路振香，王 東，洪皓正，王 浩，王 奇，周 明，郭偉娜,2，劉 暢,2，張 寧，李賀俠

(1.安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽(yáng) 233100；2.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽鳳陽(yáng) 233100；3.南京市棲霞區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇南京 210046；4.安徽省和縣動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，安徽和縣 238200)

志賀氏菌(Shigella)包括痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌和宋內(nèi)志賀氏菌，其中痢疾志賀氏菌引起的痢疾發(fā)病迅速，表現(xiàn)強(qiáng)烈；福氏志賀氏菌和宋內(nèi)志賀氏菌是導(dǎo)致人類痢疾的主要流行菌型。志賀氏菌感染力強(qiáng)[1]、耐藥嚴(yán)重、多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)[2]。志賀氏菌可引起腹瀉和發(fā)熱性痢疾，嚴(yán)重者可出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和伴發(fā)敗血癥。近年來(lái)，獼猴[3]、雞[4]、牦牛[5]、羊[6]等動(dòng)物感染志賀氏菌報(bào)道也在增多。本文對(duì)2020年9月安徽滁州某養(yǎng)鵝戶送檢的以體溫升高、精神沉郁、排灰白色或黃白色的稀薄糞便以及腸道廣泛出血、胰腺出血、脾臟淤血而表面呈斑駁樣、肝臟稍微腫大的18日齡病死鵝進(jìn)行病原菌的分離鑒定、耐藥及毒力基因檢測(cè)，為該病實(shí)驗(yàn)室診斷和養(yǎng)殖戶用藥治療提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 養(yǎng)殖戶送檢的主要以體溫升高、精神沉郁、采食量下降以及排灰白或者黃白色稀糞、頭頸震顫為主要特征的18日齡病死鵝6只，采取其肝臟作為病料。

1.1.2 試劑 DNA marker DL 2 000、PremixTaq，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片(批號(hào)2021015)，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 臺(tái)式高速離心機(jī)(H3-18K)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；梯度PCR儀，北京東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析儀，上海天能科技有限公司生產(chǎn)；電泳儀，北京君意電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 分離菌分離培養(yǎng)和形態(tài)觀察 無(wú)菌操作蘸取病死鵝的肝臟組織分別劃線接種于LB瓊脂和麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，將培養(yǎng)出的單個(gè)典型菌落進(jìn)行純化、革蘭氏染色，油鏡下觀察。

1.2.2 分離菌生化試驗(yàn)、16S rRNA序列PCR擴(kuò)增、測(cè)序及同源性分析 參照文獻(xiàn)[7]對(duì)分離菌分別進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)，VP試驗(yàn)，甲基紅試驗(yàn)以及吲哚形成試驗(yàn)。細(xì)菌通用引物序列為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：GGTTAACCTTGTTACGACTT，由通用生物技術(shù)(安徽)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系： PremixTaq25 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，細(xì)菌DNA模板2 μL，補(bǔ)充超純水至總體積50 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min；94℃ 30 s，46℃ 30 s，72℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，15℃結(jié)束反應(yīng)。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳(110 V電泳30 min)，于凝膠成像系統(tǒng)成像，觀察記錄結(jié)果，下同。將PCR產(chǎn)物送去通用生物技術(shù)(安徽)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在GenBank上比對(duì)，同源性分析，并建立進(jìn)化樹。

1.2.3 分離菌藥物敏感試驗(yàn)和耐藥基因檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[8]用11種抗生素對(duì)分離菌進(jìn)行測(cè)試。根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]設(shè)計(jì)5對(duì)分離菌的耐藥基因引物，引物由通用生物技術(shù)(安徽)有限公司合成(表1)。參照1.2.2的方法將反應(yīng)體系總體積減半即25 μL，5對(duì)耐藥基因PCR體系與條件均相同，其PCR反應(yīng)條件為:95℃ 5 min；94℃ 45 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，15℃結(jié)束反應(yīng)。10 g/L瓊脂糖電泳，觀察記錄結(jié)果。

1.2.4 分離菌毒力基因檢測(cè) 按文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)5對(duì)福氏志賀氏菌毒力基因引物，引物由通用生物技術(shù)(安徽)有限公司合成(表2)。PCR反應(yīng)體系同1.2.3。反應(yīng)條件為：94℃ 2 min；94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，15℃結(jié)束反應(yīng)。10 g/L瓊脂糖電泳，觀察記錄結(jié)果。

表1耐藥基因及其序列

表2毒力基因及其引物序列

2 結(jié)果

2.1 分離菌革蘭氏染色、生化試驗(yàn)、16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

從病死鵝體內(nèi)分離到1株革蘭氏陰性單個(gè)散在細(xì)小桿菌，該菌在麥康凱瓊脂平板上為無(wú)色至淡粉色圓形半透明、光滑、濕潤(rùn)的小菌落；在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上為灰白色圓形微隆起、光滑濕潤(rùn)半透明小菌落。該菌能利用葡萄糖只產(chǎn)酸，不能利用乳糖和蔗糖，甲基紅試驗(yàn)為陽(yáng)性，吲哚及VP試驗(yàn)均為陰性。分離菌擴(kuò)增出了與預(yù)期片段大小一致的目的基因(圖1)。

2.2 分離菌16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹建立

將測(cè)序結(jié)果在GenBank上比對(duì)，該菌與登錄號(hào)為NR-026331.1福氏志賀桿菌同源性高達(dá)99.38%，因此該菌為福氏志賀氏菌。選取10株與該菌同源性較高的福氏志賀氏菌構(gòu)建進(jìn)化樹(圖2)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1.分離菌M.DNA Marker DL 2 000; 1.Isolate

2.3 分離菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

該菌對(duì)頭孢西丁、頭孢曲松、頭孢哌酮舒巴坦及頭孢噻呋鈉敏感性最高，對(duì)卡那霉素類(阿米卡星)及磺胺類藥物(復(fù)方新諾明)具有抵抗力(表3)。

圖2分離菌16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 分離菌耐藥、毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

該分離菌含有卡那霉素類耐藥基因aadA1、β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因blatem-1、磺胺類耐藥基因Sul1(圖3)。能擴(kuò)增出編碼多重調(diào)控蛋白的vira基因、編碼黏附與侵入Ia1基因以及編碼志賀氏菌腸毒素1的set1B基因(圖4)。

表3分離菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～3.aadA1、blatem-1、Sul1DNA Marker DL 2 000; 1-3.aadA1,blatem-1,Sul1

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～3.vira、Ia1、Set1BM.DNA Marker DL 2 000; 1-3.vira,Ia1,Set1B

3 討 論

本文從送檢病死鵝的肝臟組織中分離到1株革蘭氏陰性細(xì)小分散存在的桿菌，同源性分析可知，該菌為福氏志賀氏菌。該分離菌的培養(yǎng)特性及生化試驗(yàn)結(jié)果與福氏志賀氏菌相符。該分離菌對(duì)頭孢西丁、頭孢曲松、頭孢哌酮舒巴坦和頭孢噻呋鈉等頭孢菌素類藥物敏感，對(duì)米諾環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考、慶大霉素以及左氧氟沙星等藥物敏感性較低，對(duì)阿米卡星及復(fù)方新諾明不敏感。該分離菌含有卡那霉素耐藥基因aadA1、β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因blatem-1以及磺胺類耐藥基因Sul1。

福氏志賀氏菌的致病作用主要來(lái)自該菌本身的內(nèi)毒素和侵襲力，本試驗(yàn)對(duì)分離菌進(jìn)行5種毒力基因的PCR擴(kuò)增，結(jié)果該菌含有編碼多重調(diào)控基因調(diào)控蛋白基因vira，編碼黏附與侵入腸黏膜細(xì)胞腸毒性因子基因Ia1以及編碼志賀氏菌腸毒素1基因set1B，即該株分離菌含有多個(gè)毒力基因。該群鵝主要臨床癥狀包括體溫升高，排黃白色糊狀稀糞，采食量下降或者不食，精神萎靡；主要病理變化為肝臟、脾臟、腎臟稍微腫大，淤血，腸道廣泛出血，腸道空虛，氣囊混濁，這些臨床癥狀及病理變化與其毒力基因的存在有直接關(guān)系。