吳昊，許奎

安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230000

反流性食管炎(reflux esophagitis，RE)是胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)的一種[1]，發(fā)病率逐年增高[2]，目前主要以質(zhì)子泵抑制劑聯(lián)合促動(dòng)力藥物治療[3]，但復(fù)發(fā)率較高。RE臨床表現(xiàn)與《傷寒論》梔子豉湯證相似，但梔子豉湯治療RE的機(jī)制尚不明確[4-7]。筆者以梔子豉湯為研究對(duì)象，以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ)，闡明梔子豉湯治療RE的可能作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選以“梔子”“淡豆豉”為檢索關(guān)鍵詞，在中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)(the traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)中進(jìn)行中藥有效成分初篩，并以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為條件，進(jìn)行二次篩選，將最終獲取的作用靶點(diǎn)蛋白信息在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//uniprot.org/)中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化命名。

1.2 反流性食管炎靶點(diǎn)預(yù)測(cè)通過靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)(therapeutic target database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/)[15]、人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards?：the human gene database，https：//www.genecards.org/)[16]、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man，OMIM，http//www.omim.org)、PharmGkb、DrugBank等5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，使用“reflux esophagitis”作為檢索詞獲取反流性食管炎的相關(guān)靶標(biāo)，并去重后獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)。

1.3 藥物-疾病交集靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析使用Draw Venny Diagram在線程序?qū)⑺幬锱cRE疾病靶點(diǎn)取交集，并將交集基因?qū)隒ytoscape 3.8.0軟件中，構(gòu)建藥物與疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行可視化分析。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將獲取的藥物-疾病靶點(diǎn)的交集基因?qū)氲絊tring(https：//string-db.org/，v11.0)在線網(wǎng)站，構(gòu)建全部PPI，并再次利用Cytoscape 3.8.0篩選出核心蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建核心蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)富集分析與京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析為了探討梔子豉湯對(duì)于反流性食管炎的主要作用通路，以及相關(guān)基因在通路中的作用，利用R語言軟件以P<0.05作為篩選條件對(duì)核心蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行GO生物富集分析以及KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

通過TCMSP檢索藥物有效成分，以“OB≥30%和DL≥0.18”作為篩選條件，刪除重復(fù)項(xiàng)后，共獲得18個(gè)化學(xué)成分、405個(gè)藥物作用靶點(diǎn)。在GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank五個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索相關(guān)靶標(biāo)并去重取交集后，獲得疾病靶點(diǎn)數(shù) 2 076 個(gè)，見圖1。使用Draw Venny Diagram獲取藥物與反流性食管炎疾病靶點(diǎn)交集108個(gè)，見圖2。利用Cytoscape軟件構(gòu)建疾病-藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，圖中左側(cè)代表藥物的成分(紫色代表屬于梔子，紅色代表屬于淡豆豉)；右側(cè)藍(lán)色代表疾病靶點(diǎn)，靶點(diǎn)越大表明藥物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)越多，見圖3。利用 STRING(https：//string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建全部蛋白互作關(guān)系，首先對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)圖設(shè)置置信區(qū)間為95%以上，并將全部蛋白互作關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape軟件，再使用CytoNCA篩選出其中的核心蛋白，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。

圖1 疾病靶點(diǎn)Venn圖

圖2 藥物-疾病靶點(diǎn)交集Venn圖

圖4 藥物與反流性食管炎核心蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(黃色代表藥物，藍(lán)色代表疾病)

通過數(shù)據(jù)庫(kù) Bioconductor(http：//bioconductor.org/)對(duì)藥物治療反流性食管炎作用的靶標(biāo)進(jìn)行基因 symbol的ID轉(zhuǎn)換，運(yùn)用R語言的ClusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2等程序包進(jìn)行GO生物富集分析和KEGG通路富集分析，并繪制GO生物功能的氣泡圖和KEGG信號(hào)通路富集的柱狀圖(圖5、圖6)，GO生物富集分析涉及生物學(xué)過程BP共1 962個(gè)，細(xì)胞組分CC共48個(gè)，分子功能MF共154個(gè)。其中氣泡圖中氣泡的大小與富集基因數(shù)目呈正相關(guān)，主要涉及動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥等多個(gè)生物過程。以P<0.05作為篩選條件，共獲得KEGG通路富集得出155條信號(hào)通路，取前30條繪制柱狀圖。其中P值越小、顏色越紅，代表與藥物組合治療反流性食管炎關(guān)系越密切，主要涉及糖尿病并發(fā)癥、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化等多條信號(hào)通路。其中與糖尿病并發(fā)癥信號(hào)通路關(guān)系最為密切，其具體信號(hào)通路見圖7，紅色代表通路中相關(guān)的靶點(diǎn)。其中長(zhǎng)度的長(zhǎng)短與富集基因的多少呈正相關(guān)，顏色深淺與P值的大小亦呈正相關(guān)。

圖5 富集分析的生物過程氣泡圖

圖6 KEGG通路富集條狀圖

圖7 AGE-RAGE通路富集圖

3 討論

歷代醫(yī)家多認(rèn)為反流性食管炎與肝氣犯胃，胃氣上逆有關(guān)，多采用疏肝理氣，降逆和胃法治療。RE具有反酸、燒心、胸骨后疼痛等臨床表現(xiàn)，與《傷寒論》梔子豉湯證相似。梔子豉湯由梔子、淡豆豉兩味藥組成。梔子苦寒，可清瀉三焦郁火，性降有宣；淡豆豉體輕氣寒，可開宣中焦痞結(jié)。梔子與淡豆豉相伍，可清泄胃中郁火，治療胃脘嘈雜，或胃脘疼痛不舒。然而目前梔子豉湯對(duì)反流性食管炎的作用機(jī)制尚不明確，筆者以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為基礎(chǔ)，從藥物成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路方面初步探索可能的作用機(jī)制。

依據(jù)本網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)統(tǒng)計(jì)，反流性食管炎的發(fā)生、發(fā)展與多個(gè)通路密切相關(guān)，而與AGE-RAGE通路關(guān)系最為密切，此通路中的激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)、核因子NF-κB(nuclear factor-κ appa B，κB)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，BCL-2)、B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白等是中藥有效成分的研究熱點(diǎn)。AP-1是由Jun蛋白家族成員組成的二聚體，與炎癥密切相關(guān)，Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，抑制AP-1的轉(zhuǎn)錄活性，可抑制炎癥的發(fā)生；NF-κB與炎癥、細(xì)胞凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]；BCL-2蛋白家族與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[10]，而BCL-2蛋白主要是抗凋亡蛋白，可以抑制促凋亡蛋白活性，阻止細(xì)胞凋亡[11]；BAX蛋白可誘導(dǎo)細(xì)胞色素c的釋放，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]，且細(xì)胞的存活率與BCL-2/BAX的比值呈正相關(guān)[13]；白細(xì)胞介素類與細(xì)胞凋亡、炎性因子釋放、疼痛程度等密切相關(guān)。即梔子豉湯的藥物成分可能是通過阻斷AGE-RAGE通路中的p38信號(hào)，抑制轉(zhuǎn)錄因子 AP-1的激活，上調(diào)Bcl-2蛋白基因的表達(dá)，抑制Bax蛋白表達(dá)，從而拮抗細(xì)胞凋亡[13]，實(shí)現(xiàn)治療反流性食管炎的作用。

有研究表明，反流性食管炎的發(fā)生與血糖高水平密切相關(guān)，高血糖癥可導(dǎo)致血管內(nèi)皮慢性炎癥，損害食管深層感覺神經(jīng)，使食管的敏感度降低，導(dǎo)致反流性食管炎發(fā)生[14-15]。2型糖尿病患者更容易出現(xiàn)食管反流癥狀，可能與2型糖尿病的消化系統(tǒng)并發(fā)癥胃輕癱有關(guān)[16]。除此之外，2型糖尿病還是胃食管反流病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[17]。淡豆豉中的有效成分豆豉多糖(glycitein)可通過AGE-RAGE通路影響胰島素受體糖代謝，從而修復(fù)糖尿病患者的腎臟及胰腺，達(dá)到降低血糖的作用[18]，進(jìn)而通過抑制炎性基因PTGS1的表達(dá)來抑制反流性食管炎的發(fā)生。淡豆豉的另一成分大豆異黃酮(Isoflavon)可上調(diào)Bcl-2蛋白基因的表達(dá)，抑制Bax蛋白表達(dá)[19]，最終抑制執(zhí)行細(xì)胞凋亡的CASP3基因。除此之外，大豆異黃酮可調(diào)控腸道菌群[20-21]，而反流性食管炎的發(fā)生與胃腸道菌群紊亂密切相關(guān)[22]。因此，維持腸道菌群的穩(wěn)定對(duì)于反流性食管炎的治療至關(guān)重要。梔子的有效成分之一西紅花酸(crocetin)可使Bcl-2/Bax比值升高，抑制CASP8的活化，進(jìn)而抑制CASP3的表達(dá)，使細(xì)胞趨于存活[23]。除此之外，西紅花酸還有阻斷NF-κB信號(hào)通路、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、釋放炎性因子的作用[24]；梔子另外的成分槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、豆甾醇(stigmasterol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)可分別通過抑制p38及NF-κB信號(hào)通路的激活來抑制白細(xì)胞介素類炎性因子的釋放[25-29]；槲皮素以及山柰酚還可以調(diào)節(jié)機(jī)體血糖水平，進(jìn)而抑制炎性因子的釋放[30]。槲皮素還可以通過抑制NF-κB和MAPK信號(hào)通路的激活，抑制炎性因子的分泌，進(jìn)而改善機(jī)體的神經(jīng)性疼痛[31-32]。梔子的另外成分甘露醇可促進(jìn)TNF-α等炎性介質(zhì)隨尿液排出，降低機(jī)體內(nèi)炎癥因子的水平[33]。

綜上所述，梔子豉湯中的各藥物可能主要是通過調(diào)控機(jī)體血糖水平，抑制p38、NF-κB信號(hào)通路的激活，抑制炎癥因子的分泌，實(shí)現(xiàn)治療反流性食管炎的作用。