韋國(guó)蘭，白 鳳，龍杰鳳，胡秀虹，吳漢清

(凱里學(xué)院，貴州 凱里 556011)

中藥黃精為滇黃精、黃精和多花黃精的干燥根莖，其性平、味甘，入脾、腎、肺經(jīng)，具有補(bǔ)腎益精、滋陰潤(rùn)燥等功效[1-2]，主治肺燥干咳、心悸氣短、體虛乏力、高血壓和糖尿病等癥，為我國(guó)傳統(tǒng)藥材，屬“藥食同源”植物[3]。黃精作為藥食兩用的中藥，具有悠久的歷史，貴州黔東南苗藥材市場(chǎng)黃精資源豐富，很多人喜歡用黃精燉雞湯、燉豬蹄、煮粥，據(jù)說(shuō)不僅味鮮而且還很大補(bǔ)；可以美容養(yǎng)顏緩解衰老；黃精也被利用開(kāi)發(fā)做成保健食品。

現(xiàn)代研究表明，黃精含有多糖、皂苷、醌類(lèi)、多酚類(lèi)和多種對(duì)人體有用的氨基酸等成分，具有延緩衰老、降低血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗抑郁、改善記憶功能和防止阿爾茨海默病等作用[4-10]。其中氨基酸是黃精補(bǔ)益強(qiáng)壯作用和增強(qiáng)免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，對(duì)維持生命活動(dòng)有著非常重要的作用[11]。目前，關(guān)于黃精總氨基酸的提取文獻(xiàn)報(bào)道較少，所以本實(shí)驗(yàn)用貴州黔東南州鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣的黃精作為原料，對(duì)黃精總氨基酸的提取進(jìn)行研究，使用酶標(biāo)儀測(cè)定黃精總氨基酸的含量，來(lái)確定黃精總氨基酸的提取最佳條件。本實(shí)驗(yàn)為黃精的開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精采自貴州省凱里市鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣羊場(chǎng)鎮(zhèn)，所用試劑為L(zhǎng)-酪氨酸、磷酸二氫鉀、合水茚三酮、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇等。

FSP120-AAAN2酶標(biāo)儀(全漢企業(yè)股份有限公司)、電子分析天平(奧豪斯國(guó)際貿(mào)易公司)、80-2離心沉淀器(常州市國(guó)立實(shí)驗(yàn)設(shè)備研究所)、HH-S 數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州市翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠)、WGLL-230BE 電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(北京科偉水興儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 材料前處理

準(zhǔn)備黃精藥材，清洗干凈除去其表面的泥土，曬干，取黃精的根莖部位切成薄片放置在70 ℃烘箱中烘干，黃精片變脆后于萬(wàn)能粉碎中粉碎成細(xì)粉，過(guò)30目藥篩，將所得粉末裝入自封袋中保存，備實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.2 溶液的配制

茚三酮溶液的配制：稱(chēng)取茚三酮1.0012 g，加乙醇使其溶解，等全部溶完后，再移到50 mL容量瓶中定容。冷藏備用。

磷酸鹽緩沖溶液的配制：精密稱(chēng)取磷酸二氫鉀1.7057 g和氫氧化鈉0.2402 g，混合，加蒸餾水?dāng)嚢枞芙馔耆笤俚谷?50 mL容量瓶里定容至刻度線凹液面。

酪氨酸對(duì)照液的配制：精密稱(chēng)取0.0102 g 酪氨酸，加10 mL 0.02 mol/mL氫氧化鈉溶液，試劑完全溶解后用玻璃棒引流溶液到容量瓶中，用蒸餾水定容到100 mL。

供試品溶液：稱(chēng)取黃精樣品粉末2.0000 g，量取30 mL 70%的乙醇進(jìn)行超聲45 min，進(jìn)行超聲提取2次，使用真空泵進(jìn)行抽濾，合并抽出的濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)液體回收乙醇，直到?jīng)]有乙醇?xì)馕?，再用蒸餾水對(duì)浸膏溶解定容至50 mL。

1.2.3 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液管量取0.1 mg/mL酪氨酸對(duì)照液0.00 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL放入7個(gè)50 mL容量瓶，分別滴加2%茚三酮溶液1 mL、緩沖溶液2 mL，搖勻水浴加熱15 min，取出冷卻，加蒸餾水至刻度線，得到7組樣液，濃度分別為0.00 μg/mL、2.00 μg/mL、4.00 μg/mL、6.00 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL、12 μg/mL的溶液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度，參照文獻(xiàn)[11]波長(zhǎng)在570 nm處可得到相應(yīng)的吸光值，得到氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和線性回歸方程y=0.031x+0.0191，R2=0.9982，說(shuō)明酪氨酸在2.00～12.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。圖1為標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve

1.2.4 黃精總氨基酸的提取方法

稱(chēng)取黃精樣品2.0000 g，按一定料液比、一定乙醇濃度，設(shè)定提取時(shí)間、提取次數(shù)，用真空泵過(guò)濾，合并濾液，濃縮回收乙醇，加蒸餾水溶解所得的浸膏，定容到50 mL容量瓶。精取2.00 mL樣品溶液，分別滴加茚三酮溶液1 mL、磷酸鹽緩沖溶液2 mL，溶液均勻混合，用水浴鍋加熱15 min使其顯色，取出冷卻，用蒸餾水定容至50 mL，用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度并計(jì)算出氨基酸的含量。

1.2.5 黃精總氨基酸含量測(cè)定

其中，η是黃精氨基酸含量(%)；c是濃度(mg/mL)；v是體積(mL)；n是稀釋倍數(shù)；m是原料質(zhì)量(g)。

1.2.6 單因素實(shí)驗(yàn)1.2.6.1 乙醇濃度對(duì)總氨基酸提取的影響

稱(chēng)取準(zhǔn)備好的黃精樣品2.0000 g 5份，倒入燒杯中，分別加濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇30 mL，超聲提取2次，抽濾合并濾液，將料液去乙醇至沒(méi)有醇味，定容到50 mL。分別用移液管取溶液2 mL，以1.2.4項(xiàng)的方法顯色，測(cè)定吸光度A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式算出樣品濃度，再計(jì)算總氨基酸含量。

1.2.6.2 料液比對(duì)總氨基酸提取的影響

黃精樣品2.0000 g 5份，分別倒入燒杯中，提取次數(shù)2次、提取時(shí)間45 min、乙醇濃度70%，以料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的比例，分為5個(gè)水平，開(kāi)始超聲提取45 min，提取2次，抽濾、合并濾液，將料液去乙醇到無(wú)醇味。定容到50 mL，分別取溶液2 mL，按1.2.4項(xiàng)下加“茚三酮”起，依次操作。

1.2.6.3 提取時(shí)間對(duì)總氨基酸提取的影響

稱(chēng)取黃精樣品2.0000 g 5份，分別倒入燒杯中，提取次數(shù)、料液比、乙醇濃度分別為2次、1∶15、70%，分別超聲提取15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，提取2次，進(jìn)行抽濾、合并濾液，將溶液去乙醇至無(wú)醇味，以時(shí)間從短到長(zhǎng)編為1～5號(hào)，定容到50 mL，用移液管量取溶液2 mL到50 mL容量瓶中，按1.2.4項(xiàng)下加“茚三酮”起，依次操作。

1.2.6.4 提取次數(shù)對(duì)總氨基酸提取的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取黃精樣品2.0000 g 5份，分別倒入燒杯中，把乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間分別設(shè)為70%、1∶15、45 min，分5個(gè)水平，超聲進(jìn)行提取，分別提取1～5次，進(jìn)行抽濾、合并得到的濾液，濃縮回收乙醇，以次數(shù)編為1～5號(hào)，定容至50 mL，用移液管量取樣品溶液2 mL，分別加2 mL磷酸緩沖液和1 mL茚三酮溶液，放入水浴鍋中進(jìn)行加熱15 min，取出冷卻，定容到50 mL刻度線。

其次，改革開(kāi)放后歷史時(shí)期是在改革開(kāi)放前歷史時(shí)期基礎(chǔ)上的撥亂反正和合乎邏輯的繼承發(fā)展，沒(méi)有改革開(kāi)放后歷史時(shí)期對(duì)中國(guó)特色社會(huì)主義道路的成功開(kāi)辟，改革開(kāi)放前歷史時(shí)期的成果甚至不能鞏固和發(fā)展。

1.2.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，用字母A、B、C、D分別表示乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)定四因素三水平，來(lái)測(cè)定黃精氨基酸的含量，設(shè)計(jì)L9(34)正交表如表1。

表1 L9(34)的正交試驗(yàn)表Tab.1 L9(34)orthogonal test table

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)總氨基酸提取的影響

由表2和圖2可知：隨著乙醇濃度的升高，提取出來(lái)的氨基酸含量也隨著增大，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)所提取的含量最高，所以當(dāng)濃度為70%左右時(shí)對(duì)黃精總氨基酸提取是最有利的。

圖2 乙醇濃度對(duì)總氨基酸提取的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on total amino acids extraction

表2 乙醇濃度對(duì)總氨基酸提取的影響Tab.2 Effect of ethanol concentration on total amino acids extraction

2.1.2 料液比對(duì)總氨基酸提取的影響

由表3和圖3可知：隨著料液比提取液的增加，黃精氨基酸含量也隨著增多，當(dāng)料液比為1∶15時(shí)氨基酸提取的含量最高，1∶15后提取液的含量反而下降。

表3 料液比對(duì)總氨基酸提取的影響Tab.3 Effect of solid-liquid ratio on total amino acids extraction

圖3 料液比對(duì)總氨基酸提取的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on total amino acids extraction

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)總氨基酸提取的影響

由表4和圖4可以看出：隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總氨基酸含量也越多，當(dāng)提取時(shí)間為45 min時(shí)總氨基酸的含量最多。

表4 提取時(shí)間對(duì)總氨基酸提取的影響Tab.4 Effect of extraction time on total amino acids extraction

圖4 提取時(shí)間對(duì)總氨基酸提取的影響Fig.4 Effect of extraction time on total amino acids extraction

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)總氨基酸提取的影響

由表5和圖5可看出：當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，黃精氨基酸的含量較高，隨著提取次數(shù)的增多，提取液中含氨基酸量略高于提取2次的含量，但是趨于平穩(wěn)狀態(tài)，所以從實(shí)驗(yàn)效率來(lái)說(shuō)，提取次數(shù)為2次時(shí)最節(jié)約時(shí)間，有利于氨基酸的提取實(shí)驗(yàn)操作。

表5 提取次數(shù)對(duì)總氨基酸提取的影響Tab.5 Effect of extraction times on total amino acids extraction

圖5 提取次數(shù)對(duì)總氨基酸提取的影響Fig.5 Effect of extraction times on total amino acids extraction

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，用字母A、B、C、D分別表示乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)定四因素三水平，設(shè)計(jì)L9(34)正交表如表6。

表6 水平因素表Tab.6 Table of levels and factors

表7為正交試驗(yàn)結(jié)果分析，由表7可知：正交試驗(yàn)提取出來(lái)的最佳工藝為A2B3C2D2。在黃精總氨基酸提取的影響因素中，影響總氨基酸最主要的因素是乙醇濃度，影響的次要的因素是提取次數(shù)，影響最小的是提取時(shí)間和料液比。

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Results of orthogonal test

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

為了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，用A2B3C2D2的條件，取3次黃精樣品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表8所示。

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證表Tab.8 Verification of experimental results

RSD=0.44%，說(shuō)明黃精氨基酸在這個(gè)提取工藝下是可行的。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探索了超聲波輔助提取黃精總氨基酸的最佳工藝條件，為黃精總氨基酸的提取和綜合利用奠定基礎(chǔ)。在單因素實(shí)驗(yàn)提取溶劑的濃度、液料比、提取的時(shí)間、超聲提取次數(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)得到超聲波提取黃精總氨基酸最好的提取條件為乙醇濃度為70%，料液比為1∶15，提取時(shí)間是45 min，提取次數(shù)是2次；對(duì)提取氨基酸的影響大小順序是：乙醇濃度>提取次數(shù)>料液比>提取時(shí)間。最后通過(guò)對(duì)結(jié)果的驗(yàn)證，說(shuō)明了黃精氨基酸在這個(gè)提取工藝下是可行的。