劉伶俐,索紋紋,徐飛良,黃向榮,萬譯文
(1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所,中國 長沙 410153;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(長沙),中國 長沙 410153;3.湖南省飼料工業(yè)辦公室,中國 長沙 410011;4.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心,中國 常德 415000)
有機(jī)磷、有機(jī)氯等農(nóng)藥因具有高毒或劇毒而逐漸被各國所限用或禁用,且大量、頻繁地使用這些農(nóng)藥也使害蟲產(chǎn)生了抗藥性[1]。土壤作為農(nóng)藥在環(huán)境中的蓄積地,其降解速度較慢,持續(xù)性、高濃度使用高毒農(nóng)藥可能會(huì)對(duì)水體、大氣、農(nóng)產(chǎn)品等產(chǎn)生不同程度的化學(xué)污染和殘留風(fēng)險(xiǎn),進(jìn)而給食用者的健康帶來潛在危害[2],因此研究開發(fā)毒性低、高效且與環(huán)境相容性好的新穎殺蟲劑,已成為國內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)[3]。作為甲胺磷、馬拉硫磷的替代品,低毒、高效的酰胺類殺蟲劑(以氯蟲苯甲酰胺[4]、氟蟲雙酰胺[5]、唑蟲酰胺[6]及氟啶蟲酰胺[7]為代表)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大面積推廣應(yīng)用。但隨著使用劑量的不斷增大,殺蟲劑與環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品之間的安全問題就逐漸顯現(xiàn)[8],為此國際食品法典委員會(huì)、美國、日本、歐盟等均制定了國際公約、法規(guī)及限量標(biāo)準(zhǔn),對(duì)合理科學(xué)使用農(nóng)藥、保護(hù)環(huán)境起到了積極的作用。但我國GB 2763-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留量》僅對(duì)唑蟲酰胺的最大殘留限量(MRL)進(jìn)行了規(guī)定,對(duì)另外3種僅作了臨時(shí)限量規(guī)定[9]。
目前,關(guān)于4種酰胺類殺蟲劑的報(bào)道更多地集中于單個(gè)物質(zhì)的殘留分析檢測[10,11]、降解動(dòng)態(tài)研究[12-14],分析方法主要有液相色譜法[6,13]、液相色譜-質(zhì)譜法[10,11]。目前,采用同一種前處理方法及色譜檢測條件測定土壤中4種酰胺類殺蟲劑殘留量的研究尚未見報(bào)道。本研究采用分散固相萃取(QuEChERS)凈化結(jié)合HPLC法,同時(shí)測定土壤中氟蟲雙酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟啶蟲酰胺、唑蟲酰胺的殘留量。
配備紫外檢測器(UV)的LC-20型高效液相色譜儀(島津公司,日本);R-3平行蒸發(fā)器(布奇公司,瑞士);Lab M64氮吹濃縮裝置(北京萊伯泰科儀器股份有限公司,中國),Z323K高速離心機(jī)(賀默公司,德國);BX8200HP超聲波清洗器(上海新苗醫(yī)療械制造有限公司,中國);SHA82A 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器(金壇市品玻實(shí)驗(yàn)儀器廠,中國)。
氟蟲雙酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟啶蟲酰胺、唑蟲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥97.0%,Dr公司,德國),乙腈(色譜純,默克公司,德國),PSA(N-丙基乙二胺,粒徑:40~63 μm),C18硅膠(粒徑:60~200 μm),實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T 6682中一級(jí)水的規(guī)定。
1.2.1 樣品提取及凈化 準(zhǔn)確稱取篩分好的土壤樣品10.00 g(±0.02 g)置于50 mL 錐形瓶中,加入20 mL乙腈,混勻后加蓋超聲提取10 min,再置于振蕩器中提取24 h。將上清液全部轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,在6 000 r·min-1下離心10 min。準(zhǔn)確吸取10.00 mL上清液,將其轉(zhuǎn)移到離心管或蒸發(fā)管中,在45 ℃下氮吹或蒸至近干。隨后加入1.00 mL流動(dòng)相、1.00 mL乙腈渦旋混勻以溶解殘?jiān)?,并全部轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中。加入100 mg PSA和100 mg C18 混勻,6 000 r·min-1下離心5 min,上清液過0.22 μm濾膜,以供高效液相色譜儀進(jìn)行測定。
1.2.2 色譜條件的設(shè)定 采用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm),流動(dòng)相采用乙腈-0.1 mol·L-1乙酸銨溶液等度洗脫,流速0.8 mL·min-1,進(jìn)樣量20 μL,柱溫35 ℃,檢測波長265 nm。
1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制及繪制 分別準(zhǔn)確稱取氟蟲雙酰胺、氯蟲苯甲酰胺、唑蟲酰胺和氟啶蟲酰胺的標(biāo)準(zhǔn)品適量,用乙腈稀釋定容至100 mL,配制成濃度為100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,在-18 ℃下避光保存,有效期為6個(gè)月。分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,并用乙腈稀釋配制成0.05,0.1,0.5,1.0,5.0 mg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)配現(xiàn)用。采用標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(x,單位為mg·L-1)與峰面積(y)來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。
1.2.4 添加與回收 在未施過上述4種殺蟲劑的土壤中添加氟蟲雙酰胺、氯蟲苯甲酰胺、氟啶蟲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,其添加質(zhì)量比分別為0.2,1.0,2.0 μg·g-1;在未施過上述4種殺蟲劑的土壤中添加唑蟲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,其添加質(zhì)量比分別為0.4,2.0,4.0 μg·g-1。每個(gè)處理設(shè)計(jì)6次重復(fù),以此計(jì)算添加回收率的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD值)。
有文獻(xiàn)報(bào)道[15,16],將氯蟲苯甲酰胺、氟啶蟲酰胺、氟蟲雙酰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外光譜或DAD全波長掃描,在200~300 nm均有較好的紫外吸收,筆者對(duì)4種酰胺類殺蟲劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行210 nm和265 nm的紫外掃描,得到相應(yīng)的紫外吸收光譜圖(限于篇幅,以氟啶蟲酰胺為例,見圖1)。210 nm的色譜圖中,乙腈溶劑峰的影響較為明顯,并且干擾氟啶蟲酰胺的出峰及定量;當(dāng)選用265 nm作為檢測波長時(shí),4種物質(zhì)均有較強(qiáng)的吸收峰,同時(shí)雜質(zhì)響應(yīng)值小、溶劑干擾較小、實(shí)驗(yàn)分析過程穩(wěn)定,因此最終確定265 nm作為檢測波長。
圖1 土壤中不同波長氟啶蟲酰胺色譜圖Fig. 1 Chromatograms of different wavelengths of Flonicamie in soil
提取土壤中農(nóng)藥殘留時(shí)多采用二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙腈或其組合等作為提取劑。覃國新等[17]的試驗(yàn)結(jié)果表明,用二氯甲烷做提取溶劑時(shí),氟蟲雙酰胺的回收率低,用乙酸乙酯提取時(shí)效果較為理想;甲醇提取物基質(zhì)復(fù)雜、樣品中水分和干擾物難以凈化,乙腈比乙酸乙酯極性大、分子小、提取能力更強(qiáng)。筆者以乙腈、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷為提取劑,比較其對(duì)土壤中4種殺蟲劑的提取效果,結(jié)果見圖2。經(jīng)乙腈提取的氟啶蟲酰胺和氟蟲雙酰胺的回收率均可達(dá)80%以上,氯蟲苯甲酰胺和唑蟲酰胺的回收率也在75%以上。乙酸乙酯作為提取劑,耗費(fèi)大量的有機(jī)溶劑,對(duì)氟蟲雙酰胺的損失較大、回收率達(dá)不到要求;甲醇作為提取劑,雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)峰有一定的干擾,唑蟲酰胺丟失,不滿足實(shí)驗(yàn)要求;二氯甲烷作為提取劑,提取液渾濁、雜質(zhì)干擾明顯,且氟蟲雙酰胺和唑蟲酰胺的提取效果極低,均達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求。故最終選用乙腈作為土壤的提取劑,以確保目標(biāo)物能被有效提取。
圖2 土壤中4種提取劑色譜圖Fig. 2 Chromatograms of four kinds of extractants in soil
土壤樣品因其本身基質(zhì)較為復(fù)雜,干擾因素較多,需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬艋幚聿拍芘懦蓴_、獲得較好的分離效果。土壤樣品有多種凈化方法,如固相萃取凈化[18]、凝膠滲透色譜凈化[19]等,但這些凈化方法較為復(fù)雜、耗時(shí)長、成本高,現(xiàn)多采用QuEChERS方法或改進(jìn)的QuEChERS方法進(jìn)行樣品的凈化,依據(jù)不同的基質(zhì),靈活地選擇萃取溶劑和吸附劑,以更為快速、經(jīng)濟(jì)、高效地凈化樣品[20-22]。本文對(duì)比了C18,PSA和炭黑的凈化效果,試驗(yàn)結(jié)果表明,炭黑凈化會(huì)導(dǎo)致唑蟲酰胺回收率偏低或丟失;C18和PSA的凈化效果較為理想,4種物質(zhì)的回收率均在75%以上。C18和PSA加入量不同對(duì)4種物質(zhì)回收率的影響結(jié)果見表1。隨著C18和PSA用量的增加,其雜質(zhì)含量降低、凈化效果亦有所提升,但氯蟲苯甲酰胺的回收率會(huì)降低。為保持良好的添加回收率并達(dá)到去除雜質(zhì)的目的,筆者最終選用C18和PSA加入量均為100 mg的方案,其回收率均在80%以上,且雜質(zhì)干擾較少。
表1 C18和PSA不同加入量對(duì)4種物質(zhì)回收率的影響Table 1 The influence of different dosage of C18 and PSA on the recovery of four substances
為了獲得較好的對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的保留分離效果及其響應(yīng),何旭峰等[2]對(duì)比了甲醇及乙腈與水的混合流動(dòng)相,發(fā)現(xiàn)以乙腈為流動(dòng)相時(shí)能得到較好的分離效果和較高的靈敏度,在此流動(dòng)相中添加乙酸銨后,目標(biāo)物質(zhì)的峰型和響應(yīng)更好。筆者選用乙腈-0.1 mol·L-1乙酸銨水溶液體系為流動(dòng)相,按不同體積比(80∶20,60∶40,50∶50,40∶60,20∶80)進(jìn)行比較試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)采用梯度洗脫時(shí),目標(biāo)物基線不平穩(wěn),氟蟲雙酰胺及唑蟲酰胺出峰時(shí)間較晚,且峰形不對(duì)稱,見圖3;而采用等度洗脫時(shí),4種物質(zhì)的峰型均較尖銳,也無溶劑峰的干擾,出峰時(shí)間明顯縮短,提高了檢測效率。當(dāng)乙腈和0.1 mol·L-1乙酸銨水溶液的體積比為60∶40時(shí),4種物質(zhì)的出峰時(shí)間較早、峰型較好、分離效果滿足殘留檢測要求。
圖3 不同洗脫方式下4種酰胺類物質(zhì)色譜圖Fig. 3 Chromatograms of four amides in different elution modes of mobile phase
按照1.2.3的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制,并按照上述色譜條件上機(jī)測定;以3倍和10倍信噪比(S/N值)分別確定土壤中4種物質(zhì)的檢出限(LOD值)和定量限(LOQ值),其線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、LOD和LOQ值見表2。各參數(shù)優(yōu)化后,4種酰胺類物質(zhì)在 0.05~5.0 mg·L-1范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9。實(shí)驗(yàn)得出氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺和氟啶蟲酰胺的LOD值均為0.20 μg·g-1,唑蟲酰胺的LOD值為0.40 μg·g-1,此結(jié)果表明該方法適用于土壤中4種酰胺類殺蟲劑的定量測定。
表2 4種物質(zhì)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and quantitative limits of four amide insecticides
以不含氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺、唑蟲酰胺和氟啶蟲酰胺的土壤樣品為本底,氟啶蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺和氟蟲雙酰胺添加量為0.2~2.0 μg·g-1,唑蟲酰胺添加量為0.4~4.0 μg·g-1,按照1.2方法進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。從表3可以看出,土壤中氯蟲苯甲酰胺、氟蟲雙酰胺和氟啶蟲酰胺在0.2,1.0,2.0 μg·g-1時(shí)的回收率為96.7%~106%,RSD值為1.42%~2.60%;唑蟲酰胺在0.4,2.0,4.0 μg·g-1時(shí)的回收率為88.2%~98.7%,RSD值為1.04%~1.16%,表明該方法回收率高、精密度好,適用于土壤中4種酰胺類殺蟲劑的檢測要求。
表3 空白土壤方法準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果(n=6)Table 3 Test results of accuracy and precision for the method from soil samples(n=6)
本文建立了QuEChERS凈化結(jié)合HPLC同時(shí)測定土壤中氯蟲苯甲酰胺、氟啶蟲酰胺、唑蟲酰胺和氟蟲雙酰胺殘留量的檢測方法。本方法具有定量準(zhǔn)確、重復(fù)性好、線性關(guān)系良好、精密度高等特點(diǎn),適用于同時(shí)測定土壤中氯蟲苯甲酰胺、氟啶蟲酰胺、唑蟲酰胺和氟蟲雙酰胺的殘留量。