趙寧，史毅，馬暉玲

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中?美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學林學院，甘肅 蘭州 730070）

溫度是影響草坪草生長發(fā)育及生態(tài)分布的重要環(huán)境因子［1］。在我國，草坪草應(yīng)用存在北過渡帶，該地區(qū)具有夏季高溫高濕，雨熱同期的氣候特征［2］，處于此地區(qū)的冷季型草坪草受高溫影響導(dǎo)致越夏困難，時常出現(xiàn)夏枯或短期休眠現(xiàn)象，在表觀形態(tài)方面表現(xiàn)為草坪質(zhì)量及密度下降［3］，細胞層面表現(xiàn)為植物細胞產(chǎn)生過量的活性氧，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，膜損傷，酶紊亂甚至細胞死亡［4］，這極大地制約了冷季型草坪草的地域發(fā)展。因此，提高冷季型草坪草越夏能力是亟待解決的問題。

匍匐翦股穎（Agrostis stolonifera）為禾本科翦股穎屬冷季型草坪草，喜冷涼濕潤氣候，最適生長溫度為15～24 ℃［5］，對高溫的反應(yīng)較為敏感，具有耐寒、耐瘠薄、耐踐踏等特點［6］，由于其匍匐莖橫向蔓延能力強，耐頻繁低修剪［7］，葉片質(zhì)地細密，綠期長，適應(yīng)性強等優(yōu)良特性［8］，被廣泛應(yīng)用于高爾夫球場果嶺，網(wǎng)球場等高質(zhì)量養(yǎng)護水平場地和園林綠化工程。

通過噴施外源物質(zhì)來調(diào)控草坪草的耐熱性，具有快速、高效的特點，對短期內(nèi)快速增強草坪草的越夏能力具有重要作用［9］。2，3?丁二醇（2，3?butanediol，BD）作為一種揮發(fā)性化合物，常溫下為無色無味的液體，具有安全無毒等特性，此外，它是一種新型誘抗劑，具有促進植物生長，提高植物非生物脅迫抗性的作用［10］。在重金屬鎘、鹽堿、干旱等脅迫下，外源噴施BD 可有效減緩草坪草葉片相對含水量、葉綠素含量的損失速度，并在一定程度上提高植株氧化還原酶活性和滲透調(diào)節(jié)能力，緩解脅迫造成的氧化損傷，維持細胞膜的相對穩(wěn)定性，從而提高草坪草的抗逆能力，使其能夠更好地適應(yīng)脅迫環(huán)境［7，10-11］。在溫度方面，王振［4］研究發(fā)現(xiàn)在自然低溫脅迫下，由于BD 的存在，同源異地的秋茄（Kandelia obovata）幼苗呈現(xiàn)出不同的適應(yīng)性，含BD 等揮發(fā)性物質(zhì)的植株對低溫的適應(yīng)性更強，氧化還原酶活性更高，說明BD 能提高秋茄幼苗對低溫脅迫的耐受性。在高溫脅迫方面，史毅［11］研究報道了BD 對草坪草熱脅迫的耐受性有顯著增強作用。

本研究以匍匐翦股穎Penn A4（Agrostis stolon?ifera‘Penn A4’）為材料，在室內(nèi)盆栽條件下，于苗期噴施特定濃度的BD 溶液，測定高溫脅迫下Penn A4植株生理生化指標的變化，初步探討B(tài)D 對匍匐翦股穎耐熱性的影響，為生產(chǎn)上應(yīng)用外源BD 提高冷季型草坪草適應(yīng)過渡帶地區(qū)氣候特征提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料選用匍匐翦股穎Penn A4，千粒重為0.065~0.076 g，由北京克勞沃草業(yè)技術(shù)開發(fā)公司提供，產(chǎn)地為美國。供試試劑為2，3?丁二醇（主要成分為2，3?丁二醇，醇類試劑），購于山東西亞化工科技有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 種苗培育 先準確稱取20 g 匍匐翦股穎PennA4 種子，蒸餾水浸泡24 h 后，用70%乙醇溶液處理1 min，再用20%的次氯酸鈉溶液處理20 min，無菌水沖洗殘液，處理完的種子自然晾干，備用。細沙和營養(yǎng)土以2∶1 比例的沙土混合物為基質(zhì)，經(jīng)150 ℃烘箱處理8 h，自然冷卻，備用。

將滅菌后的種子按每盆1.7 kg/m3均勻播于小花盆中（長10 cm×寬10 cm×高12 cm），置于溫度為23 ℃晝/20 ℃夜，光周期為16 h 光照/8 h 黑暗，光照強度2000 lx、相對濕度為50%的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每天噴施蒸餾水，出苗14 d 起，每周留茬高度2 cm，修剪后噴施1/2 Hoagland 營養(yǎng)液，40 d 后進行如下處理。

1.2.2 BD 及高溫處理 試驗共設(shè)定常溫對照（H2O）、常溫丁二醇（BD）、高溫對照（H2O?H）、高溫丁二醇（BD?H）4 個處理。植株生長40 d 后隨機選取1/2盆栽，作為BD 處理組，葉面噴施BD 溶液（濃度為300 μmol/L），每盆約15 mL，每天1 次，連續(xù)處理3 d；1/2盆栽為對照組，噴施蒸餾水，每盆約15 mL，每天1 次，連續(xù)處理3 d。隨后將上述BD 處理組和對照組分別隨機平均分成兩組，一組仍置于23 ℃晝/20 ℃夜，光周期為16 h 光照/8 h 黑暗的組培室中培養(yǎng)，為常溫對照和常溫丁二醇處理；另一組移至以37 ℃晝/32 ℃夜為高溫脅迫的植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28 d，為高溫對照和高溫丁二醇處理。脅迫期間丁二醇處理組種苗每隔14 d噴施BD 溶液（300 μmol/L），蒸餾水處理組種苗噴施蒸餾水。分別于熱脅迫第0、7、14、21、28 天進行采樣，采取供試種苗葉片進行相關(guān)生理指標的測定，每處理每指標3 個生物學重復(fù)。

1.3 測定內(nèi)容及方法

1.3.1 植株表觀形態(tài)觀察 試驗期間每天對各處理下的植株生長狀況進行觀察，并于每周采樣完成后隨機挑選1 盆各處理下的Penn A4 盆栽，以黑布為背景，整齊擺放為一排用手機拍照記錄。

1.3.2 光合色素含量測定 取0.1 g 新鮮植物葉片，用95%的乙醇溶液遮光浸泡24 h，然后分別在470、649 和665 nm 波長下測定吸光度值。根據(jù)公式計算總?cè)~綠素（Chlorophyll，Chl）、類胡蘿卜素（Carotenoids，Car）含 量 和 葉 綠 素a/b（Chlorophyll a/b，Chla/b）值［12］。

1.3.3 細胞膜透性測定 用浸泡法［12］測定相對電導(dǎo)率（Relative conductivity，REC）；用硫代巴比妥酸法［12］測定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量；用碘化鉀分光光度法［13］測定過氧化氫（H2O2）含量。

1.3.4 抗氧化酶活性測定 采用氮藍四唑法［12］測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）；采用愈創(chuàng)木酚法［12］測定過氧化物酶（Peroxidase，POD）；采用紫外分光光度計法［14］測定抗壞血酸過氧化物酶（Ascor?bate peroxidase，APX）；采用紫外分光光度計法［12］測定谷朧甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）。

1.3.5 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量測定 采用酸性茚三酮比色法［12］測定游離脯氨酸（Free proline，Pro）含量；采用考馬斯亮藍染色法［12］測定可溶性蛋白（Soluble pro?tein，SP）含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0 軟件對所測數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用平均值和標準誤表示測定結(jié)果，分別對同一時間點不同處理進行單因素ANOVA 方差分析，并用Dun?can 法對各測定數(shù)據(jù)進行多重比較。采用Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BD 對高溫脅迫下Penn A4 植株葉綠素降解的影響

對Penn A4 植株形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)（圖1），不同處理組植株葉片鮮綠程度隨生長時間逐漸降低。常溫組植株較高溫組保持更旺盛的生長狀態(tài)，處理組間無明顯差異。高溫組植株則生長遲緩，葉片發(fā)黃枯萎，且隨脅迫程度的加深，枯萎癥狀更明顯，與對照組相比，經(jīng)BD 處理后Penn A4 葉片長勢明顯較旺盛，覆蓋率更高，葉色鮮綠，有光澤。

與植株形態(tài)表現(xiàn)相對應(yīng)，各處理下的Penn A4 葉片總?cè)~綠素呈持續(xù)下降趨勢（圖2?A）。常溫下處理組間Chl 無顯著性差異（P>0.05）。熱脅迫環(huán)境下Chl下降幅度更大，與圖1 葉片鮮綠程度相一致，外源噴施BD 后Chl 下降幅度顯著小于對照（P<0.05），并與常溫組無顯著差異，14~21 d，Chl 含量分別高出對照14.36%、20.90%。

圖1 高溫脅迫下Penn A4 表觀形態(tài)Fig.1 The effect of BD on the morphology of Penn A4 under high temperature stress

Car 含量始終低于Chl 含量并隨脅迫時間延長呈短暫升高后降低趨勢，脅迫7 d 時Car 含量最高。常溫下處理組間Car 無明顯差異。高溫處理14~21 d，BD組Car 顯著高于對照且與常溫組無差異，并分別高于對照13.89%、20.83%（圖2?B）。

各處理下Chla/b 值均在21 d 時最低。正常溫度下Penn A4 葉片Chla/b 變化幅度較小，處理組間差異不顯著（P>0.05）。熱脅迫下Chla/b 始終低于常溫水平，經(jīng)BD 處理后Chla/b 高于對照（≥14d），21~28 d內(nèi)分別高于對照9.20%、4.50%（圖2?C）。

圖2 高溫脅迫下Penn A4 葉片光合色素含量Fig.2 The effect of BD on the photosynthetic pigment content of Penn A4 leaves under high temperature stress

2.2 BD 對高溫脅迫下Penn A4 細胞膜穩(wěn)定性的影響

Penn A4 葉片REC 呈持續(xù)上升趨勢，28d 時REC最高。常溫下REC 上升幅度較小，兩處理組變化趨勢相一致。高溫下對照組REC 自脅迫初期開始始終高于 常溫組，BD 處理后REC 有效降低，7~14 d 內(nèi)維持在常溫水平，21 d 起較常溫組達到顯著水平（P<0.05），7~28 d 內(nèi)，REC 分別較對照降低了14.85%、8.95%、9.90%、14.53%（圖3?A）。

圖3 高溫脅迫下PennA4 的REC、MDA 及H2O2含量Fig.3 The effect of BD on the content of REC，MDA and H2O2of Penn A4 under high temperature stress

植株MDA 含量隨處理時間的延長持續(xù)上升（圖3?B）。常溫下處理組間MDA 含量未達到顯著水平（P>0.05）。脅迫環(huán)境下，高溫促進了MDA 的積累，BD處理有效抑制了MDA 的增加，且脅迫時間越長抑制效果越顯著，7~28 d，MDA 分別較對照降低了22.78%、9.72%、20.56%、26.43%。

PennA4 H2O2含量21 d 時達到峰值。常溫下處理組間H2O2差異不顯著（P>0.05）（圖3?C）。熱脅迫下H2O2含量顯著積累（P<0.05），外源噴施BD 有效抑制了H2O2含量的升高，7、14、21、28 d 分別較對照降低了6.67%、7.14%、10.96%、10.00%。

2.3 BD 對高溫脅迫下Penn A4 抗氧化酶活性的影響

常溫下SOD 活性先升高后降低，處理組間差異不顯著（P>0.05）。高溫下SOD 活性先升高后降低再升高，BD 處理顯著提高了脅迫14 d 的SOD 活性，7~14 d 分別較對照升高了21.11%、8.39%，14 d 后BD促進效果減弱（圖4?A）。

不同溫度下APX 活性呈不同變化趨勢（圖4?B）。常溫下APX 活性逐漸降低，處理組間變化不顯著。高溫環(huán)境下APX 活性顯著升高，BD 處理進一步增強了脅迫14 d 內(nèi)的APX 活性，7~14 d 分別較對照升高了3.94%、13.81%。

圖4 高溫脅迫下BD 對Penn A4 SOD、APX 活性的影響Fig .4 The effect of BD on the activities of SOD and APX of Penn A4 under high temperature stress

常溫生長的植株P(guān)OD 活性先上升后降低，處理組間差異不顯著（P>0.05）（圖5?A）。高溫下POD活性隨處理時間先升高后降低再升高，脅迫處理28 d 前對照組活性與高溫組差異不顯著（P>0.05），經(jīng)BD 處 理14 d 內(nèi)POD 活 性 有 效 升 高，14 d時POD 活性是對照的1.24 倍。

GR 的活性在時間梯度上呈上升趨勢（圖5?B）。常溫下處理組間GR 活性差異不顯著（P>0.05）。高溫脅迫提高了GR 活性，BD 處理進一步增強其活性（≥14 d），第14 d 時，較對照顯著升高19.86%（P<0.05）。

圖5 高溫脅迫下Penn A4 的POD、GR 活性Fig .5 The effect of BD on the activities of POD and GR of Penn A4 under high temperature stress

2.4 BD 對高溫脅迫下Penn A4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

常溫下Pro 含量基本維持在穩(wěn)定水平，兩處理組變化幅度基本一致。高溫下Pro 先升高后降低，7~14 d 內(nèi)，高溫抑制了Pro 積累，BD 處理后Pro 含量回升并與常溫組無異，較對照分別上升22.69%、30.84%，21 d 時達到峰值（圖6?A）。

4 種處理下，植株SP 含量變化不盡相同（圖6?B）。常溫下SP 含量呈波浪狀變化，處理間變化不顯著（P>0.05）。高溫下SP 隨處理時間逐步積累，BD 處理進一步提高了7~14 d 的SP 含量，較對照分別上升了39.45%、33.77%，14d 之后BD 組SP 含量升高幅度低于對照。

圖6 高溫脅迫下Penn A4 的Pro、SP 含量Fig.6 The effect of BD on the content of Pro and SP of Penn A4 under high temperature stress

3 討論

3.1 BD 對高溫脅迫下Penn A4 表觀形態(tài)和光合色素含量的影響

葉綠素含量可反映植物的光合能力及抗高溫能力，并與葉片表觀形態(tài)變化密切相關(guān)，受高溫影響［15］，在一定程度上高溫會導(dǎo)致葉綠素生成量的減少，使其分解量大于生成量［16］，葉綠素a/b 反映了植物光能的利用效率，比率越高，利用效率越高［3］。類胡蘿卜素作為葉綠素的后備補充，不僅能耗散葉綠素吸收的過多光能，起到光損傷防護功能，還可以清除活性氧［17-18］。本研究中，Penn A4 葉片隨熱脅迫時間延長逐漸萎蔫黃化，Chl、Car 及Chla/b 較常溫水平持續(xù)降低，BD 處理后，其下降幅度顯著降低，葉色持綠性更久。高溫下葉綠素含量降低一方面是高溫影響葉綠素生物合成的中間產(chǎn)物氨基酮戊酸和原卟啉Ⅸ的合成，另一方面高溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧易發(fā)生氧化破壞，使內(nèi)囊體膜上的葉綠素降解酶活性增強［19］。外源亞精胺抑制高溫下黃瓜（Cucumis sativus）幼苗高能態(tài)氧化物質(zhì)的形成，降低了活性氧對葉綠素氧化破壞的風險，保護類囊體結(jié)構(gòu)不受損傷，并抑制了葉綠素降解酶活性升高［20］。由此我們推測BD 保持了類囊體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，保護了Chl 生物合成場所，并抑制了葉綠素降解酶活性升高，從而維持了脅迫環(huán)境下較高的Chl 含量，還促進了Chlb 向Chla 的轉(zhuǎn)化，最終獲得了較高的光能利用率，保證了光系統(tǒng)Ⅱ活動的正常進行，而Car 升高是為了清除熱誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧來進一步維持生物膜的穩(wěn)定性，同樣，葉面施用磷酸二氫鉀和蔗糖通過提高夏季紅葉桃（Rhus chinensis）光系統(tǒng)Ⅱ活性和光能轉(zhuǎn)換效率提高了光合能力，但與本研究不同的是，外源物質(zhì)的施用反而降低了其葉片Chl、Car 含量［21］，這可能跟誘導(dǎo)劑類型有關(guān)。

3.2 BD 對高溫脅迫下Penn A4 細胞膜穩(wěn)定性的影響

質(zhì)膜是活細胞與環(huán)境之間的界面與屏障，高溫可直接有效地改變膜的滲透性和流動性：一方面高溫改變了膜脂組成，使蛋白質(zhì)變性，細胞器內(nèi)膜系統(tǒng)的完整性被破壞，膜上離子載體的種類和功能發(fā)生改變，最終導(dǎo)致膜的選擇性吸收功能喪失、電解質(zhì)滲漏、相對電導(dǎo)率增加［22］；另一方面高溫可誘導(dǎo)單線態(tài)氧、自由基、過氧化氫等活性氧累積，促使膜脂中不飽和脂肪酸脂膜過氧化為丙二醛，它能交聯(lián)各類物質(zhì)發(fā)生鏈式聚合反應(yīng)，使酶蛋白失活對植物體造成傷害［23］。本研究中H2O2隨高溫呈先上升后下降的變化趨勢，MDA 及REL 值則持續(xù)升高，外源噴施BD 則有效抑制其含量的升高，研究表明，高溫下外源硝普鈉、γ-氨基丁酸的施用使茄子（Solanum melongena）及高羊茅（Festuca elata）上述指標表現(xiàn)出與施用BD 類似的變化，主要源于外源物質(zhì)提升了植物自身滲透調(diào)節(jié)能力、酶促及非酶促物質(zhì)的清除功能，從而有效維持了膜系統(tǒng)的相對穩(wěn)定性，緩解了氧化損傷，提高了植株耐熱性［24-25］。因此，筆者認為，BD 對膜系統(tǒng)的保護作用也跟滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及酶促物質(zhì)活性有關(guān)。

3.3 BD 對高溫脅迫下Penn A4 抗氧化酶活性的影響

植物在高溫下受到氧化脅迫時會啟動活性氧清除系統(tǒng)來維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，抗氧化酶（SOD、POD、APX、GR 等）是其抵御活性氧損傷的第一道防線。SOD 是H2O2的生成酶，可以催化O2?-分 解 為H2O2和O2，POD 能催化H2O2與酚類的反應(yīng)，從而減少活性氧的積累［26］，APX、GR 也起到類似的作用［27］。本研究中，熱脅迫下Penn A4 各個酶活性均不同程度累積，并呈先上升后降低趨勢，施加BD 后酶活性進一步增強（≥14 d），其中SOD 活性的谷值對應(yīng)H2O2含量的峰值，APX 活性始終顯著高于常溫組（P<0.05），POD、GR 活性變化幅度則較APX 小，可見SOD 酶逐漸 消 耗 用 于 生 成H2O2，APX、POD 和GR 用 于 清 除H2O2，其中APX 發(fā)揮著主導(dǎo)作用?？寡趸富钚圆粌H與物種相關(guān)，還與脅迫處理時間有關(guān)［28］，有研究報道，高溫對匍匐剪股穎的抑制，前期主要是影響氣孔開度，而后期則主要是影響氧化還原酶活性［29］，樊婕等［30］發(fā)現(xiàn)，逆境脅迫條件下抗氧化酶活性的增加具有一定的時間效應(yīng)。由此我們認為脅迫前期（≥14 d）酶促防御系統(tǒng)并未被激活，外源BD 的干預(yù)提前活化了活性氧清除酶，從而有效緩解了前期植株的氧化損傷，而對照植株由于沒有外界因素的調(diào)節(jié)活性氧隨脅迫時長大量累積，少量的活性氧可作為信號分子調(diào)控細胞生長發(fā)育以及適應(yīng)環(huán)境變化，過量的ROS 則會引起氧化應(yīng)激［31］，因此，脅迫后期其所承受的氧化損傷遠遠大于BD 組植株，而植物自身為了保持良好的生存狀態(tài)，激活了酶促防御系統(tǒng)，從而導(dǎo)致脅迫后期對照組酶活性高于BD 組。但曹語等［32］發(fā)現(xiàn)，短期高溫可誘導(dǎo)抗氧化酶活性的提高，長期高溫下細胞膜受損，酶變性失活，最終導(dǎo)致酶活性降低，噴施γ-氨基丁酸可使處理中后期茶樹（Camellia sinensis）葉片抗氧化酶活性提高，這與本研究結(jié)果相悖，可能跟試驗條件、物種、誘導(dǎo)劑種類等因素有關(guān)。

3.4 BD 對高溫脅迫下Penn A4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

可溶性蛋白質(zhì)具有增強植物耐脫水能力、保護細胞結(jié)構(gòu)、清除活性氧并且延緩衰老的功能［33］，脯氨酸積累能防止植物水分散失，提高原生質(zhì)膠體的穩(wěn)定性，減輕高溫下蒸騰加劇導(dǎo)致的傷害；并能增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，保護膜結(jié)構(gòu)；同時能為脅迫加重環(huán)境下植物的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)［34-35］，其積累速度和數(shù)量同牧草的葉片水勢、萎蔫程度以及氣孔開度等有關(guān)［36］。短期高溫下，芝麻（Sesamum indicum）通過提高自身蒸騰失水啟動降溫機制，誘導(dǎo)了氣孔開放；長期脅迫下，為了減少自身水分大量蒸發(fā)，保持細胞內(nèi)部膨壓，誘導(dǎo)了氣孔關(guān)閉［37］，褪黑素的施用提高了菊花（Chrysan?themum morifolium）氣孔導(dǎo)度并促進了滲透物質(zhì)的合成，降低了有毒物質(zhì)的累積［38］。本研究中，熱脅迫前期對照組Pro、SP 較常溫組無明顯差異，經(jīng)BD 處理后Pro、SP 明顯升高（≤14 d），脅迫后期Pro、SP 均顯著累積，對照組含量高于BD 組，可見短期高溫抑制了Pro 合成，BD 打破了這種抑制，促進了脅迫前期Pro、SP 的累積，以提高因氣孔開放降低的葉片水勢，維持細胞膨壓和膜穩(wěn)定性；脯氨酸具有高度的吸濕性，可抵制氧化和水解產(chǎn)生的有毒物質(zhì)［34］，脅迫后期膜透性增強，MDA 等有毒物質(zhì)大量累積，對照植株受熱應(yīng)激影響Pro、SP 累積以清除MDA 及活性氧，減輕植物熱損傷并為其應(yīng)對長期脅迫提供能量，BD 組植株所遭受的損傷較小，所以Pro、SP 低于對照，這也反映出BD 誘導(dǎo)具有時間效應(yīng)，而水楊酸對高溫下皖貝母（Fritillaria anhuiensis）滲透物質(zhì)累積的促進作用同樣具有時效性［39］。

4 結(jié)論

高溫脅迫下，葉面噴施300 μmol/L 的BD 可減緩光合色素降解速度，抑制葉片電解質(zhì)外滲，降低MDA、H2O2含量，提高脅迫前期（≤14 d）抗氧化酶（SOD、POD、APX、GR）活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（Pro、SP）含量，維持膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和活性氧的代謝平衡，增強Penn A4 幼苗耐熱性。從而緩解了高溫造成的氧化損傷，提高了匍匐剪股穎耐熱性。