徐紹娜 徐曉焱 ?；刍?馬山 張淑芹 周晶琳

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一。在我國，每年約有81 萬例新發(fā)肺癌患者，占全世界年度新發(fā)肺癌病例數(shù)的1/3[1]。據(jù)報道，早期肺癌患者5年生存率可達(dá)90%，而進(jìn)展期肺癌患者5年生存率僅為17.6%[2]。由此可見，對于肺癌患者盡早診斷、盡早治療是其生存的關(guān)鍵。雖然隨著影像學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展完善，我國早期肺癌診斷率不斷提高，但是目前我國早期肺癌診斷率也僅為10%，多數(shù)肺癌患者初次診斷時已處于晚期[3]。因此，研究肺癌發(fā)展的分子機(jī)制對提高肺癌患者生存率意義重大。

長鏈非編碼RNA（Long-chain non-coding RNA，lncRNA）是長度超過200 個核苷酸的單鏈非編碼RNA，最初被認(rèn)為是“垃圾”RNA。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 在腫瘤細(xì)胞活動中發(fā)揮重要作用，如腫瘤細(xì)胞化學(xué)抗性、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等[4，5]。尿道癌相關(guān)基因1（Urothelial cancer associated 1，UCA1）是一種在多種惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的lncRNA，并被發(fā)現(xiàn)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移以及化療抵抗性[6～8]。早期的一項研究發(fā)現(xiàn)，UCA1 在胃癌多藥耐藥性細(xì)胞中表達(dá)升高，而敲低UCA1 則可以逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞多藥耐藥性[8]。然而，UCA1 表達(dá)對肺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響，以及其作用的分子機(jī)制仍未明確。細(xì)胞色素P450 家族1 亞家族B 成員1（Cytochrome P450 family 1 subfamily B member 1，CYP1B1）是細(xì)胞色素P450 超基因家族的成員，并且參與多種重要轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，其可以通過氧化和代謝多種前致癌物和抗癌藥物幫助癌細(xì)胞降低化學(xué)藥物的毒性，如活化多環(huán)芳烴、雜環(huán)胺、芳族胺、硝酸鹽和介導(dǎo)17-雌二醇的C4-羥基化[9，10]。此外，CYP1B1 代謝物4-羥基化的雌激素可顯著增加8-羥基鳥嘌呤的水平，引起DNA 單鏈斷裂，具有DNA 損傷作用，并具有潛在的致癌性[9]。有研究認(rèn)為CYP1B1在腫瘤組織有特異性表達(dá)，可能在肺癌的形成中起著重要作用[11]。MicroRNA（miRNA）是一種內(nèi)源性的小RNA 分子，在基因轉(zhuǎn)錄后能調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。許多miRNA 被證實與包括肺癌的多種腫瘤相關(guān)，如過表達(dá)miR-513a-3p 后，人肺腺癌細(xì)胞A549/C DDP 和SPC-A-1 中GSTP1 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，miR-513a-3p 可以在轉(zhuǎn)錄后水平靶向調(diào)控GSTP1基因的表達(dá)[12]。本研究探討lncRNA UCA1 通過microRNA-513a-3p（miR-513a-3p）和CYP1B1 分子軸對肺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 研究方法對比人正常肺上皮細(xì)胞（BEAS-2B）與不同肺癌細(xì)胞（A549、H1299、NCI-H3255、NCI-H460、NCI-H838）中UCA1 表達(dá)以及細(xì)胞增殖、遷移能力。生物信息學(xué)分析UCA1、miR-513a-3p、CYP1B1 相互結(jié)合的基因序列。敲低肺癌細(xì)胞UCA1表達(dá)，上調(diào)肺癌細(xì)胞miR-513a-3p 表達(dá)，下調(diào)肺癌細(xì)胞miR-513a-3p 表達(dá)。雙熒光素酶基因報告實驗分析其在肺癌細(xì)胞中表達(dá)的相互影響。共同向肺癌細(xì)胞A549 中轉(zhuǎn)入si-UCA1 和miR-513a-3p 抑制劑（inhibitor），對比其與si-UCA1 肺癌細(xì)胞中CYP1B1表達(dá)及細(xì)胞增殖、遷移能力。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染人正常肺上皮細(xì)胞（BEAS-2B）和肺癌細(xì)胞（A549、H1299、NCI-H3255、NCI-H460 和NCI-H838）均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。所有細(xì)胞均被培養(yǎng)于添加10%胎牛血清（Gbico，美國）的DMEM 培養(yǎng)基（Invitrogen，美國），培養(yǎng)條件為37℃和5%CO2。miRNA 轉(zhuǎn)染陰性對照（NC）、miR-513a-3p 模擬物（mimic）、miR-513a-3p抑制劑（inhibitor）、小干擾RNA 轉(zhuǎn)染陰性對照（si-NC）和UCA1 小干擾RNA（si-UCA1）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1，并根據(jù)LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑（Thermofiher，美國）說明書被直接轉(zhuǎn)入肺癌細(xì)胞A549，轉(zhuǎn)染72h 進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 PCR 引物、miRNA 及小干擾RNA 序列

1.3 定量PCR向細(xì)胞中加入RNAiso plus（TAKARA，日本）以提取總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，日本）說明書配置反轉(zhuǎn)錄體系以制備cDNA。根據(jù)GoTaq? qPCR Master Mix 試劑盒（Promega，中國）說明書配置20μl 定量PCR 反應(yīng)體系，通過定量PCR 儀擴(kuò)增目的基因。以β-actin 為內(nèi)參，用2-△△CT法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.4 CCK8 檢測細(xì)胞增殖活性在96 孔板中接種104個細(xì)胞，培養(yǎng)72h 后去除培養(yǎng)基，加無菌PBS 洗滌3 遍后加入10μl CCK8 試劑（碧云天生物科技公司，中國）和100μl DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液混合物，37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)2h，酶標(biāo)儀測定OD490。

1.5 Transwell 小室檢測細(xì)胞遷移能力8μm 孔徑的24 孔Transwell 小室用于評估細(xì)胞遷移能力，Transwell 上室接種0.5×105個細(xì)胞/100μl 培養(yǎng)基，Transwell 下室加入600μl 含有2.5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)24h 后，去除Transwell 下室細(xì)胞培養(yǎng)基，無菌PBS 清洗兩遍后，加入甲醛室溫固定30min 后再加入0.1%結(jié)晶紫室溫染色20min，PBS 清洗3 遍后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞，每孔觀察3 個視野，計數(shù)。

1.6 雙熒光素酶基因報告實驗向肺癌細(xì)胞（A549）中轉(zhuǎn)入小干擾RNA（si-UCA1）敲低肺癌細(xì)胞UCA1 表達(dá)（si-NC 作為陰性對照），轉(zhuǎn)入miR-513a-3p 模擬物（mimic）上調(diào)肺癌細(xì)胞miR-513a-3p 表達(dá)（NC 作為陰性對照），轉(zhuǎn)入miR-513a-3p 抑制劑（inhibitor）下調(diào)肺癌細(xì)胞miR-513a-3p 表達(dá)。雙熒光素酶基因報告實驗分析其在肺癌細(xì)胞中表達(dá)的相互影響。構(gòu)建肺癌細(xì)胞雙熒光素酶報告基因載體，合成待檢測的基因與對照組，然后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染（同1.2），按照檢驗實驗操作步驟檢測試劑盒，試驗過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，預(yù)測實驗結(jié)果。

1.7 生物信息學(xué)分析方法采用公共數(shù)據(jù)庫中肺癌組織的高通量測序數(shù)據(jù)或微陣列基因芯片數(shù)據(jù)，分析UCA1 與miR-513a-3p 相互結(jié)合的基因序列，使用targetscan 數(shù)據(jù)庫（http://www.targetscan.org/vert_71/）對miR-513a-3p 靶向結(jié)合的基因進(jìn)行預(yù)測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCA1 在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)及與增殖、遷移的關(guān)系與人正常肺上皮細(xì)胞（BEAS-2B）相比，UCA1 在不同肺癌細(xì)胞（A549、H1299、NCI-H3255、NCI-H460 和NCI-H838）中表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A。此外，與BEAS-2B相比，CCK8 檢測顯示肺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性顯著升高，遷移到Transwell 下室的肺癌細(xì)胞數(shù)目顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；此外，在不同肺癌細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖和遷移能力隨UCA1 表達(dá)升高而升高，見圖1B、1C。

2.2 UCA1 靶向抑制肺癌細(xì)胞中miR-513a-3p 的表達(dá)生物信息學(xué)分析顯示，UCA1 與miR-513a-3p 具有相互結(jié)合的基因序列（見圖2A）。雙熒光素酶基因報告實驗顯示：與NC 相比，miR-513a-3p-mimic 可以顯著抑制轉(zhuǎn)入野生型UCA1 序列（WT-UCA1）組熒光素酶活性（P＜0.05），而不影響轉(zhuǎn)入突變型UCA1 序列（MUT-UCA1）組熒光素酶活性（P＞0.05）；同樣，與NC 相比，miR-513a-3pinhibitor 可以顯著升高轉(zhuǎn)入WT-UCA1 組熒光素酶活性（P＜0.05），而不影響轉(zhuǎn)入MUT-UCA1 組熒光素酶活性（P＞0.05），見圖2B。

通過轉(zhuǎn)入針對UCA1 的小干擾RNA（si-UCA1）以敲低UCA1 在肺癌細(xì)胞A549 中的表達(dá)，結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)入無意義序列的小干擾RNA 陰性對照組（si-NC）相比，si-UCA1 顯著降低肺癌細(xì)胞中UCA1的表達(dá)（P＜0.05），顯著提高肺癌細(xì)胞中miR-513a-3p 的表達(dá)（P＜0.05），見圖3。

2.3 miR-513a-3p 對肺癌細(xì)胞中CYP1B1 表達(dá)的影響通過targetscan 數(shù)據(jù)庫（http：//www.targetscan.org/vert_71/）對miR-513a-3p 靶向結(jié)合的基因進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CYP1B1 與miR-513a-3p 具有相互結(jié)合的基因序列（見圖4A）。雙熒光素酶基因報告實驗顯示：與轉(zhuǎn)入無意義基因序列組（NC）相比，miR-513a-3p 模擬物（mimic）可以顯著抑制轉(zhuǎn)入野生型CYP1B1 序列（WT-CYP1B1）組熒光素酶活性（P＜0.05），而不影響轉(zhuǎn)入突變型CYP1B1 序列（MUT-CYP1B1）組熒光素酶活性（P＞0.05）；同樣，與NC 相比，miR-513a-3p 抑制劑（inhibitor）可以顯著升高轉(zhuǎn)入WT-CYP1B1 組熒光素酶活性（P＜0.05），而不影響轉(zhuǎn)入MUT-CYP1B1 組熒光素酶活性（P＞0.05），見圖4B。此外，與NC 組相比，mimic 顯著降低肺癌細(xì)胞A549 中CYP1B1 的表達(dá)（P＜0.05），而inhibitor 顯著升高肺癌細(xì)胞A549 中CYP1B1 的表達(dá)（P＜0.05），見圖4C。

2.4 UCA1/miR-513a-3p/CYP1B1 軸調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的增殖和遷移與si-UCA1 組相比，共同向肺癌細(xì)胞A549 中轉(zhuǎn)入si-UCA1 和miR-513a-3p 抑制劑（inhibitor）可以顯著提高因轉(zhuǎn)入si-UCA1 而降低的CYP1B1 表達(dá)、腫瘤細(xì)胞活性及遷移數(shù)目，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

3 討論

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示[13]，肺癌是世界第五大常見惡性腫瘤。在世界范圍內(nèi)，每年新發(fā)肺癌患者高達(dá)100 萬，因肺癌死亡的人數(shù)超過70 萬。在中國，肺癌發(fā)病率居所有惡性腫瘤的首位，每年約有81 萬例肺癌新病例[14]。由于缺乏有效的早期診斷技術(shù)，大多數(shù)肺癌患者被診斷時已為晚期[15]。因此，研究肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對于提高肺癌患者生存率、延長患者生存時間意義重大。本研究顯示，UCA1 在肺癌細(xì)胞中表達(dá)高于人正常肺黏膜上皮細(xì)胞，并且在不同類型肺癌細(xì)胞中，UCA1 表達(dá)越高，肺癌細(xì)胞增殖和遷移能力越強(qiáng)。已有研究發(fā)現(xiàn)，UCA1 在膀胱癌[6]、乳腺癌[16]以及其他多種惡性腫瘤中表達(dá)增高，并且其高表達(dá)可促進(jìn)惡性腫瘤的增殖和遷移，表明UCA1 在惡性腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮癌基因功能。此外，UCA1 被發(fā)現(xiàn)在胃癌多藥耐藥性細(xì)胞中表達(dá)升高，而敲低UCA1 則可以逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞多藥耐藥性[8]。結(jié)合本研究結(jié)果，提示UCA1 在肺癌細(xì)胞中發(fā)揮癌基因功能，并與促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和遷移有關(guān)。

作為一個非編碼RNA，UCA1 并不能直接編碼蛋白質(zhì)，其主要通過兩種方式參與細(xì)胞生命活動的調(diào)控[17，18]：直接調(diào)控編碼蛋白的基因轉(zhuǎn)錄；通過與編碼蛋白基因競爭micRNA 結(jié)合位點而間接調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，UCA1 及CYP1B1 存在與miR-513a-3p 相同的結(jié)合序列，并且經(jīng)雙熒光素酶基因報告實驗證實，miR-513a-3p 與UCA1和CYP1B1 均靶向結(jié)合。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，敲低UCA1 或上調(diào)miR-513a-3p 可下調(diào)肺癌細(xì)胞中CYP1B1 表達(dá)，抑制miR-513a-3p 可上調(diào)CYP1B1表達(dá)，而同時敲低UCA1 和下調(diào)miR-513a-3p 則可上調(diào)因敲低UCA1 下調(diào)的CYP1B1 表達(dá)，提示UCA1 通過與CYP1B1 競爭性結(jié)合miR-513a-3p 而正向調(diào)控CYP1B1 表達(dá)。與si-UCA1 組相比，共轉(zhuǎn)入si-UCA1 和inhibitor 可以顯著提高因轉(zhuǎn)入si-UCA1 而降低的CYP1B1 表達(dá)和肺癌細(xì)胞的增殖、遷移能力，表明UCA1 通過間接促進(jìn)CYP1B1 表達(dá)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和遷移。UCA1 的這種基因調(diào)控方式在之前的研究中也被發(fā)現(xiàn)，如陸小琴等[19]研究顯示，UCA1 通過靶向調(diào)控miR-613 而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，UCA1 在肺癌細(xì)胞中表達(dá)升高，并且其高表達(dá)通過與CYP1B1 競爭性結(jié)合miR-513a-3p而間接促進(jìn)CYP1B1 的表達(dá)，最終促進(jìn)肺癌細(xì)胞在體外增殖和遷移。但本研究存在不足：由于缺乏肺癌組織樣本，未能驗證UCA1 在肺癌組織中的表達(dá)，及其與miR-513a-3p 和CYP1B1 表達(dá)的關(guān)系；本研究僅使用細(xì)胞系在體外研究UCA1 的功能，缺乏體內(nèi)研究數(shù)據(jù)。