周立國,劉灶長,孔德艷,徐 凱,夏 輝,吳金紅,羅利軍

(上海市農業(yè)生物基因中心,上海 201106)

當前,我國農業(yè)用水占總淡水用量的70.4%,而水稻用水占農業(yè)用水的70%[1],而另一方面,我國淡水資源相對缺乏、分布不均,人均淡水占有量不到世界平均水平的1∕4,提高淡水資源的利用效率是必然選擇[2]。上海市農業(yè)生物基因中心充分發(fā)掘利用陸稻資源,將其抗逆性導入水稻中,成功育成了以‘旱優(yōu)73’‘WDR48’‘旱兩優(yōu)8200’等為代表的兼具水稻高產優(yōu)質特性和旱稻節(jié)水抗旱特性的栽培稻品種新類型——節(jié)水抗旱稻(Water-saving and drought-resistance rice,WDR)。與傳統(tǒng)水稻品種相比,WDR品種可節(jié)約50%以上淡水資源,在有效提高水稻水分利用效率的同時也保持了水稻高產優(yōu)質特性,具有重要的社會意義和經濟意義[3]。但是,目前關于水稻等農作物的節(jié)水抗旱機制缺乏系統(tǒng)性的研究,已有研究多集中在單個基因抗旱性能方面,無法在實際育種和大田生產中應用。

生物節(jié)律性包括近年生物鐘、季節(jié)生物鐘、近月生物鐘和晝夜生物鐘等,受長時期的環(huán)境影響而形成,又一定程度上獨立于環(huán)境短時變化,依據內在基因震蕩得到維持[4]。各生物中均有形成、維持、輸出節(jié)律性功能的機制和基因,生物各生長發(fā)育過程都受到生物鐘的影響[5-7]。依靠內在生物鐘,植物對干旱缺水、光照等環(huán)境條件的響應具有一定前置性,故可快速響應干旱等非生物逆境脅迫[8-11]。

鹵酸脫鹵素酶(Haloacid Dehalogenase,HAD)參與生物節(jié)律性調控過程。鹵酸脫鹵素酶最初是在細菌中被發(fā)現并得名的,其廣泛存在于動物、植物等真核生物及藍細菌、鉤端螺旋體等原核生物中[12]。含HAD結構域的蛋白質的整體序列相似性很小,這些蛋白質包含4個保守的序列基序[13-14],其中的帽子結構是由3個短的催化基序組成的核心催化結構域。根據帽子結構域的位置、結構以及折疊方式等的差異,可以將其劃分為多個亞家族。大多數HAD蛋白參與磷酸基轉移,包括磷酸酶、P型ATP酶、磷酸酯酶和磷酸轉移酶[15],但是因HAD結構域蛋白氨基酸序列的多樣性,各蛋白功能也復雜多樣。在水稻中已鑒定出40種典型的HAD蛋白,還有更多的HAD類似結構蛋白未被鑒定出來[16]。HAD蛋白質的水解底物不同,植物中的HAD酶可分為蛋白磷酸酶、小分子磷酸酶、脫鹵酶、磷酸酯酶和β-磷酸葡萄糖變位酶等,參與多種新陳代謝過程[17-18]。HAD家族蛋白還有可能與生物的晝夜節(jié)律響應有關,果蠅中的DREG-2蛋白擁有HAD類似的結構,具有磷酸酶活性,屬于天冬氨酸-親核水解酶亞家族即HAD1A家族,參與果蠅晝夜節(jié)律的生理調控[19-20]。

‘IRAT109’是優(yōu)異陸稻資源,綜合抗旱性強,包含眾多的抗旱基因資源,同時也是諸多節(jié)水抗旱稻的骨干親本。本研究通過干旱脅迫處理水稻‘IRAT109’篩選到干旱相關基因OsDR1,通過監(jiān)測其表達特征分析其與水稻干旱脅迫的關系,旨在為水稻抗旱育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用旱稻品種‘IRAT109’(Oryza sativaL.ssp.japonica)進行轉錄譜分析和基因克隆,‘湘晴’(Oryza sativaL.ssp.japonica)為遺傳轉化的受體材料。大腸桿菌菌株為E.coliDH5α,農桿菌菌株為EHA105,所用載體見表1。

表1 載體信息Table 1 Vectors information

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻非生物逆境脅迫及激素處理

挑選健康飽滿的‘IRAT109’種子,在正常水分管理條件下用1∕2濃度水稻培養(yǎng)液(參考國際水稻研究所營養(yǎng)液配方)培養(yǎng)至4葉期。

低溫脅迫:把幼苗放入4℃光照培養(yǎng)箱,分別在處理0 h、0.5 h、1 h、3 h、20 h時取幼苗葉片。鹽脅迫是分別將幼苗由水培液移入250 mmol∕L、500 mmol∕L NaCl水溶液中;甘露醇滲透脅迫是分別將幼苗由水培液移入100 mmol∕L、200 mmol∕L、500 mmol∕L甘露醇水溶液中;激素處理是分別將水稻苗根部浸入到含50μmol∕L、150μmol∕L脫落酸(ABA),100μmol∕L、200μmol∕L過氧化氫(H2O2),50μmol∕L、150μmol∕L甲基茉莉酸(Me-JA),0.5 mmol∕L、1.5 mmol∕L水楊酸(salicylic acid,SA)等培養(yǎng)液中;室溫培養(yǎng),并在處理0 h、1 h、2 h后取葉片樣品。

1.2.2 苗期水稻在不同的光照及水分條件處理

水稻‘IRAT109’種子播入裝滿泥土的小桶中,正常水分條件下培養(yǎng)到4葉期,設置下列3種處理:自然光照下進行干旱處理(土壤含水量低于15%),自然斷水直至植株開始出現卷葉;在正常水分條件下避光培養(yǎng),取樣檢測前避光一個晝夜(24 h);對照處理,即自然光照下正常水分管理。取樣時使用照度計測量光照強度,每個處理分別取3個生物重復樣品。

1.2.3 Total RNA提取

RNA提取試劑為Trozol A+total RNA reagent(Invitrogen),試驗方法參照試劑說明書。

1.2.4 實時定量PCR

實時定量PCR(qPCR)所用試劑為SYBR?Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time),所用儀器為Applied Biosystems 7000 Real-Time PCR System。利用引物qDR1f和qDR1r,擴增OsDR1基因,片段長度為133 bp。以水稻Actin2基因為內參。引物信息詳見表2。在基因擴增效率基本一致的情況下,利用相對定量的方法計算目標基因的相對表達量變化[21-22]。

1.3 RACE方法克隆目的基因

使用BD SMART RACE cDNA Amplification Kit,運用cDNA末端快速擴增法(5’-and 3’-rapid amplification of cDNA ends,RACE)獲得OsDR1基因全長cDNA序列。以干旱處理后的苗期‘IRAT109’總RNA為模板,利用含有oligo dT(16)和特異接頭序列的反轉錄引物逆轉錄獲得cDNA。在反轉錄過程中加入5’RACE接頭,MMLV反轉錄酶識別完整mRNA的帽子結構并將5’RACE接頭轉移到cDNA的5’末端,從而獲得5’末端含有帽子結構和特異序列、3’末端含有oligo dT的完整cDNA。以上述cDNA為PCR模版,分別以3GSP1、3GSP2為基因特異引物,和3’RACE通用引物配對,進行兩輪PCR擴增,將所得片斷測序,獲得包含DR1基因mRNA PolyA尾巴的3’端序列。分別以5GSP1、5GSP2為基因特異引物,和5’RACE通用引物配對,進行兩輪擴增,通過克隆、測序,獲得包含帽子結構的5’端序列。將所得的3’及5’端序列拼接,得到完整的OsDR1基因全長序列。引物信息詳見表2。

表2 所用引物及序列Table 2 The primers and sequences

1.4 載體構建及遺傳轉化

利用末端含有內切酶識別序列的引物對D1f-BamHI∕D1r-SacI擴增OsDR1基因全長編碼序列。用BamHI及SacI內切酶切除PCR片段和pBI121載體;用T4連接酶將OsDR1全長片斷與之連接,替換GUS片斷。用HindIII和EcoR I從pBI121-DR1載體內切下,并且瓊脂糖凝膠電泳分離CaMV35S:DR1片段,連接到pCAMBIA1300多克隆位點相應位置,構成pCAMB1300:35S:DR1植物轉化載體。將載體轉入大腸桿菌DH5α,提取質粒,冰凍法轉入農桿菌EHA105,采用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化水稻‘湘晴’的愈傷組織。

1.5 轉基因水稻田間抗旱表型鑒定

轉基因水稻按照大田播種要求催芽播種,苗床上長至4葉期后移植到轉基因抗旱大棚內種植。株行距為15 cm×15 cm,每株系種植4行,每行6穴,每穴1株,重復3次。正常水分管理下生長至6葉期開始斷水,約15 d后即在8葉期形成干旱脅迫,記錄水稻植株表型。

2 結果與分析

2.1 OsDR1基因cDNA全長序列及蛋白結構分析

根據干旱脅迫下基因表達芯片結果[23],對比水、旱環(huán)境下陸稻‘IRAT109’苗期葉片中差異表達基因,篩選到水稻抗旱相關基因(DT-relative gene)OsDR1,其在干旱條件下表達量顯著提高,比正常水分下增加了近3倍。但該基因的翻譯起始密碼和終止密碼序列未知,故通過RACE的方法得到了含有翻譯起始密碼子的5’端序列以及含有翻譯終止密碼子和poly A尾巴的3’端序列,拼接后獲得了這一干旱相關基因全長的cDNA序列,其長度為902 bp,包含有完整的基因編碼區(qū)(圖1A)。將序列提交到NCBI數據庫(Genbank:DQ103591),通過BLAST(https:∕∕blast.ncbi.nlm.nih.gov∕Blast.cgi)比對,發(fā)現OsDR1基因對應的基因號為LOC_Os07g46520.1;其對應的染色體DNA序列長度為2 892 bp,包含6個外顯子和5個內含子。

圖1 OsDR1基因全長cDNA序列和編碼氨基酸序列及HAD功能域示意圖Fig.1 The cDNA and amino acids sequence with HAD domain of OsDR1 gene

根據OsDR1基因cDNA序列推導出其編碼氨基酸序列(圖1B)。OsDR1氨基酸序列包含一個HAD結構域,其中3個短催化核心保守區(qū)域構成帽子結構(圖1C)。HAD結構域具有一定序列保守性,廣泛存在于細菌、動物、植物等原核及真核生物中。通過BLAST比對發(fā)現OsDR1蛋白具有鹵酸脫鹵素酶類似功能域[19-20],歸屬于鹵酸脫鹵素水解酶超級蛋白家族,具有磷?；D移酶活性。在Gramene數據庫(http:∕∕www.gramene.org)中比對,其注釋顯示,OsDR1蛋白具有磷酸甘油磷酸酯酶活性,催化磷酸甘油磷酸基團的水解,促進甘油的積累,是乙醛酸和草酰乙酸代謝途徑的關鍵酶類。

根據RACE測序及拼接結果,設計帶有內切酶識別位點的基因特異擴增引物D1f-BamHI和D1r-SacI(表2),以‘IRAT109’cDNA為模板進行PCR擴增,擴增片段大小為892 bp(圖2),包含完整的氨基酸編碼區(qū)。經過測序和序列比對,擴增片段序列與RACE測序及拼接結果相同。

圖2 PCR擴增克隆到的OsDR1片段Fig.2 Cloning of OsDR1

2.2 OsDR1基因受非生物逆境誘導表達

在4℃低溫條件下苗期水稻OsDR1基因被誘導上升表達,3 h時表達量最大,隨著處理時間的延長,OsDR1基因表達量開始下降(圖3A)。在不同濃度甘露醇模擬干旱處理下,OsDR1基因上升表達,并且隨著處理時間的增加,表達量也在增加;表達變化趨勢與甘露醇的濃度無明顯相關性;但是過高濃度、過長時間的甘露醇脅迫處理會降低OsDR1基因的上調表達(圖3B)。圖3C顯示,OsDR1基因對鹽脅迫也有反應,較長時間鹽脅迫會誘導基因上升表達。綜上,OsDR1基因表達受模擬干旱脅迫的誘導而呈現明顯的上調表達趨勢。

圖3 逆境下苗期水稻地上部OsDR1相對表達量變化Fig.3 Relative expression of OsDR1 under water-stress at 4-leaves stage of rice

以qPCR方法檢測OsDR1基因在經ABA、H2O2、JA、SA等激素處理的‘IRAT109’苗期植株中的表達情況。結果顯示,低濃度的ABA對OsDR1基因表達的影響不明顯,而高濃度ABA會在短時間內(1 h)上調OsDR1基因表達量(圖4A);較長時間高濃度的H2O2處理會顯著提高OsDR1基因表達(圖4B);JA在能較短時間內誘導OsDR1基因上調表達,隨后(2 h)回落到處理前水平(圖4C);長時間高濃度的SA處理誘導OsDR1基因明顯上調表達(圖4D)。由此可知,OsDR1基因的表達受到ABA、H2O2、JA、SA激素的誘導而上調表達,其中,對長時間高濃度H2O2處理響應最顯著。

圖4 水稻苗期施加植物激素后OsDR1相對表達量變化Fig.4 Relative expression of OsDR1 with plant hormones treatment at 4-leaf stage of rice

2.3 OsDR1基因呈節(jié)律性表達并受干旱脅迫誘導

根據實際測量結果,上海8月份4:00左右自然光照強度開始增加;6:00左右太陽升起,光照強度迅速增加。qPCR結果顯示,在對照條件下(正常水分、自然光照)、干旱脅迫處理、遮光處理等3種不同環(huán)境條件下,水稻中OsDR1基因的表達豐度在一天中的整體變化趨勢相同,即在4:00之后自然光照強度開始增加時迅速上升,6:00日出時到達最高點,之后隨著光照強度增加而明顯下降。由圖5可知,首先,干旱處理下OsDR1基因表達量顯著上調表達。正常光照條件下,干旱處理與正常水分下OsDR1基因mRNA表達最高值無顯著差異。正常水分條件下水稻中OsDR1基因在6:00達到最高點,之后迅速下降,12:00到達最低水平;干旱脅迫誘導下,OsDR1基因表達長時間處于較高水平,直到12:00過后才開始迅速下降。即干旱延長了OsDR1基因高豐度表達的時間,使其總表達量顯著增加。其次,在黑暗的條件下,水稻OsDR1基因的表達仍然呈現明顯的與自然光照下相同的變化趨勢,具有光誘導的節(jié)律表達特征。綜上,OsDR1基因表達響應外界光照條件的變化而呈現節(jié)律性,并且受水稻本身的內在節(jié)律性機制調控。

圖5 不同條件下OsDR1基因在水稻中的表達Fig.5 OsDR1 mRNA expression abundance under different conditions

2.4 轉基因植株獲得與陽性植株鑒定

轉基因植株DNA經HindIII酶充分酶切,通過PCR擴增(Hptf、Hptr引物詳見表2)獲得抗潮霉素基因DNA片段,將其作為southern雜交的探針,檢測T-DNA整合到T0代水稻基因組中的情況。從圖6可知,轉基因植株中均含T-DNA片段,其中3個株系只有1個拷貝,其他陽性植株含有2—3個拷貝;同時還檢測到3個陰性轉基因植株,可用作后續(xù)試驗的陰性對照。

圖6 OsDR1轉基因T0植株的Southern blot分析Fig.6 Southern blot analysis of OsDR1 transgenic T0 plants

2.5 OsDR1基因增強水稻抗旱性

由圖7可知,干旱脅迫條件下轉基因陽性植株(KR215、KR117)生長狀況良好,葉片挺拔、葉色嫩綠,植株生長量大;相比較下,轉基因陰性植株在干旱脅迫下出現了葉片卷曲、干枯,葉色發(fā)白,植株生長受抑制等情況。表明水稻中超表達OsDR1基因改善了植株在水分缺乏情況下的生存狀況,提高了對干旱脅迫的耐受性。

圖7 超表達OsDR1基因水稻的抗旱表現Fig.7 Drought resistance performance of OsDR1 over-expression rice plant

3 討論

3.1 OsDR1基因參與干旱等非生物逆境脅迫響應過程

在水稻苗期進行脫落酸(ABA)、茉莉酸、水楊酸和過氧化氫,以及甘露醇、鹽、低溫等非生物逆境脅迫,均能提高OsDR1基因在葉片中的表達。其中ABA介導的信號傳遞途徑是植物非生物脅迫信號傳遞的核心途徑,可以調控產生H2O2,控制氣孔開閉,調控植物對干旱脅迫的響應[24-26]。OsDR1基因對ABA和H2O2處理都有響應,自然斷水干旱及模擬干旱脅迫下水稻OsDR1基因表達量均顯著上調,據此推斷,OsDR1基因通過ABA和H2O2信號途徑,參與水稻的干旱脅迫響應機制。

3.2 OsDR1蛋白分子功能分析預測

根據蛋白序列特征分析,OsDR1與DREG-2蛋白均屬于鹵酸脫鹵素酶家族的HAD1A亞家族;實時定量分析結果顯示,OsDR1基因的表達特征與果蠅DREG-2基因類似,均具有節(jié)律性。由此推測,OsDR1基因參與生物的晝夜節(jié)律調控[19-20]。

3.3 OsDR1基因增強水稻抗旱性的作用途徑

水稻等植物抗旱性研究多是在實驗室可控條件下,采用PEG等模擬干旱條件,或者小桶土培干旱脅迫等方式,在幼苗期、開花期等植物某一生長階段進行抗性鑒定。其優(yōu)點是簡單、方便,試驗結果穩(wěn)定,但結果不能代表植物尤其是作物在田間的抗旱表現。本研究于抗旱大棚中通過自然斷水產生干旱脅迫進行抗性鑒定,試驗結果更能反應植株真實抗旱表現。本研究表明OsDR1基因具有大田環(huán)境條件下增強水稻抗旱性的潛在應用價值。

光照強度會影響植物的生長和發(fā)育,過強的光照破壞植株光合作用和呼吸作用,產生過氧化效應,使植株質膜穩(wěn)定性及能量代謝等生化過程受到破壞[17-18]。OsDR1基因表達的節(jié)律變化揭示OsDR1基因表達與晝夜交替相關,在光照強度增加初期表達豐度劇烈增強,為隨后的強光脅迫儲備蛋白。據此推測,OsDR1基因能在一定程度上減輕強光照帶來的負面效應。通過數據庫搜索發(fā)現,OsDR1蛋白是一個磷酸甘油磷酸酯酶,有研究表明利用假單胞桿菌來源的磷酸甘油磷酸酯酶轉化水稻,可提高水稻甘油含量,增強其對鹽等非生物脅迫的耐受性[27]。該蛋白還可能參與植物的乙醛酸循環(huán),為三羧酸循環(huán)提供物質基礎,也預示其具有穩(wěn)定水稻能量代謝的作用。綜上,OsDR1蛋白通過提高水稻中甘油含量以及穩(wěn)定能量代謝來增強水稻耐旱性。