戴啟東，周朝輝，艾佳音，張琪靜

（遼寧省果樹科學研究所，營口 115009）

甜櫻桃是北方地區(qū)成熟較早的落葉果樹，果實口感豐富，商品價值較高，具有很好的市場前景。隨著集約化種植，近年來甜櫻桃病害發(fā)生呈上升趨勢，尤其是葉部病害的發(fā)生，可抑制光合作用，造成落葉、落果，影響干物質的積累，嚴重制約產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。國內外學者對甜櫻桃病害進行了一些相關的研究，主要有由黃單孢桿菌（Xanthomonas pruni）引起的葉片穿孔和枝干潰瘍病[1]，由疣雙胞銹菌（Tranzscheliasp.）引起的櫻桃銹病，由土壤農桿菌（Agrobacteriumsp.）引起的根瘤病，由病梨孢（Apiosporinasp.）引起的枝干黑結病，由串珠菌（Moniliniasp.）導致的花芽、小枝及果實腐爛[2]，由外囊菌屬（Taphrinasp.）引起的枝瘋病，由蜜環(huán)菌屬（Armillariasp.）和單孢霉屬（Phymatotrichumsp.）引起的根腐病[3]等。楊麗萍等[4]、趙遠征等[5]通過ITS-rDNA 技術分別對甘肅、遼寧櫻桃黑斑病病原進行了研究，認為交鏈格孢（Alternaria alternata）和細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）是引起該病害的主要致病菌。劉保友等[6]對大櫻桃褐斑病菌進行了研究，認為引起褐斑病的病原菌為核果釘孢菌（Passalora circumscissa）。于曉麗等[7]對煙臺地區(qū)櫻桃莖腐病病原菌以及致病性進行了研究，認為煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）是該病的致病菌。關于甜櫻桃葉枯病，國內報道相對較少，主要認為由細菌引起，也可由生理脅迫所導致[8]，且病斑后期常伴隨有穿孔、脫落。由于甜櫻桃葉部病害種類較多，癥狀相近且不易區(qū)分，明確甜櫻桃葉部病害的致病菌組成，對合理地制定防治策略極為重要。筆者在遼寧省甜櫻桃產(chǎn)區(qū)采集到1 種近年來發(fā)生較普遍的葉枯類病害樣本，通過室內病菌組織分離培養(yǎng)、形態(tài)學觀察并結合分子鑒定技術，將引起遼寧省甜櫻桃葉枯病的致病菌鑒定為層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2021 年，在遼南地區(qū)采集到甜櫻桃葉枯病的病害樣品，主要集中在大連市金州、普蘭店地區(qū)及營口市熊岳地區(qū)，甜櫻桃發(fā)病較嚴重的品種主要有美早、砂蜜豆和佳紅等。

1.2 試驗方法

1.2.1 病菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)學鑒定

首先將不同地區(qū)采集的甜櫻桃葉枯病病樣于室溫條件下保濕24 h，然后在葉片發(fā)病部位病健交接處切取4 mm×4 mm 大小的病組織，于0.1%升汞溶液中浸泡30 s，取出后移入70%酒精溶液中浸泡30 s，用蒸餾水沖洗干凈后，移入PDA 培養(yǎng)基平板，25 ℃恒溫培養(yǎng)，每皿培養(yǎng)3 塊發(fā)病組織，7 d 后，待長出新鮮菌絲，挑取邊緣菌絲再次分離純化，黑光燈照射，以及光、暗交替（各12 h）刺激菌落產(chǎn)孢后，光學顯微鏡下于無菌水浮載液觀察菌絲、孢子形態(tài)進行分類鑒定[9]。

1.2.2 葉片致病性測定

將獲得的純培養(yǎng)菌株進行葉片室內回接試驗，采用菌塊涂抹法接種[10]，并以無菌水噴施作為對照；回接的寄主品種分別為砂蜜豆、佳紅、美早，每個品種接種5 片葉片，每片葉片接種3 個菌塊，分別統(tǒng)計接種發(fā)病情況。

1.2.3 純培養(yǎng)菌株的分子鑒定

將具有致病性的菌株平板，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行擴增測序，擴增選用真菌ITS-rDNA 通用引物：ITS1（5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTATTGATATG C-3′）；PCR 產(chǎn)物純化與測序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司測序部完成。測序結果經(jīng)Chromas 3.0 軟件拼接后，在NCBI-GenBank 進行同源性比對，以確定菌株的同源性，不同菌株親緣關系發(fā)育樹采用軟件MEGA 7.0 以鄰接法構建。

2 結果與分析

2.1 甜櫻桃葉枯病菌的分離及致病性測定

從甜櫻桃葉枯病病樣中共分離得到7 株病菌，其中真菌菌株有3 株，編號分別為LNCY5、LNCY6、LNCY7，細菌菌株有4 株，編號分別為BNCY1、BNCY2、BNCY3 和BNCY4。通過對3 個甜櫻桃品種的致病性回接試驗發(fā)現(xiàn)，只有LNCY7 具有致病性，并且與甜櫻桃葉枯病田間發(fā)生癥狀相似，其他6 株菌株均無致病性。致病菌株LNCY7 接種美早、砂蜜豆和佳紅的發(fā)病率分別為73.3%、46.6%、86.6%。室內接菌5 d 后，在砂蜜豆葉片上產(chǎn)生壞死褐斑，但擴展較慢；在佳紅上產(chǎn)生水浸狀黑褐色病斑；在美早上病斑擴展較快，有白色菌絲絨毛產(chǎn)生（圖版1-A、B、C）。通過不同甜櫻桃品種的致病性測定，認為菌株LNCY7 為甜櫻桃葉枯病致病菌。

2.2 甜櫻桃葉枯病發(fā)病癥狀及病菌種類的形態(tài)學鑒定

病害發(fā)生初期，葉片正面出現(xiàn)褐色小圓點，大小為1～2 mm；后期病斑圓形至不規(guī)則形，直徑2～5 mm，且病斑中心有黃褐色暈圈，逐漸擴展至整個葉片，發(fā)病后期病斑褪綠，中心有穿孔狀，導致葉片干枯死亡（圖版1-D）。

該病菌在PDA 培養(yǎng)基上生長較快，氣生菌絲初期白色，棉絮狀，菌落濃密，不產(chǎn)生分生孢子座；菌落表面初期白色，后期淡駝絨色，分生孢子梗不分枝，產(chǎn)孢方式為單瓶梗型，分生孢子排列成鏈狀或假頭狀，分生孢子鐮刀形，頂胞漸尖，基孢明顯，兩端略彎曲，分生孢子大多3～5 隔，大小為22.5～55.5 μm×2.5～4.5 μm，通過對其菌落、孢子及產(chǎn)孢表型等形態(tài)鑒定（圖1），認為該菌為鐮刀菌屬（Fusariumsp.）真菌[9]。

2.3 菌株ITS-rDNA 分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

對致病菌株LNCY7 進行DNA 提取，以提取的總DNA 為模板，利用ITS-rDNA 通用引物進行PCR擴增，PCR 產(chǎn)物片段測序后，利用Chromas 3.0 軟件拼接，得到大小為566 bp 的特異性片段，通過GenBank-BLAST 分析比對，該菌株與登錄號為MH707085.1 的層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）的同源性達到99%。為了進一步明確該菌株的分類地位，選取了與該菌株親緣關系較相近的鐮刀菌菌株，進行了系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，結果表明菌株LNCY7 與層出鐮刀菌聚在同一個分支，而與禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、擬輪生鐮刀菌（Fusarium verticillioides）等鐮刀菌屬的近緣種分別聚在不同的分支（圖2），結合形態(tài)學鑒定和分子鑒定結果，認為該致病菌株LNCY7 為層出鐮刀菌，屬于子囊菌亞門肉座菌目叢赤殼科鐮刀菌屬真菌[9]。

圖2 基于ITS-rDNA 序列LNCY7 相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結論

本研究分離得到的甜櫻桃葉枯病的致病菌為層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum），是一類重要的植物病原菌，該病菌寄主范圍廣泛，在小麥、大豆、香蕉和柑橘上均有報道，不僅可以侵染植物，同時也可侵染動物和人[11-15]。鐮刀菌常引起作物苗期根腐病、葉片枯萎病等，但近年來發(fā)現(xiàn)該病菌也可侵染果實，對采后貯藏產(chǎn)生影響[16]。鐮刀菌屬真菌（Fusariumsp.）種類繁多，很多近緣種均有致病性，擬輪生鐮刀菌（F.verticillioides）可引起朱蕉葉斑病，層出鐮刀菌（F.proliferatum）侵染香蕉果實可引起果斑病[11,16]。通過形態(tài)學特征很難快速、準確鑒定這些近緣種，國內外學者不斷探索一些具有保守序列的特異基因來區(qū)分這些近緣種類，針對鈣調蛋白基因設計的特異性引物檢測蘆筍莖枯?。‵.proliferatum），鈣調蛋白基因特異性引物可區(qū)分處于潛伏侵染階段的層出鐮刀菌（F.proliferatum）和尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）[17-18]。通過保守的ITS-rDNA 區(qū)間設計引物鑒定引起圓蔥黑腐病的2種病原菌F.proliferatum和F.verticillioides[19-20]；在該病菌病理生理學方面也取得一定進展：研究人員發(fā)現(xiàn)弱酸性條件下香蕉果實更易感染果斑?。‵.proliferatum），原因是病菌周圍背景環(huán)境pH 值發(fā)生改變，從而調節(jié)了細胞壁降解酶和抗氧化酶的數(shù)量來影響病菌的侵染活性[16]；同時層出鐮刀菌（F.proliferatum）代謝毒性物質伏馬菌素等的致病機理也不斷被揭示[21-22]。

本研究認為引起甜櫻桃葉枯病的病原菌為層出鐮刀菌（F.proliferatum），與已報道的櫻桃葉片黑斑病病原鏈格孢屬（Alternariasp.）真菌不同[4-5]，這2 種病害從發(fā)病癥狀上也有明顯的區(qū)別。通過對不同品種的致病性測定發(fā)現(xiàn)，不同品種病斑擴展情況有所不同，該病菌是否存在不同品種抗性差異，有待進一步明確。