袁紅，王羽玥，郭愛(ài)強(qiáng)，劉凌云，范希峰，武菊英

（1. 天津?yàn)I海國(guó)際機(jī)場(chǎng)有限公司，天津 300300；2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京 100097）

野牛草（Buchloe dactyloides），禾本科畫(huà)眉草亞科野牛草屬，多年生暖季型草，多為雌雄異株，原產(chǎn)北美干旱半干旱矮草原［1-2］。20 世 紀(jì)40年 代 作 為 水 土 保持植物引入我國(guó)，表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性。野牛草具有葉片質(zhì)地柔軟、植株低矮、匍匐莖廣泛延伸等特點(diǎn)，更由于其極強(qiáng)的耐旱性，目前廣泛應(yīng)用于草坪地被、園林綠化、固土護(hù)坡等［3］。當(dāng)前對(duì)野牛草的研究主要集中在品種選育［4］、抗逆生理［5-7］及表型鑒定［8］等方面。而目前在遺傳多樣性研究上，存在資源少、方法不完善等問(wèn)題，因此，進(jìn)行分子標(biāo)記方面的研究愈發(fā)必要。

前人利用同工酶譜、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 標(biāo)記（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）、序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence?related amplified polymor?phism，SRAP）和簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增（Inter simple sequence repeat，SRAP）對(duì)野牛草開(kāi)展了遺傳多樣性的研究，探析了部分種質(zhì)資源的遺傳多樣性。李永祥［9］通過(guò)RAPD 分子標(biāo)記和幼葉PPO 同工酶譜兩種方法對(duì)野牛草雄性植株早期性別鑒定。周瑩潔［10］通過(guò)分子標(biāo)記在雌性植株中找到特異性條帶，但篩選標(biāo)記的工作量及材料的不確定性仍造成了野牛草性別鑒定的困難。成凱凱等［3］通過(guò)ISSR 分子標(biāo)記對(duì)美國(guó)及中國(guó)收集的30 份野牛草資源進(jìn)行坪用性狀的觀測(cè)及遺傳多樣性分析，證明ISSR 一定程度上可以揭示野牛草材料的遺傳背景。

ISSR 作為分析遺傳多樣性的一種簡(jiǎn)便快捷的方法，被廣泛應(yīng)用到種質(zhì)資源鑒定、輔助育種選擇、遺傳圖譜建立等領(lǐng)域［11］。ISSR 標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)單、可靠性強(qiáng)、重復(fù)性高、DNA 模板用量少、不需預(yù)先設(shè)計(jì)引物的特點(diǎn)，可用來(lái)揭示樣本間的遺傳多樣性［12-13］。近年來(lái)，已在鴨茅（Dactylis glomerata）［14］、黑麥草（Lolium persicum）［15］及早熟禾（Poa annua）［16］等禾本科草上廣泛應(yīng)用。盡管ISSR 分子標(biāo)記在野牛草中的應(yīng)用已有報(bào)道，但是在實(shí)際操作的過(guò)程中，擴(kuò)增體系及條件受多因素影響，存在一定的局限性，因此需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的客觀條件進(jìn)行優(yōu)化。

天津?yàn)I海國(guó)際機(jī)場(chǎng)東跑道升降帶中分布有野牛草資源，經(jīng)過(guò)多年馴化形成了數(shù)個(gè)零星分布的斑塊狀草坪群落。連續(xù)多年觀測(cè)發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)純雌株群落表現(xiàn)出非常強(qiáng)的適應(yīng)能力，且具備植株低矮、不結(jié)籽、病蟲(chóng)害少、抗逆性強(qiáng)等符合機(jī)場(chǎng)安全運(yùn)行和鳥(niǎo)擊防范要求的多重特征。但該材料遺傳背景不清，且量小，不足以支撐生產(chǎn)和推廣。為進(jìn)一步明確其遺傳信息，篩選相近的種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)繁，提升機(jī)場(chǎng)綠化和鳥(niǎo)防效果，本研究利用ISSR 標(biāo)記探析其遺傳背景。首先優(yōu)化ISSR 體系，主要包括TaqPCR Mix、引物、模板DNA 的配比及PCR 反應(yīng)體系的摸索。然后通過(guò)ISSR 分子標(biāo)記的方法對(duì)收集的39 份野牛草資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，并選擇親緣關(guān)系相近、性狀優(yōu)良的材料用于后續(xù)的生產(chǎn)擴(kuò)繁。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為課題組收集到的39 份野牛草資源，收集地包括天津?yàn)I海國(guó)際機(jī)場(chǎng)、中國(guó)林業(yè)科學(xué)院、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院和北京市農(nóng)林科學(xué)院等保存的野生種及6份商品化材料（表1）。

表1 39 份野牛草材料來(lái)源Table 1 Background information of the 39 buffalograss germplasms

實(shí)驗(yàn)試劑：CTAB 溶液、DNA Marker、PCR Mix（天根）、瓊脂糖凝膠、Goldview 等。ISSR 引物為加拿大的不列顛哥倫比亞大學(xué)公布的序列［17］，本研究選用UBC808、UBC834、UBC836、UBC840、UBC841 和UBC889，由睿博生物工程有限公司（北京）合成（表2）。

表2 ISSR 通用引物名稱及序列信息Table 2 Name and sequence of ISSR primers

1.2 方法

1.2.1 野牛草基因組DNA 的提取 參照CTAB

法［18］改良后進(jìn)行野牛草基因組DNA 的提取。用1%的瓊脂糖檢測(cè)DNA 質(zhì)量，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提DNA 的 濃 度 及OD值。 將DNA 統(tǒng) 一 稀 釋 到20 ng/μL，存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 ISSR體系的建立及優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)體系中主要影響因素為TaqPCR Mix、模板DNA、引物濃度，其次為PCR過(guò)程中的退火溫度、循環(huán)數(shù)及延伸時(shí)間等。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)苔草SSR 分子標(biāo)記體系的探究［19］，本實(shí)驗(yàn)野牛草PCR 反應(yīng)體系根據(jù)3 因素的3 個(gè)水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)（表3，4），剩余用ddH2O 補(bǔ)齊，配制總體積為10 μL 的反應(yīng)體系。隨機(jī)引物選取UBC808。

表3 野牛草ISSR 體系因素水平設(shè)計(jì)Table 3 Experiment design of ISSR system factors of buffalograss

PCR 擴(kuò)增體系為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共34 個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min；4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離，并在凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

表4 野牛草ISSR 體系正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)Table 4 Orthogonal experiment design of ISSR system of buffalograss

1.2.3 PCR 擴(kuò)增體系優(yōu)化 根據(jù)上述操作得到反應(yīng)的最佳體系配比，并以此進(jìn)行退火溫度的梯度摸索。由于不同引物的最佳退火溫度不同，這里以UBC808為例，選取野牛草品種“中坪1 號(hào)”，設(shè)置3 個(gè)梯度分別為48、51、54 ℃，進(jìn)行最佳退火溫度的確定。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 對(duì)獲得的瓊脂糖凝膠結(jié)果進(jìn)行人工讀帶，在同一Marker 大小下，39 份樣品的擴(kuò)增結(jié)果有條帶記為“1”，無(wú)條帶記為“0”，統(tǒng)計(jì)所有引物下的條帶，形成原始數(shù)據(jù)矩陣表。利用NTSYS Version 2.1［20］及POPGENE 32［21］計(jì) 算 遺 傳 參 數(shù)，并 繪 制UPMGA 遺 傳 信 息 聚 類 圖［22］。根 據(jù) 公 式PIC=1-∑jiPij2［23］計(jì)算多態(tài)性信息含量（PIC），其中Pi表示第i個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率，Pj表示第j個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 野牛草ISSR 體系優(yōu)化結(jié)果

野牛草ISSR 分子標(biāo)記以TaqPCR Mix、模板DNA、引物濃度為因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3 個(gè)水平，正交試驗(yàn)共得到9 個(gè)實(shí)驗(yàn)組合。根據(jù)PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠結(jié)果（圖1），9 個(gè)組合均得到多態(tài)性條帶，根據(jù)各成分用量的不同擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)不同程度的差異。其中，1~3 號(hào)條帶模糊，4~9 號(hào)均擴(kuò)增出清晰條帶。以5號(hào)和9 號(hào)的擴(kuò)增效果最佳，考慮成本問(wèn)題及模板的用量等，以5 號(hào)體系為基礎(chǔ)進(jìn)行后續(xù)PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化。

圖1 正交實(shí)驗(yàn)1~9 組合擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of orthogonal test combination

不同退火溫度得到的擴(kuò)增結(jié)果顯示，產(chǎn)物條帶在退火溫度為48 ℃時(shí)最亮，51、53 ℃時(shí)差別不明顯，但較48 ℃的條帶相比較弱（圖2）。

圖2 退火溫度為48、51 和53℃的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results at annealing temperature 48，51 and 53 ℃

最終確定的優(yōu)化體系為10 μL 體系，其中包括5.0 μL Mix、20 ng/μL 的DNA 模 板2 μL 以 及 引 物0.6 μL，并以94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共34 個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min；4 ℃保存的PCR 擴(kuò)增體系擴(kuò)增，可以作為其余39 份樣品的ISSR 分析的基礎(chǔ)。

2.2 遺傳多樣性分析

通過(guò)篩選前期合成的ISSR 通用引物，最終確定6對(duì)引物對(duì)39 份野牛草材料進(jìn)行遺傳多樣性分析。PCR 產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，共擴(kuò)增出39 條條帶（部分?jǐn)U增結(jié)果見(jiàn)圖3），產(chǎn)物條帶的分子量分布在500~2 000 bp。利 用NTSYS-PC V2.1 軟 件，分 析得到野牛草材料間的平均遺傳距離為0.428，遺傳相似系數(shù)為0.572。使用POPGENE 32 計(jì)算分析了觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、基因多樣性指數(shù)（H）以及Shannon 信息指數(shù)（I）（表5）。多態(tài)性信息含量平均為0.303，在0.250~0.500，遺傳多樣性參數(shù)顯示野牛草材料之間的遺傳多樣性處于中等水平，遺傳基礎(chǔ)較寬。

表5 39 份野牛草材料的遺傳多樣性參數(shù)Table 5 Genetic diversity parameters of the39 buffalograss

圖3 引物UBC836 對(duì)39 份野牛草材料的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification results of primer UBC836 among the 39 buffalograss materials

2.3 聚類分析

對(duì)39 份野牛草材料的ISSR 數(shù)據(jù)進(jìn)行UPGMA 聚類分析，共分為兩大類，其中27 號(hào)和28 單獨(dú)聚為一類，其余36 份被聚到一類（圖4）。其中與機(jī)場(chǎng)收集到的1 號(hào)材料親緣關(guān)系較近的為21 號(hào)、9 號(hào)和3 號(hào)，24 和25 號(hào)親緣關(guān)系最近。聚類分析表明39 份野牛草具有明顯遺傳背景的差異，在遺傳距離為0.47 時(shí)，可將其劃分為6 組，其中第1 組包含22 份材料，其中包括10份雌株，5 份雌雄株，占該組的68.2%；第2 組7 份雄株，2 份雌雄株，占該組的75.0%，可以大致上對(duì)雌雄株進(jìn)行粗略的劃分。同時(shí)采集自天津機(jī)場(chǎng)的1-6 號(hào)材料可以聚到一類，但同時(shí)也混合了采集自北京的材料，說(shuō)明地域來(lái)源對(duì)其的影響不大。

圖4 39 份野牛草材料遺傳多樣性分析Fig.4 Genetic diversity analysis of the 39 buffalograss germplasms

3 討論

本研究提供了一種快速高效的野牛草ISSRPCR 反應(yīng)體系，相比于張曉波等［24］對(duì)ISSR 體系探究，本研究用到的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)可以較快的找到最佳組合，并使用含有高純度的TaqDNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液等物質(zhì)的預(yù)混液TaqPCR Mix，在提高實(shí)驗(yàn)效率的同時(shí)，也減少了dNTP、Taq酶及Mg2+的配比對(duì)體系的影響。具有快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

引物的退火溫度也是影響體系的重要因素。在芒草（Miscanthus sinensis）中ISSR 通用引物的退火溫度 為52~54 ℃［25］，苔 草 屬（Carex）植 物 為51~55 ℃［17］，本研究確定的最佳退火溫度為48 ℃，與其他研究相比偏低。周少云等［26］提出不同植物材料的退火溫度存在差異，針對(duì)不同的植物材料還應(yīng)通過(guò)梯度試驗(yàn)進(jìn)行最終確定。

盡管ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)已十分成熟，但具體到某一植物材料仍需進(jìn)行體系的摸索與探究。野牛草是暖季型草坪草中的重要研究材料，應(yīng)用前景廣闊［27］，因此本研究同時(shí)關(guān)注野牛草材料的收集與遺傳多樣性分析，為野牛草育種應(yīng)用、遺傳改良等提供分子基礎(chǔ)。

通過(guò)遺傳多樣性及聚類分析，本研究挑選21 號(hào)種質(zhì)資源進(jìn)行后續(xù)的擴(kuò)繁實(shí)驗(yàn)，根據(jù)劉莉［28］對(duì)20 株野牛草進(jìn)行的表型及ISSR 分析得到，聚類結(jié)果與形態(tài)特征沒(méi)有明確的相關(guān)關(guān)系，所以在肉眼識(shí)別的外觀性狀均優(yōu)良的條件下，可以選擇與目的材料遺傳距離較近的材料擴(kuò)繁。本研究中的平均遺傳距離為0.428，低于SRAP 標(biāo) 記的0.669［1］，說(shuō)明 本 研 究 用到的39 份野牛草材料更具相似性。

地域?qū)ΨN質(zhì)資源的聚類有一定影響，但并未在本研究中體現(xiàn)，這與周瑩潔等［1］來(lái)自3 個(gè)國(guó)家的31 份野牛草材料進(jìn)行UPGMA 聚類發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致。本研究中并未發(fā)現(xiàn)地域?qū)Ψ诸愐?guī)律的影響原因可能有以下兩點(diǎn)：一是收集地少，并且地域距離較近，具有相似的生境；二是收集的材料不具有地域的代表性，可能為引種或者商品化品種。

通過(guò)UPGMA 聚類并未完全對(duì)雌雄株進(jìn)行清晰的劃分，原因之一是本研究的目的是尋找與機(jī)場(chǎng)雌株遺傳背景相似的材料進(jìn)行擴(kuò)繁，并未特意對(duì)可以鑒別雌雄株的ISSR 引物進(jìn)行篩選；二是ISSR 可能不適合對(duì)野牛草進(jìn)行性別鑒定，需要研究開(kāi)發(fā)不同類型的分子標(biāo)記進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

確定野牛草的ISSR 最佳反應(yīng)體系為：5.0 μLMix、40 ng DNA 模板、0.6 μL 引物（1.0 μmol/L）及ddH2O 補(bǔ)齊。最佳擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。將39 份野牛草材料的遺傳多樣性進(jìn)行聚類分析，材料可分為兩大類，其中21 號(hào)材料和天津?yàn)I海國(guó)際機(jī)場(chǎng)候選雌性野牛草材料的親緣關(guān)系最近，可以作為后續(xù)材料擴(kuò)繁和生產(chǎn)的種質(zhì)資源。本研究中ISSR 體系的探索與優(yōu)化、遺傳多樣性分析為野牛草遺傳多樣性分析工作提供了依據(jù)。