奧氮平等第二代抗精神病藥主要通過拮抗中樞多巴胺D2受體（DRD2）和5-羥色胺2受體(5-HT R2)打破機(jī)體原有蛋白的協(xié)同作用，產(chǎn)生藥理效應(yīng)和副作用，尤其與5-HT R2A/R2C親和力特別強(qiáng)，是美國FDA批準(zhǔn)的唯一懷孕婦女可使用的藥物，安全性較好。而奧氮平治療6周，77%患者體質(zhì)量較基線增加＞7%，首次治療的青少年患者6月增加Ⅱ型糖尿病、心腦血管并發(fā)癥和早逝的風(fēng)險(xiǎn)。近年來，奧氮平等第二代抗精神病藥作用于外周組織介導(dǎo)體質(zhì)量增加等代謝障礙受到國內(nèi)外同行專家高度關(guān)注，此類藥物不僅作用于外周的脂肪細(xì)胞或肝細(xì)胞影響脂質(zhì)代謝，還可能作用于中樞5-HT R2C促進(jìn)攝食。然而在動(dòng)態(tài)、整體水平上研究奧氮平對(duì)中樞5-羥色胺(5-HT)能突觸等相關(guān)通路的影響尚未見報(bào)道。

中樞5-HT系統(tǒng)神經(jīng)通路起源于中縫核，其中縫背核5-HT神經(jīng)元纖維投射到下丘腦弓狀核，5-HT通過5-HT R2C激活阿片-促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原（POMC）神經(jīng)元或通過5-HT R1B抑制刺鼠相關(guān)蛋白(AgRP)神經(jīng)元，抑制食欲。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，奧氮平長(zhǎng)期作用能顯著提升大鼠中縫背核5-HT水平，且5-HT能突觸通路反常被抑制而引起體質(zhì)量增加等代謝障礙，奧氮平早期(1～29 d)上調(diào)腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)表達(dá)、長(zhǎng)期（30 d 后）作用下調(diào)AMPK 表達(dá)，可能源于奧氮平長(zhǎng)期作用打亂了原有蛋白之間的協(xié)同作用而重新建立了新的蛋白之間協(xié)同作用。因此，我們需進(jìn)一步研究奧氮平早期對(duì)中樞5-HT能突觸通路的影響。本研究利用絕對(duì)和相對(duì)定量同位素標(biāo)記(iTRAQ)技術(shù)聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)，分析奧氮平持續(xù)處理4周大鼠中縫背核差異表達(dá)蛋白，并進(jìn)行詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，并驗(yàn)證與5-HT能突觸通路相關(guān)差異表達(dá)蛋白的基因mRNA及其蛋白表達(dá)水平，旨在探尋奧氮平介導(dǎo)體重增加前期的中樞5-HT神經(jīng)系統(tǒng)潛在靶蛋白及其相關(guān)通路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡健康雌、雄性SD大鼠各32只（江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心），體質(zhì)量170～210 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(贛)2018-0003，合格證編號(hào)：0004137。普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水和活動(dòng)，室溫22～24 ℃，濕度40%～60%，7:00 am～19:00 pm光照。本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查批準(zhǔn)（九五醫(yī)科倫審2021第2號(hào)），所有實(shí)驗(yàn)都在白天進(jìn)行，按中華人民共和國《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定實(shí)施。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑與儀器 奧氮平(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)；BCA 定量試劑盒(上海生物工程)；SDT 裂解液、TMT 標(biāo)記試劑盒(Thermo Fisher)；一抗及二抗抗體（Cell Signaling）；Q-Exactive plus 質(zhì)譜儀(Thermo Fisher)；Easy nLC 1200 色譜系統(tǒng)(Thermo Scientific)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 2月齡健康SD大鼠64只，雌雄各32只，按照體質(zhì)量的蛇形分組法分配到奧氮平組［灌胃奧氮平1.2 mg/(kg·d)；=32，雌雄各半］、對(duì)照組(灌胃等量0.9%氯化鈉溶液；=32，雌雄各半)。2 組8:00 am～8:30 am 給藥10 mL/kg，1次/d。連續(xù)實(shí)驗(yàn)4周。其中每組取20只大鼠(雌雄各半)用于蛋白組學(xué)分析，另外24只大鼠按6只/組大鼠(雌雄各半)用于后續(xù)mRNA定量和Western blot分析。

5.融合性。著眼國內(nèi)外最新信息化企業(yè)研究成果和最佳實(shí)踐，融合先進(jìn)的國際標(biāo)準(zhǔn)；關(guān)注 IT戰(zhàn)略和企業(yè)戰(zhàn)略的結(jié)合，關(guān)注IT運(yùn)營(yíng)與企業(yè)運(yùn)營(yíng)的一致性；反映電力企業(yè)“十二五”信息化規(guī)劃的思想，體現(xiàn)“十二五”規(guī)劃建設(shè)目標(biāo)和智能電網(wǎng)的需求。

差異蛋白參與了組織細(xì)胞的多種細(xì)胞過程發(fā)生改變，主要包括細(xì)胞進(jìn)程、生化調(diào)控及代謝進(jìn)程等（圖2）。差異蛋白分屬于細(xì)胞解剖實(shí)體、細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)域部分、含蛋白質(zhì)復(fù)合物、突觸等其他有機(jī)體部分（圖3）。差異蛋白主要參與了結(jié)合、酶的催化功能、細(xì)胞功能調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等重要生物學(xué)功能（圖4）。GO富集分析（Layer3）生物過程：分解代謝過程、主要代謝過程、有機(jī)物代謝過程等；GO富集分析（Layer4）生物過程：分解代謝活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞分解代謝過程、與共生體的相互作用等（圖5）。

1.2.3 取材 第28天給藥后1 h 斷頭殺鼠，迅速剝開顱骨取大腦，冰浴上分離中縫背核組織，放入1.5 mL EP管中，迅速放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用單因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，移栽期設(shè)3個(gè)處理：處理1(T1)，4月20日移栽；處理2(T2)，4月25日移栽；處理3(T3)，4月30日移栽。3次重復(fù)，共9個(gè)小區(qū)。每小區(qū)種植100株，移栽株行距為50 cm×110 cm。

1.2.4 蛋白組學(xué)分析的樣品處理 每組分別按雌性、雄性大鼠隨機(jī)取4個(gè)中縫背核組織混合成1個(gè)樣本，得到奧氮平組4個(gè)混合樣本、對(duì)照組4個(gè)混合樣本。取備用樣本，通過一維SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)（4%～12%Nu-PAGE Bis-Tris凝膠，Invitrogen）并染色與考馬斯亮藍(lán)G-250（Fluka）搭配。完整的凝膠被切成23個(gè)相等大小的切片。方法學(xué)參照BMC Medicine（2020）所述的方法消化。在50 ℃下用10 mmol/L DTT還原50 min，隨后用55 mmol/L碘乙酰胺烷基化在26 ℃的環(huán)境下處理20 min。向提取的蛋白樣品中加入反應(yīng)液，進(jìn)行蛋白變性、二硫鍵還原，以及巰基烷基化的過程。采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。按照酶與蛋白1∶50的質(zhì)量比加入胰蛋白酶，37 ℃孵育振蕩過夜進(jìn)行酶切。12 000×離心15 min，取上清進(jìn)行脫鹽。除鹽后的肽段溶液經(jīng)離心濃縮儀抽干后，-20 ℃凍存待用。標(biāo)記操作過程按照TMT生產(chǎn)廠家的說明進(jìn)行。標(biāo)記后的樣品等量混合后，使用Sep-Pak C18 進(jìn)行除鹽。真空抽干后，利用high pH反向色譜分離法對(duì)混合樣品進(jìn)行分級(jí)分離，最終合并為15個(gè)組分。真空抽干后，存于-80 ℃冰箱，準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過MaxQuant(V1.6.6)軟件進(jìn)行檢索，采用的數(shù)據(jù)庫檢索算法為Andromeda。使用UniProt中大鼠的蛋白質(zhì)組參考數(shù)據(jù)庫檢索。主要檢索參數(shù)如下：項(xiàng)目類型選TMT；可變修飾選Oxidation (M),Acetyl(Protein N-term),Deamidation (N/Q)；固定修飾選Carbamidomethyl (C)；酶切選Trypsin/P。檢索結(jié)果以蛋白和肽段水平1%FDR為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，刪去反庫蛋白、污染蛋白、只有一個(gè)修飾肽段的蛋白條目，余下的鑒定信息用作后續(xù)分析。在進(jìn)行功能注釋和富集分析時(shí)，基于序列相同或相似蛋白質(zhì)的功能也相似的原理，通過eggNOG-mapper軟件的Diamond程序，得到提交蛋白序列對(duì)應(yīng)的GO term的生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)方面分別第2、3、4層的注釋信息、KEGG通路，和COG類別進(jìn)行注釋。得到質(zhì)譜鑒定到的所有蛋白的注釋信息后，提取其中差異表達(dá)蛋白的相關(guān)信息，統(tǒng)計(jì)類別和數(shù)目，通過超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行功能富集分析，即可篩選出與該實(shí)驗(yàn)相關(guān)的顯著功能類別。

1.2.6 qRT-PCR 檢測(cè)mRNA水平 大鼠6只/組，取中縫背核立即用Trizol 試劑提取總RNA，使用RT First Strand cDNA Synthesis Kit（Servicebio）合 成cDNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25 ℃孵化5 min，42 ℃孵化30 min，85 ℃孵化5 s，該反應(yīng)在PCR儀中進(jìn)行。引物由武漢賽維爾生物科技有限公司提供，引物序列（表1）。使用SYBRGreen Master Mix 進(jìn)行qPCR 測(cè)定，PCR 循環(huán)曲線：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，40個(gè)循環(huán)；60 ℃，30 s；65 ℃→95 ℃，每升溫0.5 ℃采集一次熒光信號(hào)。qPCR 采用Bio-rad熒光定量PCR儀進(jìn)行，并獲得每個(gè)樣本目的基因及內(nèi)參基因GAPDHCT數(shù)據(jù)。每個(gè)待測(cè)樣本的目的基因表達(dá)倍數(shù)按ΔΔCT公式計(jì)算：A=CT(目的基因，待測(cè)樣本)-CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測(cè)樣本)，B=CT(目的基因，對(duì)照樣本)-CT(內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本)，ΔΔCT=A-B，目的基因表達(dá)倍數(shù)=2。

1.3 蛋白組學(xué)的數(shù)據(jù)分析

1.2.5 蛋白組學(xué)分析的質(zhì)譜檢測(cè) 質(zhì)譜分析使用Q Exactive Plus液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(Thermo)進(jìn)行。肽段樣品通過自動(dòng)進(jìn)樣器吸入后結(jié)合至C18捕獲柱，接著被洗脫至分析柱（75 μm×150 mm，3 μm粒徑，100 ?孔徑，C18色譜柱，Thermo）進(jìn)行分離。利用兩個(gè)流動(dòng)相（流動(dòng)相A：0.1%甲酸和流動(dòng)相B：80%ACN，0.1%甲酸）建立60 min的分析梯度。液相的流速設(shè)置為300 nL/min。質(zhì)譜DDA模式分析時(shí)，每個(gè)掃描循環(huán)中包含一個(gè)MS全掃描（R=120 K，AGC=3e6，max IT=50 ms，scan range=350～1800 m/z），以及隨后的15 個(gè)MS/MS 掃描（R=35 K，AGC=1e5，max IT=100 ms）。HCD 碰撞能量設(shè)置為30。四級(jí)桿的篩選窗口設(shè)置為1.2 Da。

我趕緊上前問情況，值班經(jīng)理看到我眼睛一亮：“呦，這不是李記者嗎？原來這位喬先生是您家屬啊，來來來，咱們里面說。”

1.4 Western blot分析

制備兩組樣本蛋白裂解液加熱變性后進(jìn)行SDSPAGE電泳凝膠分離，然后轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上（0.22 μm，Millipore），進(jìn)一步用5%牛血清白蛋白溶液中封閉1 h，按1:1000稀釋比例4 ℃孵育過夜。洗滌后加熒光二抗繼續(xù)孵育1 h，洗干凈后加ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒（Yeasen）放置于化學(xué)發(fā)光儀的檢測(cè)箱內(nèi)進(jìn)行曝光。免疫印跡圖像的分析統(tǒng)計(jì)通過ImageJ（NIH,Bethesda）軟件進(jìn)行。

農(nóng)業(yè)品牌化是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的重要標(biāo)志，依靠品牌帶動(dòng)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)，既符合當(dāng)今農(nóng)業(yè)發(fā)展的一般規(guī)律，也順應(yīng)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的客觀趨勢(shì)。實(shí)施品牌帶動(dòng)戰(zhàn)略，促進(jìn)品牌農(nóng)業(yè)發(fā)展，對(duì)于加快農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化、市場(chǎng)化進(jìn)程，促進(jìn)農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收、農(nóng)村經(jīng)濟(jì)增加，推進(jìn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和新農(nóng)村建設(shè)等方面都具有重要的意義?，F(xiàn)以南陽市臥龍區(qū)為例，對(duì)加快農(nóng)業(yè)品牌發(fā)展提出一些建議。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 奧氮平處理導(dǎo)致中縫背核多種蛋白質(zhì)差異性變化

當(dāng)加載到9%rad(114.57 mm)，上角鋼加勁肋焊縫裂縫繼續(xù)增長(zhǎng)，且梁上翼緣螺栓松動(dòng)，且梁腹板屈曲明顯，正向峰值荷載停止增加，并且由于作動(dòng)器牽引繩長(zhǎng)度限制，遂停止實(shí)驗(yàn)。

2.2 差異蛋白的GO Term功能注釋和富集分析

1.2.2 體質(zhì)量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)基線和實(shí)驗(yàn)第1、2、3、4周末測(cè)量每只大鼠體質(zhì)量。

經(jīng)過18個(gè)月的選擇過程，紐斯凱爾最終選定BWX技術(shù)負(fù)責(zé)其小堆的制造、裝配和運(yùn)輸。BWX技術(shù)將立即啟動(dòng)第一階段制造工作，該階段將持續(xù)到2020年6月。預(yù)計(jì)BWX技術(shù)將選擇精密定制部件公司(Precision Custom Components)作為部件制造分包商。紐斯凱爾表示，下兩個(gè)階段的合同將在隨后簽訂。

2.3 差異蛋白KEGG通路富集分析

第三，傳統(tǒng)的教學(xué)模式的特點(diǎn)是以教材為中心，以灌輸知識(shí)為目的，學(xué)生缺乏自主學(xué)習(xí)的能力。課堂以講授為主，教學(xué)方法單一守舊，師生之間缺少互相交流。長(zhǎng)期的知識(shí)搬運(yùn)和簡(jiǎn)單課堂理論教學(xué)方式，單一化教學(xué)手段，死記硬背考核方式，阻礙了學(xué)生學(xué)習(xí)積極性的發(fā)揮，消磨了學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，制約了學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)精神的形成和發(fā)展。

2.4 差異蛋白COG分析

差異蛋白所屬的COG條目分類主要包括信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，轉(zhuǎn)運(yùn)后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)與監(jiān)護(hù)；轉(zhuǎn)錄，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生，細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸（圖7）。

將奧氮平組與對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白富集分析，富集到KEGG 通路共15條，富集程度顯著性最高的前5條有流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、5-羥色胺能突觸、丁酸代謝、甲狀腺激素合成和IL-17信號(hào)通路等（圖6）。

2.5 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

通過STRING數(shù)據(jù)庫，對(duì)比較組中的差異蛋白之間的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，Hmgcs2、Cav1、Hsp90b1、Canx、Gnai1、MAPK9和Gng14位于PPI網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)，直接或間接涉及5-HT突觸信號(hào)通路（圖8）。

2.6 qRT-PCR驗(yàn)證丁酸代謝及5-HT能突觸相關(guān)基因表達(dá)差異

根據(jù)KEGG通路分析及蛋白互作分析結(jié)果，我們選擇丁酸代謝及5-HT能突觸相關(guān)的4個(gè)蛋白表達(dá)差異明顯的基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示：參與丁酸代謝而為細(xì)胞提供能量的線粒體核基因Hmgcs2的mRNA表達(dá)水平在藥物處理組比對(duì)照組下調(diào)（<0.01)。而5-HT2 受體調(diào)控的3 個(gè)基因Gnai1Pla2g4e 和Slc6a4 的mRNA表達(dá)水平在藥物處理組比對(duì)照組分別提高（<0.05，圖9）。

奧氮平處理組和對(duì)照組共鑒定到6750種蛋白質(zhì)，定量到6670種蛋白；共篩選出兩組之間差異表達(dá)蛋白214種，其中上調(diào)蛋白72種、下調(diào)蛋白142種（圖1）。

2.7 Western blot驗(yàn)證丁酸代謝及5-HT能突觸相關(guān)基因表達(dá)差異

通過Western blot分析兩組中縫背核的3種蛋白Hmgcs2、Gnai1和Slc6a4，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，Hmgcs2表達(dá)下降（<0.01），而Gnai1和Slc6a4表達(dá)升高（<0.01，圖10）。

2.8 奧氮平持續(xù)處理4周大鼠的體質(zhì)量無顯著變化

實(shí)驗(yàn)第4周末奧氮平組與對(duì)照組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(=0.061，=0.806)，對(duì)照組大鼠肺部感染1例，未納入統(tǒng)計(jì)（表1）。

3 討論

現(xiàn)有關(guān)奧氮平誘導(dǎo)大鼠體質(zhì)量增加的研究結(jié)果并不一致，與動(dòng)物模型使用非典型抗精神病藥物、飲食組成、觀察時(shí)間和性別等因素相關(guān)，奧氮平誘導(dǎo)雌性大鼠體質(zhì)量增加的模型易建立，標(biāo)準(zhǔn)飲食雌性大鼠灌胃、主動(dòng)口服［1～2 mg/(kg·d)］奧氮平2～8周引起體質(zhì)量顯著性增加和代謝變化。雄性大鼠被給予類似人類飲食的飲食，灌胃口服奧氮平［0.5～2 mg/(kg·d)］3周誘導(dǎo)體質(zhì)量顯著增加，高脂肪飲食雄性大鼠通過飲水主動(dòng)口服奧氮平［約1.5 mg/(kg·d)］4月，體質(zhì)量和脂肪墊較對(duì)照組顯著增加，標(biāo)準(zhǔn)飲食雄性大鼠只是脂肪墊較對(duì)照組顯著增加而體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，簡(jiǎn)單改變飲食組成不太可能阻止抗精神病藥物引起的長(zhǎng)期脂肪積累和體質(zhì)量增加，推測(cè)標(biāo)準(zhǔn)飲食雄性大鼠需要更長(zhǎng)時(shí)間的奧氮平治療才可能引起體質(zhì)量顯著增加。

本研究結(jié)果顯示，奧氮平連續(xù)處理4周大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.061，P=0.806)。這與相關(guān)報(bào)道相符，奧氮平模型大鼠攝食量和體質(zhì)量顯著增加需要5～16周或更長(zhǎng)時(shí)間。因此，在奧氮平誘導(dǎo)大鼠體質(zhì)量增加的前期，哪些信號(hào)通路發(fā)生了改變而導(dǎo)致了后續(xù)的代謝變化呢？本文利用iTRAQ技術(shù)分析奧氮平持續(xù)處理4周大鼠的中縫背核差異表達(dá)蛋白，并進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析。我們發(fā)現(xiàn)奧氮平連續(xù)處理4周的大鼠中縫背核蛋白表達(dá)出現(xiàn)了72種上調(diào)和142種下調(diào)。GO結(jié)果顯示這些差異表達(dá)蛋白廣泛分布在細(xì)胞各部位、細(xì)胞內(nèi)及蛋白質(zhì)復(fù)合物中，主要介導(dǎo)了細(xì)胞過程、生化調(diào)節(jié)、代謝過程、應(yīng)激反應(yīng)及多種細(xì)胞器的形成過程。差異表達(dá)蛋白KEGG通路富集分析提示了富集程度顯著性依次為流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、5-HT能突觸、丁酸代謝、甲狀腺激素合成和IL-17信號(hào)通路等。我們對(duì)5-HT能突觸通路相關(guān)的差異表達(dá)蛋白通過qRT-PCR、Western blot進(jìn)一步進(jìn)行了驗(yàn)證，其中參與丁酸代謝而為細(xì)胞提供能量的線粒體核基因Hmgcs2的mRNA及其蛋白表達(dá)水平在藥物處理組明顯下調(diào)，5-HTR2調(diào)控的基因Slc6a4、Gnai1的mRNA及其蛋白表達(dá)水平在藥物處理組均出現(xiàn)顯著高表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為進(jìn)一步探尋奧氮平作用于中樞5-HT神經(jīng)系統(tǒng)的潛在靶蛋白及其相關(guān)通路提供了參考價(jià)值。

本研究表明，奧氮平連續(xù)處理4周后大鼠中縫背核相關(guān)丁酸代謝通路的幾個(gè)重要蛋白Hmgcs2、Echs1和L2hgdh 出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，且Hmgcs2 表達(dá)下調(diào)通過了qRT-PCR、Western blot驗(yàn)證。丁酸是腸道菌產(chǎn)生的一種主要短鏈脂肪酸（SCFA），被腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)的丁酸可以通過血腦屏障，作為腸-腦軸的信號(hào)分子，為神經(jīng)細(xì)胞提供能量。丁酸代謝由?；o酶A合成酶家族加入輔酶A酯生成乙酰輔酶A，線粒體中Hmgcs2將乙酰輔酶A合成為酮體、提供細(xì)胞能量，Hmgcs2表達(dá)的下調(diào)導(dǎo)致酮體生成減少及體內(nèi)多種酸性代謝產(chǎn)物增加，誘導(dǎo)中樞5-HT 神經(jīng)元細(xì)胞受損。Echs1表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致脂肪酸線粒體β氧化活性降低、ATP生成減少，氧化磷酸化被抑制，L2hgdh表達(dá)的下調(diào)導(dǎo)致小鼠腦組織中的組蛋白甲基化明顯增加、引發(fā)線粒體功能障礙和神經(jīng)毒性反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞受損，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞（包括5-HT神經(jīng)元細(xì)胞）凋亡。因此，奧氮平長(zhǎng)期使用可能造成中樞5-HT神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少，色氨酸羥化酶2(TPH2)、5羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(5-HTT)表達(dá)下調(diào)，5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA）含量及5-HIAA/5-HT比值顯著降低，促進(jìn)攝食和體質(zhì)量增加，表明中樞5-HT合成和降解減少，抑制了中樞5-HT能突觸信號(hào)通路。

中樞5-HT能突觸通路由5-HT的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和5-HT R激活等主要環(huán)節(jié)組成，各環(huán)節(jié)相互協(xié)同與制約，維持5-HT信號(hào)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)。奧氮平拮抗中樞5-HT R2A/5-HT R2C而減少5-HT神經(jīng)元細(xì)胞的抑制性突觸后電流、增加5-HT釋放，奧氮平連續(xù)處理大鼠30 d未觀察到腦5-HIAA的顯著變化，且5-HT水平顯著升高，推測(cè)奧氮平使用早期可能促使中樞5-HT能突觸通路反射性上調(diào)。中樞5-HT與5-HT R1A/5-HT R1B、5-HT R2A/5-HT R2C結(jié)合而參與攝食調(diào)節(jié)。5-HT R1A/5-HT R1B、5-HT R2A/5-HT R2C屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族成員。本研究KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)奧氮平處理組大鼠中縫背核組織5-HT突觸能通路的重要蛋白Gng14、Gnai1和Pla2g4e被上調(diào)。qPCR、Western blot結(jié)果也確認(rèn)了Gnai1、Slc6a4的mRNA及其蛋白表達(dá)水平在藥物處理組明顯上調(diào)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，上調(diào)G-蛋白Gnai1和Gng14表達(dá)可誘導(dǎo)5-HT R1A/5-HT R1B活化，從而激活5-HT能突觸通路?；赑la2g4e的表達(dá)上調(diào)推測(cè)Pla2g4e上游蛋白Gnaq的活性可能上調(diào)。G-蛋白Gnaq活性上調(diào)而誘導(dǎo)5-HT R2A/5-HT R2C活化，Pla2g4e的表達(dá)上調(diào)還能顯著增加神經(jīng)元樹突棘，促進(jìn)5-HT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。差異表達(dá)蛋白PPI分析，差異表達(dá)蛋白中Hmgcs2、Cav1、Hsp90b1、Canx、Gnai1、MAPK9和Gng14位于PPI網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)。綜合考慮差異蛋白的變化情況及其相互作用，奧氮平使用早期大鼠中縫背核組織差異表達(dá)蛋白Hmgcs2、Cav1、Hsp90b1、Canx、Slc6a4、Gnai1、MAPK9、Gng14均涉及5-HT突觸能通路，參與大鼠機(jī)體代謝障礙的中樞調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，奧氮平使用初期的大鼠中縫背核差異表達(dá)蛋白主要涉及5-HT能突觸、丁酸代謝通路等較為負(fù)責(zé)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。提示奧氮平長(zhǎng)期使用對(duì)這些通路的持續(xù)觀察和神經(jīng)元存活等研究對(duì)奧氮平的作用機(jī)理及其副作用研究具有重要意義。本研究沒有進(jìn)一步對(duì)每個(gè)通路進(jìn)行詳細(xì)的功能驗(yàn)證，下一步擬將進(jìn)一步通過免疫組化、腦脊液和血液生化指標(biāo)等方法進(jìn)行分析。本研究沒有對(duì)其它腦區(qū)的變化進(jìn)行同步分析，僅觀察奧氮平4周的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將增加奧氮平處理時(shí)間，建立體質(zhì)量增加等代謝障礙的大鼠模型，并分析長(zhǎng)期奧氮平處理模型中蛋白質(zhì)組學(xué)變化，動(dòng)態(tài)、整體水平闡明奧氮平等第二代抗精神病藥介導(dǎo)體重增加的中樞5-HT 作用機(jī)制，為探尋其更有效干預(yù)靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。