切相關(guān)[27-30]。肝主藏血、主疏泄，陰莖正常勃起需要肝疏泄氣血于宗筋；肝主調(diào)暢情志，研究表明，心理因素是ED發(fā)生的重要危險因素[31]。從肝經(jīng)在人體循行可知肝經(jīng)入陰毛，環(huán)陰器；從肝生理特性可知，肝氣上升、主春，而春天孕育生機(jī)勃勃之勢，是萬物生長交配的季節(jié)，肝氣暢通、充足是陰莖正常勃起的先決條件。四逆散是治肝之方，由柴胡、白芍、甘草、枳實(shí)組成，其中柴胡體質(zhì)輕清，性味辛、苦、微寒，能夠疏理肝氣、條達(dá)膽氣；白芍性味苦、酸、微寒，能夠養(yǎng)血和營、斂陰平肝，合甘草則酸甘化陰，合柴胡則理肝氣、清郁火；甘草性味甘平，能夠和中緩急、安魂定魄、補(bǔ)五勞七傷，治療一切虛損等；枳實(shí)性味苦、酸、微寒，破氣消積。肝與陽痿密切相關(guān)，臨床醫(yī)家采用四逆散治療陽痿，療效可觀，卻因中藥成分復(fù)雜、多靶點(diǎn)等問題導(dǎo)致作用機(jī)制不明[32-34]。

本研究共得到四逆散活性成分120個，作用于249個預(yù)測靶點(diǎn)，與ED疾病靶點(diǎn)取交集后獲得156個交集靶點(diǎn)，通過PPI分析及degree值預(yù)測后發(fā)現(xiàn)5種主要活性成分，分別是槲皮素、木犀草素、山柰酚、芒柄花素與7-甲氧基-2-甲基異黃酮。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能顯著改善環(huán)孢素誘導(dǎo)的勃起功能障礙大鼠的性行為，提高ATP的生物利用度，調(diào)節(jié)核糖核酸酶及腺苷脫氨酶活性，提高NO水平，從而治療勃起功能障礙[35]。槲皮素亦能抑制磷酸二酯酶-5(phosphodiesterase-5，PDE-5)、精氨酸酶、乙酰膽堿酯酶(acetyl cholinesterase，AChE)和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotension-converting enzyme，ACE)的活性，改善Fe2+和硝普鈉誘導(dǎo)的大鼠陰莖組織脂質(zhì)過氧化[36]。有學(xué)者根據(jù)南瓜籽可治療ED研究了其對離體大鼠海綿體勃起功能關(guān)鍵酶的影響，發(fā)現(xiàn)南瓜籽能夠抑制PDE-5、精氨酸酶、乙酰膽堿酯酶和ACE活性，提取南瓜籽成分后發(fā)現(xiàn)，南瓜籽主要成分是槲皮素和木犀草素[37]。山柰酚是一種常見的黃酮類化合物，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化活性，并對心血管疾病具有保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚可降低氧化應(yīng)激、心肌酶、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達(dá)[38]。雖然沒有直接的研究發(fā)現(xiàn)山柰酚可治療ED，但是由于陰莖的海綿體大部分由血管結(jié)締組織組成，推測山柰酚可通過修復(fù)血管間接改善陰莖的勃起功能。芒柄花素屬異黃酮類化合物，是植物雌激素，具有類雌激素、抗炎、抗腫瘤、抗血栓、抗凋亡等作用[39]。雌激素信號與陰莖發(fā)育有關(guān)，并潛在地參與成年時期調(diào)節(jié)勃起功能的過程[40]?；仡櫺匝芯堪l(fā)現(xiàn)，在多因素logistic回歸分析中，當(dāng)控制血清總睪酮、年齡、體質(zhì)量指數(shù)和吸煙狀況時，血清雌二醇的水平與臨床勃起功能障礙顯著相關(guān)[OR=1.52，95%CI(1.11-2.09)，P=0.009][41]。

PPI網(wǎng)絡(luò)及CytoNCA分析后發(fā)現(xiàn)排名前5位的核心靶點(diǎn)分別是MAPK3、STAT3、JUN、AKT1、TP53。研究表明，上調(diào)STAT3可促進(jìn)脂肪間質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)向雪旺細(xì)胞(Schwann cells，SCs)分化從而有利于海綿體神經(jīng)損傷后勃起功能的恢復(fù)[42]。AKT1是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要分子，上調(diào)動脈性勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體AKT1的表達(dá)能夠改善血管內(nèi)皮功能，促進(jìn)陰莖勃起[43]。AKT1還能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮型NO合酶(endothelial nitric oxide synthases，eNOS)磷酸化，維持NO水平，從而促進(jìn)陰莖能夠持續(xù)勃起[44]。活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接發(fā)現(xiàn)，其結(jié)合能均<-1.2 Kcal·mol-1，提示對接效果良好，且木犀草素與TP53結(jié)合能值最低，為-7.64 Kcal·mol-1。由此可知，四逆散治療ED具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

對四逆散治療ED的23個核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，核心靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)、腺體發(fā)育等生物過程，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等細(xì)胞組分，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能。研究表明，活性氧的增加不僅能夠降低NO的能力，也能刺激Ras同源蛋白家族成員A(ras homologous family member A，RhoA)/Rho激酶(Rho kinase，RhoK)途徑，造成ED[45]。轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)受損，如叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead transcription factor，F(xiàn)OX)、核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)等，可導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損，從而引發(fā)勃起功能障礙[46-47]。

KEGG分析結(jié)果顯示，四逆散治療ED的23個核心靶點(diǎn)共涉及149條信號通路，主要與脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、MAPK信號通路、癌癥通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等信號通路相關(guān)性較強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，血脂異?？赡苁窃斐蒃D的危險因素[48]。動脈粥樣硬化是一種系統(tǒng)性疾病，可危及陰莖海綿體動脈，從而影響陰莖勃起功能[49]。MAPK信號通路與ED關(guān)系密切，MAPK調(diào)控著細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種途徑，并且其相關(guān)基因多樣，較熟悉的包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(external-signal regulated kinase，ERK)1/2、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)等，均可調(diào)節(jié)陰莖海綿體內(nèi)皮、平滑肌、細(xì)胞凋亡等途徑，從而影響勃起功能[50-52]。PDE-5與環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)代謝相關(guān)，抑制PDE-5則能降低cGMP代謝成GMP，從而舒張陰莖海綿體，增強(qiáng)勃起。研究發(fā)現(xiàn)，PDE-5抑制劑可通過調(diào)控NO/cGMP信號通路降低直腸癌、骨髓瘤、乳腺癌等風(fēng)險[53]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)預(yù)測四逆散治療ED的作用機(jī)制和核心靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，四逆散的活性成分槲皮素、木犀草素、山柰酚、芒柄花素等可與MAPK3、STAT3、JUN、AKT1、TP53等核心靶點(diǎn)結(jié)合，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、MAPK信號通路、癌癥通路等信號通路發(fā)揮改善勃起功能障礙的作用，具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，為進(jìn)一步的實(shí)驗驗證提供了參考。