王偉佳，唐 碩，馬應(yīng)鈞，章 娜，蔣柳云，張 燕

(湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，中國 長沙 410081)

由于創(chuàng)傷、感染、骨腫瘤等造成的骨缺損十分常見。目前用于臨床移植的骨替代物主要有自體骨、同種異體骨、異種骨以及金屬、陶瓷、聚合物等合成材料，但其在骨科中應(yīng)用存在各自的優(yōu)缺點。近年來，隨著組織工程學(xué)的迅速發(fā)展，骨組織工程學(xué)為骨缺損的治療提供了一種可供選擇的新方法[1]。骨組織工程中3個要素是不可或缺的，即支架材料、種子細(xì)胞和信號因子。其中支架材料作為細(xì)胞和信號因子的載體，為骨組織生長提供特有的微結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，是骨組織工程研究的關(guān)鍵問題。在骨組織工程應(yīng)用中，通常理想的骨組織工程支架材料需滿足以下幾個方面的要求：良好的生物相容性、合適的可降解性、具有三維多孔且相互貫通的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和一定的機械強度[2]。大量研究表明，模仿天然骨的組分進(jìn)行設(shè)計，有利于為細(xì)胞黏附、生長、增殖提供更合適的微環(huán)境，可促進(jìn)血管化骨形成及骨組織生長，這是獲得性能優(yōu)異的骨組織工程支架材料的最有效途徑。

納米羥基磷灰石(n-HA) 是天然骨骼中的主要礦物質(zhì)，因其具有與人體骨骼相似的化學(xué)和物理特性，生物活性和骨傳導(dǎo)性良好，無論是制備假體植入物、支架還是人工骨水泥，羥基磷灰石都備受關(guān)注[3,4]。但其單獨使用時脆性較大且加工性能較差，因而其應(yīng)用受到嚴(yán)重限制。而將其與其他物質(zhì)復(fù)合，有望獲得高強度、高成骨活性的復(fù)合支架，這是骨組織工程研究的重要方向[5]。因此，本文對n-HA與天然高分子、合成高分子、無機材料以及其他活性因子的復(fù)合材料的理化性能及生物學(xué)性能以及在骨組織工程支架材料中的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，為制備高性能骨組織工程支架材料提供參考。

1 n-HA/天然高分子復(fù)合材料

1.1 n-HA/膠原(n-HAC)復(fù)合材料

膠原蛋白(Col)和羥基磷灰石(HA)分別是天然骨骼中最豐富的蛋白質(zhì)和主要成分，由于膠原蛋白和羥基磷灰石優(yōu)異的生物相容性和生物降解性，它們通常被用作骨組織工程中的仿生復(fù)合材料。Chen等[6]通過逐步添加HA的Col分層組裝，在迭代分層凍干工藝的輔助下，制備了一種新型仿生多孔膠原(Col)/羥基磷灰石(HA)支架。在新型仿生多孔膠原(Col)/羥基磷灰石(HA)支架上細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶活性和體外成骨分化都有顯著增加，表明優(yōu)良的Col/HA支架在骨組織工程中具有潛在的應(yīng)用前景。Yu等[7]通過仿生方法建立了新型Col-HA支架，同時在支架中添加鐵、錳兩種微量元素，以增強骨組織工程支架的新骨再生能力，新型支架表現(xiàn)出更好的成骨能力，且有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的體外成骨分化和體內(nèi)骨再生，該研究為創(chuàng)建用于骨再生的功能性支架提供了一種簡單而實用的策略。

1.2 n-HA/殼聚糖(CS)復(fù)合材料

殼聚糖(CS)作為甲殼素衍生的天然聚合物，在骨組織工程中發(fā)揮了重要作用[8]。CS為帶陽離子的高分子堿性多糖聚合物，具有良好的生物相容性、微生物降解性以及細(xì)胞黏附性，在體內(nèi)的降解產(chǎn)物無毒性和刺激性，且具有優(yōu)良的抗菌性、可塑性，適合細(xì)胞向內(nèi)生長和骨傳導(dǎo)。近年來，以殼聚糖、n-HA為基礎(chǔ)組分的多相復(fù)合人工骨已成為研究的熱點方向。Dai等[9]制備了三維殼聚糖(CS)/蜂窩多孔碳/羥基磷灰石復(fù)合材料，合成方法如圖 1所示。新型支架具有分層孔和有機-無機成分，其組成和結(jié)構(gòu)與骨組織相似，具有較高的孔隙率和一定的機械強度。三維殼聚糖(CS)/蜂窩多孔碳/羥基磷灰石復(fù)合支架可促進(jìn)干細(xì)胞生長并促進(jìn)其分化為成骨，在促進(jìn)骨缺損區(qū)骨形成方面也具有顯著優(yōu)勢。各項實驗均表明CS/HPC/n-HA支架在骨組織工程中具有良好的應(yīng)用前景。葉鵬等[10]制備了三維絲素蛋白/殼聚糖/納米羥基磷灰石復(fù)合支架，該負(fù)荷型抗生素支架具有良好的緩釋性能、抗壓性及吸水率和水溶性損失率，應(yīng)用前景良好。本課題組[11]為提高n-HA/CS復(fù)合支架的力學(xué)性能，采用引入聚陰離子性的羧甲基纖維素與殼聚糖進(jìn)行離子交聯(lián)，采用冷凍干燥法獲得了相互貫通的高強度多孔材料，有望用于骨組織工程支架。最近本課題組[12]又研究了羧基化改性的竹纖維，可以對n-HA/CS復(fù)合支架的力學(xué)性能及降解性有更好的改善，在骨組織工程支架中有較大的應(yīng)用前景。

圖1 蜂窩方案多孔的碳合成及其在成骨細(xì)胞分化中的潛在應(yīng)用Fig. 1 Synthesis of cellular porous carbon and its potential application in osteoblast differentiation

1.3 n-HA/絲素蛋白(SF)復(fù)合材料

絲素蛋白(silk fibroin，SF)是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，具有優(yōu)異的韌性、延展性和可塑性[13]。其含有 18 種氨基酸，易于在側(cè)鏈進(jìn)行化學(xué)修飾而改變其性能。絲素蛋白在體內(nèi)降解緩慢，產(chǎn)物安全、無毒性。因其優(yōu)越的生物降解性、良好的生物相容性和極其輕微的炎癥反應(yīng)，使其在骨組織工程研究中成為關(guān)注的焦點[14]。孫慶治[15]制備了一種納米羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合人工骨材料。通過小鼠體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，隨著時間的增長小鼠體內(nèi)的人工骨材料被完全降解吸收、被新生骨質(zhì)替代，骨缺損區(qū)完全愈合。這證實了納米羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合人工骨材料可促進(jìn)骨缺損修復(fù)，具有較強的成骨能力。Xu等[16]采用紫外交聯(lián)法制備了3種不同比例的絲素蛋白和羥基磷灰石組成的多孔支架材料。各項表征證實該絲素蛋白/羥基磷灰石支架的抗壓強度、彈性模量和孔隙率均較為理想。體內(nèi)實驗可以觀察到絲素蛋白/羥基磷灰石支架植入后明顯促進(jìn)了股骨缺損的修復(fù)。因此，絲素蛋白/羥基磷灰石支架是一種很有前途的骨組織工程材料。Niu等[17]采用靜電紡絲技術(shù)制備了含有羥基磷灰石(HA)納米顆粒和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)的納米纖維絲素蛋白(SF)支架。采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)實驗表明，納米纖維絲素蛋白(SF)支架具有良好的生物相容性，并可促進(jìn)BMSC的成骨分化。因此，靜電紡絲SF/HA/BMP-2支架可作為骨組織工程很有前途的生物材料。

2 n-HA/合成高分子復(fù)合材料

2.1 n-HA/聚乳酸(PLA)復(fù)合材料

聚乳酸(polylacticacid，PLA)因其具有良好的生物相容性、降解性及成形性，成為骨組織工程中應(yīng)用最廣泛的合成聚合物之一[18]。但作為支架材料，聚乳酸降解速度過快，容易產(chǎn)生一些酸性降解產(chǎn)物，同時細(xì)胞黏附性較差，不利于周圍細(xì)胞的增殖與生長。而n-HA在酸性介質(zhì)中會因溶解度的提高而形成微堿性環(huán)境，與聚乳酸的酸性降解產(chǎn)物反應(yīng)，導(dǎo)致緩沖細(xì)胞周圍環(huán)境 pH 的下降，減輕單獨使用聚乳酸材料造成的炎癥反應(yīng)，因此將PLA與n-HA兩者復(fù)合會得到性能更優(yōu)異的材料。

李剛等[19]制備了一種納米羥基磷灰石(n-HA)/聚乳酸(PLA)復(fù)合材料。XRD測試結(jié)果表明n-HA的添加可以促進(jìn)聚乳酸的結(jié)晶，為聚乳酸的結(jié)晶研究提供了參考。同時，SEM圖表明最佳的添加比例為m(HA)∶m(PLA)=1∶10，此條件下制得的樣品具有較好的成孔性，如圖2所示。魏安方等[20]采用靜電紡絲的方法制得了一種納米羥基磷灰石(n-HA)/聚乳酸(PLA)復(fù)合納米纖維支架材料。當(dāng)n-HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時，其在聚乳酸納米纖維表面均勻分布，使得n-HA/PLA復(fù)合納米纖維支架材料的斷裂強度、斷裂伸長率達(dá)到最大，熱力學(xué)性能也明顯提高。Liu等[21]通過相分離方法制備聚乳酸/羥基磷灰石(PLA/HA)復(fù)合納米纖維支架以模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。各種表征分析可得：HA的添加提高了復(fù)合支架的熱分解溫度，同時復(fù)合支架親水性增加，具有很大應(yīng)用前景。為提高其力學(xué)性能，本課題組[22]將天然竹纖維添加到n-HA/PLGA復(fù)合支架中，通過對其力學(xué)性能、降解性能及生物學(xué)性能進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)所得新型復(fù)合多孔材料滿足骨組織工程支架材料的性能要求。

圖2 不同質(zhì)量比n-HA/PLA復(fù)合支架的SEM形貌，(a) m(n-HA)∶m(PLA)=0∶10;(b) m(n-HA)∶m(PLA)=1∶10;(c) m(n-HA)∶m(PLA)=2∶10;(d) m(n-HA)∶m(PLA)=3∶10;(e) m(n-HA)∶m(PLA)=4∶10Fig. 2 SEM images of n-HA/PLA composite scaffolds with different mass ratios，(a) m(n-HA)∶m(PLA)=0∶10,(b) m(n-HA)∶m(PLA)=1∶10,(c) m(n-HA)∶m(PLA)=2∶10,(d) m(n-HA)∶m(PLA)=3∶10,and (e) m(n-HA)∶m(PLA)=4∶10

2.2 n-HA/聚酰胺(PA)復(fù)合材料

圖3 靜電紡絲PA6/CS纖維支架形成示意圖 Fig. 3 Schematic diagram for the formation of electrospun PA6/CS fiber scaffolds

PA俗稱“尼龍”，具有良好的耐熱性、耐磨損性、自潤滑性，易于加工，常用的有 PA6 和 PA66。聚酰胺-6(PA6)是一種合成聚合物，其骨架與膠原蛋白相似，在人體體液中具有出色的穩(wěn)定性。因此n-HA/PA 新型骨組織工程材料是近年來的研究熱點之一。You等[23]制備了納米羥基磷灰石/聚酰胺-66(n-HA/PA66)復(fù)合支架，具有軸向?qū)R的通道(300 μm)。與各向同性支架相比，具有軸向?qū)R通道的各向異性支架具有更好的機械性能和更高的孔隙率(86.37%)，可促進(jìn)支架內(nèi)的細(xì)胞附著和增殖，更好地促進(jìn)新骨向內(nèi)孔生長。各向異性支架還改善了血管對其內(nèi)部的侵襲，增加了供應(yīng)細(xì)胞的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)了血運重建和骨內(nèi)生長。因此，這種支架在骨組織工程中具有巨大的應(yīng)用潛力。Chen等[24]比較了新型高度可調(diào)納米羥基磷灰石/聚酰胺-66椎體(HAVB)與鈦網(wǎng)籠(TMC)和人造椎體(AVB)的生物力學(xué)特性，經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)與TMC和AVB相比，HAVB在脊柱穩(wěn)定性重建方面具有相似的生物力學(xué)功效，并可大大減少與植入物相關(guān)的并發(fā)癥，因此納米羥基磷灰石/聚酰胺-66復(fù)合材料被證明是脊柱穩(wěn)定性重建的潛在可行選擇。Niu等[25]采用靜電紡絲技術(shù)制備了靜電紡絲PA6/CS支架(如圖3所示)，發(fā)現(xiàn)該支架礦化后，HA顆粒均勻分布在PA6/CS纖維支架表面，呈多孔蜂窩狀結(jié)構(gòu)，礦物含量約為40%；此外，細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明，礦化的PA6/CS復(fù)合支架無細(xì)胞毒性，具有良好的生物相容性和促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞附著和增殖的能力。

2.3 n-HA/聚己內(nèi)酯(PCL)復(fù)合材料

聚己內(nèi)酯(poly-caprolactone，PCL)具有性能穩(wěn)定、成本低、生物相容性好等優(yōu)點，是骨和軟骨領(lǐng)域的一種很有前途的生物可吸收聚合物，在骨組織工程研究中被廣泛應(yīng)用于三維支架的制備。但純PCL支架親水性差、生物活性低，限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。隨著骨組織工程材料研究的發(fā)展，大量研究者將PCL與納米羥基磷灰石進(jìn)行復(fù)合，以改善支架性能或引入新的性能。向聲燚等[26]以納米羥基磷灰石(n-HA)和聚己內(nèi)酯(PCL)為原料，通過熔融共混方式制備了不同n-HA含量的PCL/Nano-HA復(fù)合材料，發(fā)現(xiàn)在n-HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時，3D打印試樣的拉伸強度和彎曲強度均達(dá)到最大值；當(dāng)壓縮應(yīng)變?yōu)?0%時，n-HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的PCL/n-HA復(fù)合材料試樣的壓縮應(yīng)力為最大值，如圖4和圖5。PCL/n-HA復(fù)合材料有利于其保持良好的生物活性，有望在骨組織支架中得到應(yīng)用。El-Habashy等[27]使用簡單制備技術(shù)實現(xiàn)了羥基磷灰石/聚己內(nèi)酯納米顆粒(HA/PCL NPs)的雜交，雜交 HA/PCL NPs 在間充質(zhì)細(xì)胞增殖和骨分散方面優(yōu)于羥基磷灰石納米顆粒(n-HA)，同時降低了細(xì)胞毒性。各種測試結(jié)果表明混合生物活性HA/PCL NPs可以提供比普通n-HA更突出的成骨潛力，作為獨立的納米平臺或作為復(fù)雜工程系統(tǒng)的一部分用于骨再生應(yīng)用。

圖4 不同n-HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下PCL/n-HA復(fù)合材料3D打印試樣的拉伸強度和彎曲強度Fig. 4 Tensile strength and bending strength of 3D printed samples for PCL/n-HA composites with different n-HA weight fractions

圖5 不同n-HA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下PCL/n-HA復(fù)合材料3D打印試樣的壓縮應(yīng)力-壓縮應(yīng)變曲線Fig. 5 Compressive stress-strain curve of 3D printed samples for PCL/n-HA composites with different n-HA weight fractions

3 n-HA/無機粒子復(fù)合材料

石墨烯(Graphene)是一種由sp2雜化碳原子構(gòu)成的平面蜂窩結(jié)構(gòu)，厚度相當(dāng)于一個原子的薄膜。石墨烯與氧化石墨烯(Graphene Oxide，GO)因高強度、高韌性、以及可影響納米材料的微觀結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能而被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域[28]。

Maleki-Ghaleh等[29]合成了鋅摻雜羥基磷灰石/石墨烯，各種表征證實其是具有抗菌和生物活性的納米復(fù)合材料，可用于骨組織工程。羥基磷灰石納米顆粒的抗菌性能在鋅摻雜和與石墨烯進(jìn)一步合成后都分別有提高。經(jīng)體外細(xì)胞評估結(jié)果表明，培養(yǎng)基中的羥基磷灰石納米顆粒不僅無毒，還增強了骨髓干細(xì)胞增殖能力。這種摻雜羥基磷灰石/石墨烯材料具備了骨組織工程所需的理想的生物學(xué)特性。Li等[30]制備了海膽樣羥基磷灰石/石墨烯空心微球作為pH響應(yīng)骨藥物載體。復(fù)合微球具有海膽狀結(jié)構(gòu)，且BET表面積大、分散性好。實驗表明，復(fù)合藥物載體無細(xì)胞毒性，且緩釋性和pH響應(yīng)性良好，因此其作為骨藥物載體很有前途。Stefania 等[31]通過一種綠色友好且室溫下可規(guī)?；a(chǎn)的堿性共沉淀法合成了右旋糖酐接枝氧化鐵納米結(jié)構(gòu)材料(DM)，并用于功能化n-HA晶體。在納米復(fù)合材料中加入不同量的DM雜化材料，合成過程中添加DM不會影響產(chǎn)物(DM/n-HA納米復(fù)合材料)的初生晶疇。增殖實驗顯示，若沒有外部磁場，則不受所用DM量的影響。有趣的是，分析還表明DM/n-HA納米復(fù)合材料對DM顆粒單獨誘導(dǎo)的抗增殖活性可能具有屏蔽作用，所獲得的異質(zhì)結(jié)構(gòu)可用于制造預(yù)期的生物器件，作為骨填充劑和機械傳導(dǎo)劑。

4 n-HA/生長因子復(fù)合材料

骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP) 是一種存在于骨基質(zhì)中的酸性多肽類物質(zhì)，可以誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及未分化的間充質(zhì)細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。BMP 已被成功用于骨折、骨延遲愈合以及骨缺損的治療。因此，BMP 與納米羥基磷灰石支架材料進(jìn)行復(fù)合便具有既能填充缺損局部進(jìn)行力學(xué)支撐，又能加速骨愈合的優(yōu)勢，成為近年來骨組織工程研究的熱點。

Bal等[32]通過體內(nèi)實驗和體外實驗探討了PLA-PEG和n-HA復(fù)合材料作為BMP-2載體的有效性。實驗結(jié)果證實n-HA/PLA-PEG復(fù)合材料通過低劑量BMP-2實現(xiàn)有效的骨再生，這種新型復(fù)合材料在臨床應(yīng)用(脊柱融合、大骨缺損和非愈合)中具有極大的潛力。Zhu等[33]制備了一種n-HA/rhBMP-2復(fù)合人造骨材料，通過對照實驗發(fā)現(xiàn)Adv-hBMP-2/MC3T3-E1納米HA復(fù)合人造骨相對于MC3T3-E1納米HA復(fù)合人造骨或納米HA人造骨具有更強的骨缺損修復(fù)能力，在臨床治療骨缺損中大有前景。Cai等[34]使用混合和冷凍干燥法來開發(fā)BMP-2-n-HA-COL支架。這種BMP-2-n-HA-COL支架未表現(xiàn)出生物毒性，并且被證明可以促進(jìn)BMSC的黏附、增殖和分化，因此可以進(jìn)一步修飾以構(gòu)建優(yōu)化的支架，以用于未來的骨組織工程。

5 結(jié)語與展望

仿生n-HA復(fù)合材料合成步驟簡單，兼具優(yōu)異的機械性能和生物性能，與單純的HA材料相比具有明顯的優(yōu)越性，在骨組織工程領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力。但對于n-HA復(fù)合材料用于骨組織工程支架的研究有以下幾個方面值得進(jìn)一步深入思考：(1)關(guān)于n-HA基復(fù)合支架的力學(xué)性能，一方面由于n-HA納米粒子固有的易團聚性，使其很難在高聚物中均勻分散，以致難以獲得高強度多孔材料，故可考慮對n-HA表面進(jìn)行改性，以提高其與高聚物的界面結(jié)合性；另一方面，隨著人們對天然纖維研究的深入，使用天然麻纖維、竹纖維、蠶絲等增加其強度是一種有效途徑。(2)關(guān)于n-HA基復(fù)合支架的成骨活性，雖然n-HA與骨的無機組分類似，但還是存在一些微量元素的差別，僅靠單一模擬天然骨組分的n-HA多孔復(fù)合材料用于骨組織工程支架，其成骨活性不足，難以滿足血管化骨的形成。因而一方面可考慮對n-HA本身進(jìn)行微量元素?fù)诫s或引入具有成骨活性的小分子制備雜化納米磷灰石；另一方面也可考慮引入黃酮類小分子代替價格高昂的生長因子來獲得高成骨活性的多孔支架。(3)不可忽略的是，支架材料植入骨缺損處不可避免地會帶來細(xì)菌感染，導(dǎo)致的長期炎癥對骨和周圍軟組織造成嚴(yán)重?fù)p傷，不利于骨組織生長，因而n-HA基多孔材料的抗菌性有待提高，故也可以考慮制備抗菌的n-HA納米粒子，或考慮與具有抗菌性的高聚物復(fù)合制備成具有持久抗菌性的多孔材料用于骨組織工程支架材料。(4)由于n-HA基復(fù)合材料高度的多孔結(jié)構(gòu)嚴(yán)重削弱了其力學(xué)性能及降解性能，因而應(yīng)綜合考慮其多孔結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能、降解性能等方面的平衡性，進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)合支架的各種性能，使其滿足臨床應(yīng)用的要求，為骨缺損病人帶來新的治療手段。