王雨藤，趙婷，劉怡璇，張凌馨，?？e

（甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中?美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

隨著全球氣溫上升，世界范圍內(nèi)的干旱區(qū)面積不斷擴大，同時，工農(nóng)業(yè)用水需求增加、可利用水資源污染加劇，使得可用于草坪灌溉的水資源短缺問題日益嚴重［1-2］。因此，干旱脅迫已成為影響草坪草生長、降低草坪質(zhì)量的重要因素，限制著草坪的推廣與應用。干旱脅迫下，草坪草的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理過程均會受到影響。在漫長的進化過程中，植物自身形成了一套復雜的調(diào)控網(wǎng)絡來應答干旱脅迫，該過程涉及多個基因、信號傳導與代謝通路［1-3］。隨著現(xiàn)代分子生物學和生物信息學技術(shù)的發(fā)展，草坪草響應干旱脅迫的機理研究已從最初的植物形態(tài)結(jié)構(gòu)、細胞生理代謝適應逐漸發(fā)展到轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平及大分子物質(zhì)網(wǎng)絡互作調(diào)控等分子機制［4］。轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)，吲哚-3-甘油磷酸合成酶、蛋白磷酸酶、已糖激酶、鈣結(jié)合蛋白、葉綠素a/b 結(jié)合蛋白等基因可作為草地早熟禾（Poa pratensis）響應逆境脅迫的候選基因［5］；脂氧化物、脯氨酸生物合成、以及鈣信號等與生命進程相關(guān)的基因在匍匐翦股穎（Agrostis stolonifera）響應干旱脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用［6］。近年來，已通過轉(zhuǎn)錄組學鑒定了草坪草響應干旱脅迫的候選基因，但有關(guān)這些基因在干旱應答中的功能及抗旱草坪草新品種培育中的應用有待進一步的研究。

光敏色素互作因子（phytochrome?interacting fac?tors，PIFs）屬于bHLH（basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子家族，能直接與光敏色素相互作用［7-8］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中 共 發(fā) 現(xiàn) 了8 個PIFs 成 員（PIF1-PIF8）。所有PIFs 蛋白的N-端還具有一個保守的APB 結(jié)構(gòu)域（Active phyB-binding domain），它能與光敏色素B（Phytochrome B，PhyB）特異性互作。另外，在PIF1與PIF3中還發(fā)現(xiàn)了一個類似APB的 結(jié)構(gòu)域-APA 結(jié)構(gòu)域（Active phyA-binding do?main），它能夠與光敏色素A（Phytochrome A，PhyA）特異性互作［8-9］。經(jīng)同源比對分析，在單子葉植物水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea mays）基因組均鑒定出了6 個PIFs［10-11］?，F(xiàn)已證明PIFs 可參與ABA、GA、BRs、茉莉酸（Jasmonic acid，JA）、生長素（Auxin）、乙烯（Ethylene）等多種植物激素的生物合成和信號途徑，從而協(xié)同調(diào)控植物的生長發(fā)育［12-13］。PIFs 在植物抗逆性的調(diào)控中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在低溫條件下，擬南芥PIF3的突變體表現(xiàn)出明顯的抗凍性，而PIF3過表達植株表現(xiàn)出明顯的低溫敏感表型［14］。低溫能夠促使EBF1 和EBF2 蛋白降解，從而使PIF3蛋白更加穩(wěn)定。同時，PIF3能夠直接結(jié)合在CBFs 的啟動子區(qū)，抑制CBFs 及其下游低溫響應基因表達［14］。

PIFs 作為不同激素信號途徑的集結(jié)者，在植物生長發(fā)育和抗逆性調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。但在非模式作物，尤其是在草坪草上報道較少。草地早熟禾是世界上廣泛應用的草坪草，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PIF1和PIF3基因可能是5?ALA 介導草地早熟禾干旱應答的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。因此，本研究以草地早熟禾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，通過生物信息學手段鑒定了4 個草地早熟禾PpPIFs基因，并對他們在干旱脅迫下不同組織部位的表達進行了分析，旨在挖掘草地早熟禾優(yōu)異的基因資源，為草坪草生物育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 草地早熟禾幼苗培養(yǎng)及干旱脅迫處理

采用砂培法種植草地早熟禾品種巴潤，種子由北京克勞沃公司提供。前期將洗干凈的沙子滅菌后置于育苗缽中，種子撒于表面，在生長室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：白天/黑夜時間為14 h/10 h，溫度為25 ℃/15 ℃，濕度為55%，光照強度為6 000 lx。播種后20 d，用霍格蘭德營養(yǎng)液培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)4 周。選擇長勢相似的幼苗進行處理，分為對照組和處理組，其中對照組繼續(xù)澆霍格蘭德營養(yǎng)液培養(yǎng)，處理組在霍格蘭德營養(yǎng)液中溶入20% PEG6000 溶液后澆灌培養(yǎng)植株，模擬干旱脅迫。于脅迫后0、2、8、24、48、96 h 取樣，取其葉片迅速放入液氮中冷凍，保存于-80 ℃。不同組織樣品的采集選用生長了3 個月的草地早熟禾植株，此時已有根莖芽、分蘗芽的產(chǎn)生，取植株的葉片、根系、根莖芽、分蘗枝和分蘗節(jié)，迅速放入液氮中冷凍，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 PpPIFs轉(zhuǎn)錄因子家族基因鑒定及序列分析

以6 個水稻OsPILs 和8 個擬南芥AtPIFs 蛋白序列作為鑒定草地早熟禾PpPIFs基因的請求序列，本課題組的所有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為本地數(shù)據(jù)庫，利用bioedit軟件中的tblastn 功能在本地數(shù)據(jù)庫中進行檢索，經(jīng)過NCBI 網(wǎng)站搜索比對，得到候選序列。在線網(wǎng)站Ex?PASy 預 測PpPIFs的 等 電 點 及 分 子 質(zhì) 量，PSORT 預測PpPIFs的亞細胞定位，通過MEME 網(wǎng)站（http：//meme-suite. org/tools/meme）對PpPIFs的保守結(jié)構(gòu)域進行分析。利用MEGA 7.0 軟件，構(gòu)建擬南芥、水稻和草地早熟禾的系統(tǒng)進化樹。

1.3 熒光定量PCR（qRT - PCR）

RNA 提取使用天根公司植物RNA 提取試劑盒，RNA 反轉(zhuǎn)錄使用Takara 公司的Prime Script RT re?agent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試 劑盒，第1 步去除基因組DNA 反應，第2 步為反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋20 倍作為模板。使用NCBI 在線網(wǎng)站Prime?BLAST（https：//www. ncbi.nlm. nih. gov/tools/primer?blast/）進行引物設(shè)計（表1）。利用擎科生物的熒光定量試劑盒2×TSINGKE Master qPCR Mix（SYBR Green I）進 行qRT?PCR 分析，20 μL 反應體系如下：模板5 μL，引物2 μL（10 μM上游引物和下游引物各1 μL），ddH2O 3 μL，2×Super?Real PreMix Plus 10 μL。熒光定量PCR 的條件為：95 ℃預變性1 min，40 個循環(huán)的PCR 擴增，包括95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s。內(nèi)參基因選擇本實驗篩選出的干旱脅迫下草地早熟禾葉片內(nèi)表達穩(wěn)定的PpACT［15］，每個樣品設(shè)3 次生物學重復，基因的相對表達量使用2－ΔΔCT法計算。

表1 定量PCR 引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行T檢驗，使用GraphPad 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫PpPIFs的鑒定

整合本課題組所有早熟禾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫及其他研究者共享的數(shù)據(jù)庫，以6 個水稻OsPILs 和8 個擬南芥AtPIFs 蛋白序列作為鑒定PpPIFs的請求序列，共從草地早熟禾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定出4 個含完整ORF 序列的PpPIFs，NCBI 數(shù)據(jù)庫中比對后將其分別鑒 定 為PpPIF1、PpPIF3、PpPIF4和PpPIF5（表2）。等電點在4.91~5.01，分子質(zhì)量在80 563.63~138 668.61，亞細胞定位都在細胞核中。

表2 草地早熟禾PpPIFs的基本信息Table 2 Information ofPpPIFsfamily genes inPoa pratensis

2.2 PpPIFs序列分析

為評價草地早熟禾、水稻、玉米及擬南芥中PIFs/PILs 蛋白的系統(tǒng)進化關(guān)系，采用鄰接法構(gòu)建PpPIFs、OsPILs、ZmPIFs 和AtPIFs 蛋白序列系統(tǒng)進化樹（圖1）。草地早熟禾PpPIFs 家族成員可分為3 個亞家族（Clade I、II、III），其中PpPIF3 屬于Clade I；PpPIF1 屬于Clade II；PpPIF4 和PpPIF5 屬 于Clade III。此 外，植物PIFs 家族蛋白表現(xiàn)出極大的多樣性，PpPIFs 與單子葉植物水稻OsPILs 和玉米ZmPIFs 具有較高的同源性，而雙子葉植物擬南芥AtPIF2、AtPIF3 和At?PIF6 獨 立于PpPIFs、ZmPIFs 和OsPILs，單獨分 布 于Clade IV。

圖1 草地早熟禾、水稻、玉米和擬南芥PIFs 蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of PIF proteins inPoa pratensis，Oryza sativa，Zea mays，Arabidopsis thaliana

用MEME 在線軟件分析MaPIF 家族成員保守基序，設(shè)置返回motif 參數(shù)為5，結(jié)果見圖2。所有PpPIFs成員中均含有高度保守的motif 1、motif 2、motif3 和motif5。對比發(fā)現(xiàn)，motif1 是bHLH 保守結(jié)構(gòu)域，說明這4 個PpPIFs是bHLH 類轉(zhuǎn)錄因子家族中的PIF轉(zhuǎn)錄因子。此外，PpPIF1 和PpPIF3 中含有代表APA 結(jié)構(gòu)域的motif 4，PpPIF4 和PpPIF5 都有著相同的motif數(shù)量和類型。

圖2 PpPIFs家族蛋白保守基序（motif）分布圖Fig.2 Protein motif distribution map ofPpPIFsfamily

2.3 干旱脅迫下PpPIFs的表達分析

采用qRT-PCR 技術(shù)對20% PEG6000 模擬干旱處理下草地早熟禾葉片中PpPIFs基因進行表達分析。結(jié)果表明，PpPIFs對干旱脅迫的響應均比較快，處理2 h 或8 h 其表達水平均發(fā)生顯著的上調(diào)表達。其中，PpPIF1的表達水平受到干旱脅迫的影響最大，干旱處理8 h 時，其表達水平上調(diào)了約12 倍。PpPIF4和Pp?PIF5分別只在8 h 和2 h 被顯著地誘導表達，而Pp?PIF1和PpPIF3在干旱脅迫處理96 h 后仍被顯著地上調(diào)表達（圖3）。

圖3 草地早熟禾葉片PpPIFs基因響應干旱脅迫的表達模式分析Fig.3 Expression patterns ofPpPIFgene in the leaves ofPoa pratensisresponding to drought stress

2.4 在不同組織中PpPIFs的表達分析

草地早熟禾不同部位PpPIFs基因相對表達量差 別 較 大，新 分 蘗 枝PpPIF1、PpPIF3和PpPIF4的相對表達均顯著高于葉片，其中PpPIF1和PpPIF3表 達 量 分 別 提 高 了17 和8 倍，PpPIF4和PpPIF5在根莖和分蘗節(jié)中的相對表達量顯著低于葉片。4個基因在根系中的相對表達量均顯著低于葉片。與葉片相比，葉鞘PpPIF3和PpPIF5的相對表達量顯著提高，而PpPIF1的相對表達量顯著降低（圖4）。

圖4 草地早熟禾PpPIFs 基因在不同組織中的表達模式分析Fig.4 Expression patterns ofPpPIFgenes in the different tissues ofPoa pratensis

3 討論

PIFs 屬于b HLH 轉(zhuǎn)錄因子家族的一個亞家族，也稱作PILs（phytochrome in?teracting factor?like），能夠與具有生物活性型的光敏色素相互作用。研究表明，大部分PIFs 蛋白質(zhì)在N 端具有保守的APB 結(jié)構(gòu)域，APB 結(jié)構(gòu)域是PIFs 與具有生物活性光敏色素相結(jié)合的不可或缺的元件。同時，PIF1 和PIF3 還包含一個單獨的結(jié)構(gòu)域APA［8-9］。PIFs 轉(zhuǎn)錄因子家族基因廣泛存在植物體內(nèi)，近年來的研究鑒定出了很多農(nóng)作物及園藝植物中的PIFs 成員，如模式植物擬南芥中有8 個PIFs 成員［8］；禾本科植物水稻和玉米中均有6個PIFs 成員［10，16］；茄科植物番茄（Lycopersicon esculen?tum）中 有8 個PIFs 成 員［17］，馬 鈴 薯（Solanum tu?berosum）中 有7 個PIFs 成 員［18］；芭 蕉 科 植 物 香 蕉（Musa nana）中有7 個PIFs 成員［19］；葫蘆蘚科植物小立碗蘚（Physcomitrella patens）中有4 個PIFs 成員［20］。本研究在草坪植物草地早熟禾中共鑒定出了4 個PIFs成員，其成員數(shù)少于禾本植物水稻和玉米，原因可能是由于草地早熟禾全基因數(shù)據(jù)尚未獲得，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中部分PIFs 成員信息缺失。

草地早熟禾4 個PpPIFs 蛋白序列均具有保守結(jié)構(gòu)域HLH 和APB，說明PpPIFs 家族成員在進化過程中在功能上具有高度保守性，而PpPIF1 和PpPIF3 還具有結(jié)構(gòu)域APA，表明這兩個成員在進化功能上更為豐富。這與在其他植物上的研究一致［8，18-19］。從進化樹的結(jié)果來看，PpPIFs 被大致分為3 個亞家族，其中PpPIF1 和PpPIF1 與 水 稻OsPIL13 和OsPIL14 在 同一族；PpPIF1 與水稻OsPIL11 和擬南芥AtPIF4 在同一族；PpPIF3 與玉米ZmPIF1、ZmPIF3 和擬南芥At?PIF1 在同一族?，F(xiàn)已證實AtPIF1、AtPIF4、ZmPIF1和ZmPIF3參與調(diào)控植物的生長發(fā)育和抗逆性［8，21-22］，其中AtPIF4能夠與多種激素信號轉(zhuǎn)導途徑相互作用調(diào)控細 胞 的伸長生 長［8，13］。因 此，PpPIF1和PpPIF3可能參與調(diào)控草地早熟禾生長發(fā)育及抗逆性。

現(xiàn)已證明PIFs 可參與脫落酸（Abscisic acid，ABA）、赤霉素（Gibberellic acid，GA）、油菜素內(nèi)脂（Brassinosteroids，BRs）和生長素等多種植物激素的生物合成和信號途徑，從而協(xié)同調(diào)控植物的生長發(fā)育［23-24］。擬南芥中DELLAs 蛋白GAI 和RGA 能夠與PIF3 和PIF4 蛋白互作，從而抑制PIF3 和PIF4 介導的細胞伸長生長［25］。BRs 是植物暗形態(tài)建成的促進激素，在黑暗條件下促進下胚軸伸長生長，負調(diào)控光形態(tài)發(fā)生，PIF4 與BRs 信號途徑基因BES1/BZR1特異性結(jié)合形成異源二聚體，以此激活下游靶基因的表達，促進細胞的伸長［26］。在植物不同組織中的表達說明，PIFs 作為感知光信號的基因，在植物葉片中的表達量較高［18，27］。本研究發(fā)現(xiàn)，根系中PpPIFs的表達均顯著低于葉片，但值得注意的是，其中PpPIF1、Pp?PIF3和PpPIF4在新分蘗枝中的表達顯著高于葉片，其中PpPIF1和PpPIF3表達量分別提高了17 和8 倍，說明PpPIF1和PpPIF3可能參與了草地早熟禾分蘗芽的伸長生長過程。目前未有研究直接證明PIFs 可調(diào)控禾本科植物分蘗過程，但是，PIFs 可與BRs 信號途徑基因BZR1相互作用，而BZR1已被證實可調(diào)控水稻分蘗過程［28］。因此，筆者推測PpPIF1和PpPIF3可能會與BZR1相互作用進而調(diào)控草地早熟禾的分蘗過程，但其功能需要進一步的研究來證實。

PIFs 在植物抗逆性的調(diào)控中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。低溫能夠促使EBF1和EBF2蛋白降解，從而使PIF3蛋白更加穩(wěn)定。同時，PIF3能夠直接結(jié)合在CBFs 的啟動子區(qū)，抑制CBFs 及其下游低溫響應基因 表 達［29］。 此 外，擬 南 芥 中 轉(zhuǎn) 錄 激 活 子HMR（HEMERA）可直接與PIF4相互作用，激活熱響應生長相關(guān)基因YUC8、IAA19和IAA29，促進溫度依賴型PIF4積累［30］。除對溫度脅迫有響應外，PIFs 還參與植物對干旱、鹽害等脅迫的應答過程。在干旱和高鹽處理下，異源表達玉米ZmPIF3的轉(zhuǎn)基因水稻植株生長狀況較野生型更好，具有較高的光合效率和細胞膜穩(wěn)定性［21］，異源表達ZmPIF1可通過調(diào)控氣孔關(guān)閉來提高抗旱性，增加轉(zhuǎn)基因水稻的產(chǎn)量［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，草地早熟禾PpPIFs均有不同程度的響應，但PpPIF1和PpPIF3在干旱脅迫處理96 h 后仍被顯著地上調(diào)表達，說明PpPIF1和PpPIF3也可能參與了草地早熟禾干旱脅迫應答調(diào)控。

4 結(jié)論

在草地早熟禾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中共鑒定出4 個Pp?PIFs基因，分屬于3 個不同的亞家族，但均具有保守結(jié)構(gòu)域HLH 和APB，其中PpPIF1和PpPIF3還具有結(jié)構(gòu)域APA。此外，PpPIF1和PpPIF3在分蘗枝中表達量較高，且在干旱脅迫后的葉片中被顯著上調(diào)表達，因此，PpPIF1和PpPIF3可能參與草地早熟禾分蘗芽的伸長生長和干旱脅迫應答調(diào)控。