李 俊，陳蓓蓓，謝婷婷，何 偉，龔會(huì)琴，廖朝選▲

(1貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州 貴陽(yáng) 550002；2貴州省分析測(cè)試研究院，貴州 貴陽(yáng) 550014)

農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的作用，可控制病蟲害的發(fā)生并減少損失，保證農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)與產(chǎn)量，其對(duì)人類經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展意義重大。但由于農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的長(zhǎng)期使用，對(duì)生態(tài)環(huán)境的安全和人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。唑蟲酰胺(Tolfnpyrad)是原日本三菱化學(xué)公司開發(fā)的新型吡唑雜環(huán)類殺蟲殺螨劑[1]，毒性中等，具有觸殺作用，并兼具殺卵、抑食、抑制產(chǎn)卵作用，殺蟲譜廣，對(duì)鱗翅目、半翅目、鞘翅目、膜翅目、雙翅目、纓翅目害蟲及螨類均有效，尤其是對(duì)鱗翅目小菜蛾、纓翅目薊馬等害蟲有特效[2-4]。由于該藥具有較好的速效性，持效期長(zhǎng)，在蔬菜生產(chǎn)中被廣泛使用。但是唑蟲酰胺的多次、超劑量使用，會(huì)隨地下水或土壤徑流等進(jìn)入河流、湖泊等水體，對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成威脅。

斑馬魚作為典型的水生試驗(yàn)動(dòng)物模型，其基因與人類具有80%以上的高度同源性[5]。大型溞是一種常見(jiàn)的水生生物，主要以藻類為食，是魚類和無(wú)脊椎動(dòng)物的餌料，是水生態(tài)系統(tǒng)中能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)的重要環(huán)節(jié)[6]。羊角月牙藻是眾多藻類中常見(jiàn)的一種，是水生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，藻類是水生食物鏈的基礎(chǔ)，其種類的多樣性和初級(jí)生產(chǎn)量直接影響水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能[7]。斑馬魚、大型溞和羊角月牙藻分別位于水生態(tài)系統(tǒng)中不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)，具有易獲取、成本低廉、個(gè)體小、繁殖快且對(duì)毒物敏感的特點(diǎn)，常被用于農(nóng)藥和化學(xué)品等環(huán)境污染物的的毒性測(cè)試，用以評(píng)價(jià)水生態(tài)系統(tǒng)的暴露風(fēng)險(xiǎn)[8]。

有研究報(bào)道，15%唑蟲酰胺懸浮劑在田間推薦用藥量下對(duì)七星瓢蟲和螟黃赤眼蜂有致死或毒性效應(yīng)，在農(nóng)田內(nèi)施用對(duì)非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物的危害商值HQin>5，風(fēng)險(xiǎn)不可接受[9]。由此可知，唑蟲酰胺對(duì)環(huán)境生物有害，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)具有一定威脅。目前，對(duì)于水生態(tài)系統(tǒng)中魚類、溞類和藻類的毒性研究較少，缺少相關(guān)數(shù)據(jù)開展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。本研究以斑馬魚、大型溞、羊角月牙藻為試驗(yàn)生物，分別探究了30%唑蟲酰胺懸浮劑對(duì)三種水生生物的毒性效應(yīng)，結(jié)合農(nóng)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行等級(jí)劃分，為30%唑蟲酰胺懸浮劑安全使用和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

溶解氧測(cè)試儀：美國(guó)哈希公司，HQ-25d；智能人工氣候培養(yǎng)箱：上海比郎儀器制造有限公司，PRX-250B；照度計(jì)：柯尼卡美能達(dá)(中國(guó))投資有限公司，T-10A；藻類智能鑒定計(jì)數(shù)儀，杭州迅數(shù)科技有限公司，E100。

1.2 試驗(yàn)生物

斑馬魚：購(gòu)自于上海宏業(yè)觀賞魚養(yǎng)殖場(chǎng)，2～3月齡，體長(zhǎng)19～23 mm，體重0.13～0.19 g。試驗(yàn)開始前在溫度為21～25 ℃、pH為6.0～8.5、溶解氧>80% ASV(空氣飽和值)的條件下馴養(yǎng)7天。

大型溞：購(gòu)自于武漢可樂(lè)多生物科技有限公司，由本實(shí)驗(yàn)室自行繁殖，以純種小球藻喂養(yǎng)，于溫度20 ℃±2 ℃、光暗比為16∶8、光照強(qiáng)度1000～1500 lux條件下培養(yǎng)，選取溞齡小于24 h的非頭胎溞進(jìn)行試驗(yàn)。

羊角月牙藻：購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，于溫度為21～24 ℃、光照強(qiáng)度為4440～8880 Lux的條件下培養(yǎng)，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)良好的藻類進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚類急性毒性試驗(yàn)

本試驗(yàn)參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》第12部分：魚類急性毒性試驗(yàn)[10]的規(guī)定進(jìn)行，采用靜態(tài)法進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)濃度組放入10尾斑馬魚，試驗(yàn)液體積為3 L，每個(gè)濃度組設(shè)1個(gè)平行對(duì)照組，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，試驗(yàn)周期為96 h。每24 h觀察并記錄一次供試魚的中毒癥狀和統(tǒng)計(jì)魚的死亡率；每24 h測(cè)定一次試驗(yàn)液的溫度、溶解氧含量、pH值。

1.3.2 溞類急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)

本試驗(yàn)參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》第13部分：溞類急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)[11]的規(guī)定進(jìn)行，采用靜態(tài)法進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)濃度組放入5只溞齡小于24 h的非頭胎溞，試驗(yàn)液體積為50 mL，每個(gè)處理組同時(shí)設(shè)置4個(gè)平行對(duì)照組，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，試驗(yàn)周期為48 h。試驗(yàn)開始后，每24 h觀察并記錄一次大型溞的中毒癥狀和統(tǒng)計(jì)分析溞的抑制率；分別于0 h和48 h記錄試驗(yàn)溶液的溫度、溶解氧含量、pH值。

1.3.3 藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)

本試驗(yàn)參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》第14部分：藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)[12]的規(guī)定進(jìn)行，用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻溶液配制試驗(yàn)液，采用靜態(tài)法進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)濃度組的試驗(yàn)液體積為100 mL，同時(shí)設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照組和1個(gè)空白對(duì)照組，試驗(yàn)周期為72 h。試驗(yàn)開始后，每24 h觀察每個(gè)濃度組中藻的生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)分析藻的生長(zhǎng)抑制率；分別于0 h和72 h記錄試驗(yàn)溶液的pH值和光照強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的毒性測(cè)試結(jié)果，使用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總，采用SPSS 19.0軟件中的Probit(概率單位法)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，然后分別計(jì)算30%唑蟲酰胺懸浮劑對(duì)斑馬魚的96 h半數(shù)致死濃度LC50、大型溞的48 h半數(shù)抑制效應(yīng)濃度EC50、羊角月牙藻的72 h半數(shù)抑制效應(yīng)濃度ErC50、EyC50、95%置信區(qū)間及回歸方程。

1.5 毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》進(jìn)行毒性等級(jí)劃分，毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Toxicity classification standard

2 結(jié)果與分析

2.1 參比物試驗(yàn)

為了評(píng)估受試生物對(duì)毒性的敏感性是否符合試驗(yàn)要求，試驗(yàn)前用重鉻酸鉀對(duì)斑馬魚、大型溞、羊角月牙藻進(jìn)行參比試驗(yàn)。結(jié)果表明：重鉻酸鉀對(duì)斑馬魚的24 h-LC50為223 mg/L，95%置信限為202～243 mg/L，重鉻酸鉀對(duì)斑馬魚的24 h-LC50在200～400 mg/L范圍內(nèi)，符合質(zhì)量控制要求；重鉻酸鉀對(duì)大型溞的24 h-EC50為1.08 mg/L，95%置信限為0.97～1.21 mg/L，重鉻酸鉀對(duì)大型溞的24 h-LC50在0.6～2.1 mg/L范圍內(nèi)，符合質(zhì)量控制要求；重鉻酸鉀對(duì)羊角月牙藻的72 h-ErC50為1.1 mg/L，95%置信限為0.7～1.6 mg/L，符合質(zhì)量控制要求。

2.2 毒性效應(yīng)

在30%唑蟲酰胺懸浮劑暴露下，斑馬魚出現(xiàn)抽搐、異?？焖儆蝿?dòng)、正面或側(cè)面平躺、死亡等中毒癥狀。由表2可知，在3.00～15.00 μg a.i./L的5個(gè)等比試驗(yàn)濃度中，斑馬魚發(fā)生了不同程度的死亡，在96 h試驗(yàn)周期內(nèi)累計(jì)死亡率分別為10%、40%、60%、90%、100%，其死亡率與試驗(yàn)濃度呈正相關(guān)關(guān)系。

表2 魚類急性毒性試驗(yàn)中斑馬魚的死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.2 Mortality statistics of Barchydanio rerio in the acute toxicity test

在0.30～3.40 μg a.i./L的30%唑蟲酰胺懸浮劑影響下，大型溞發(fā)生游動(dòng)緩慢、體色改變、死亡等中毒抑制癥狀，隨時(shí)間的推移，抑制效應(yīng)愈加明顯。從表3可知，在0.30 μg a.i./L、0.50 μg a.i./L、0.80 μg a.i./L、1.30 μg a.i./L、2.10 μg a.i./L、3.40 μg a.i./L濃度暴露的試驗(yàn)溞，24 h的抑制率分別為0、10%、20%、25%、40%、70%，48 h的抑制率分別為5%、15%、25%、30%、65%、90%。

表3 溞類急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)中大型溞的抑制率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.3 Inhibition rate of Daphnia magna in the acute activity inhibition test

羊角月牙藻暴露于0.030～7.20 μg a.i./L的30%唑蟲酰胺懸浮劑試驗(yàn)液中，藻細(xì)胞會(huì)發(fā)生變形、變小、粘連式聚集的中毒癥狀，唑蟲酰胺對(duì)羊角月牙藻的藻細(xì)胞生長(zhǎng)和生物量均有抑制作用。從表4可知，在72 h的暴露時(shí)間里，0.030 mg a.i./L、0.068 mg a.i./L、0.17 mg a.i./L、0.47 mg a.i./L、1.10 mg a.i./L、2.80 mg a.i./L和7.20 mg a.i./L濃度的30%唑蟲酰胺懸浮劑試驗(yàn)液中，藻類生長(zhǎng)抑制率分別為0.3%、8.5%、14.7%、16.5%、22.5%、63.7%和82.8%，而生物量增長(zhǎng)的抑制率為1.7%、35.6%、53.5%、57.2%、66.9%、91.4%、97.2%。羊角月牙藻的生物量指標(biāo)相對(duì)藻類生長(zhǎng)指標(biāo)對(duì)唑蟲酰胺更為敏感。

表4 藻類生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)中羊角月牙藻的抑制率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.4 Inhibition rate of Pseudokirchneriella subcapitata in the growth inhibition test

2.3 50%致死/效應(yīng)濃度與毒性等級(jí)

將試驗(yàn)測(cè)試濃度與試驗(yàn)生物死亡率或抑制率進(jìn)行相關(guān)性分析，并用“1.4數(shù)據(jù)處理”相關(guān)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由表5知，30%唑蟲酰胺懸浮劑對(duì)斑馬魚96 h的急性毒性LC50為0.0055 mg a.i./L，95%置信限為0.0048～0.0063 mg a.i./L；對(duì)大型溞48 h急性活動(dòng)抑制效應(yīng)EC50為0.0015 mg a.i./L，95%置信限為0.0011～0.0021 mg a.i./L；對(duì)羊角月牙藻72 h的藻細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)ErC50=1.88 mg a.i./L，95%置信限為0.99～4.94 mg a.i./L；對(duì)藻生物量增長(zhǎng)72 h的抑制效應(yīng)EyC50為0.26 mg a.i./L，95%置信限為0.11～0.54 mg a.i./L。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)導(dǎo)則》相關(guān)規(guī)定及劃分標(biāo)準(zhǔn)，30%唑蟲酰胺懸浮劑對(duì)斑馬魚、大型溞、羊角月牙藻的毒性等級(jí)分別為劇毒、劇毒、高毒。

表5 供試物30%唑蟲酰胺懸浮劑對(duì)3種水生生物的毒性結(jié)果分析Tab.5 Analysis of toxicity of 30% tolfenpyrad suspending agent on the three aquatic organisms

3 結(jié)論與討論

魚類、溞類和藻類作為水生脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物和初級(jí)生產(chǎn)者的代表，其中對(duì)毒物敏感的物種常被用于水生毒理試驗(yàn)。研究采用的試驗(yàn)生物對(duì)重鉻酸鉀的敏感性測(cè)試結(jié)果分別為斑馬魚(24 h-LC50=223 mg a.i./L)、大型溞(24 h-EC50=1.08 mg a.i./L)和羊角月牙藻(72 h-ErC50為1.1 mg a.i./L)，表明研究使用生物對(duì)毒物敏感，符合試材規(guī)定。

研究結(jié)果顯示，30%唑蟲酰胺懸浮劑對(duì)斑馬魚、大型溞和羊角月牙藻會(huì)造成不同程度的抑制效應(yīng)或致死效應(yīng)，等級(jí)分別為劇毒、劇毒、高毒。表明唑蟲酰胺對(duì)水生生物具有很高的毒性，使用唑蟲酰胺產(chǎn)品后，不能直接在河流、湖泊等水體進(jìn)行包裝清洗，或剩余藥液直接傾倒入水。同時(shí)，在生態(tài)漁業(yè)生產(chǎn)的稻-魚、稻-蝦等環(huán)境中，不能使用唑蟲酰胺產(chǎn)品，以防造成漁業(yè)毒害。據(jù)中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)報(bào)道，唑蟲酰胺相關(guān)產(chǎn)品主要登記于茶樹、甘藍(lán)、柑橘樹、茄子、豇豆的害蟲防治，其不直接作用于水體，嚴(yán)格按規(guī)定用藥可能對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)有限，但具體風(fēng)險(xiǎn)情況還需結(jié)合產(chǎn)品的性質(zhì)和行為開展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。