葛 蕾，鄭 輝，張文濤，趙 銳

(淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 淄博 255086)

0 引言

冠心生脈丸由中醫(yī)古方“生脈飲”加味而成，是純中藥制劑，主要以人參、五味子、丹參、赤芍等組方，諸藥合用可以益心氣、活心血、通心絡(luò)，對(duì)于冠心病、心絞痛、心律不齊等疾病具有良好的治療作用[1]。五味子有斂汗生津的功效，其主要成分為五味子醇甲。丹參能化瘀止痛，活血通脈，有效成分主要是丹參素鈉、丹參酮ⅡA和丹酚酸B。赤芍有活血化瘀、增強(qiáng)祛瘀止痛之功，主要是芍藥苷發(fā)揮作用。故此，測(cè)定主要有效成分含量對(duì)控制產(chǎn)品質(zhì)量至關(guān)重要，也是藥品能發(fā)揮功效的重要依據(jù)。

現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，通過(guò)查詢(xún)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，以往研究中，有對(duì)冠心生脈丸中芍藥苷、丹參酮ⅡA和丹參素含量測(cè)定的報(bào)道[2-4]，但未查詢(xún)到對(duì)五味子醇甲和丹酚酸B含量的測(cè)定文章，也未見(jiàn)丹參素鈉、丹參酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍藥苷同時(shí)測(cè)定的方法研究。為了全面監(jiān)控藥品質(zhì)量，使檢驗(yàn)效率更高、結(jié)果更準(zhǔn)確，使用HPLC-DAD法，建立了同時(shí)測(cè)定5種成分的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀Agilent 1260型，DAD檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn))。電子分析天平ML204型，感量0.1 mg；MS205DU型，感量0.01 mg(均為瑞士梅特勒-托利多公司生產(chǎn))。高純水儀IQ 7000型(美國(guó)密理博公司生產(chǎn))。超聲波清洗器KQ-300GVDV型(寧波科生儀器廠生產(chǎn))。冠心生脈丸樣品(批號(hào)分別為20210406、20210410、20210608)均為市售。芍藥苷(批號(hào)110736-202145，含量94.6%)、五味子醇甲(批號(hào)110857-201815，含量99.7%)、丹參酮ⅡA(批號(hào)110766-202022，含量98.9%)、丹酚酸B(批號(hào)111562-201917含量96.6%)、丹參素鈉(批號(hào)110855-201915 含量97.8%)(均為中國(guó)食品藥品檢定研究院生產(chǎn))。甲醇、乙腈均為色譜級(jí)(美國(guó)默克生產(chǎn))。磷酸優(yōu)級(jí)(國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn))。

1.2 溶液的配制

對(duì)照品單標(biāo)溶液：精密稱(chēng)取芍藥苷10.34 mg、五味子醇甲9.60 mg、丹參酮ⅡA10.55 mg、丹酚酸B44.16 mg和丹參素鈉41.28 mg。準(zhǔn)備25 mL量瓶，分別置于其中，溶解定容使用50%甲醇水溶液。

混標(biāo)溶液：分別精準(zhǔn)量取單標(biāo)液適量，預(yù)備10 mL量瓶，全部放置其中，定容使用50%甲醇水溶液，得到丹參素鈉、丹參酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍藥苷分別為100.92、8.35、5.74、117.31和29.34 μg/mL的混標(biāo)溶液。

樣品溶液：取樣品5袋，搗碎研細(xì)，精密稱(chēng)取1 g置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲60 min，取出放涼，定容使用甲醇，用有機(jī)濾膜(0.45 μm)過(guò)濾即得。

陰性樣品溶液：按藥品制備方法制備缺丹參、赤芍、五味子的陰性樣品，按樣品溶液制備方法操作，即得。

1.3 色譜條件

色譜柱Agilent Eclipse Plus C18(5 μm；4.6×250 mm)。檢測(cè)器為DAD檢測(cè)器。流動(dòng)相0.1%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫0～2 min，流動(dòng)相A92%，2～10 min，流動(dòng)相A92%→75%，10～30 min，流動(dòng)相A75%→10%，流速2.0 mL/min。柱溫35℃，進(jìn)樣量20 μL。此色譜條件下，鄰峰分離度均大于30，色譜峰的理論板數(shù)均大于5 000，陰性樣品對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)干擾。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

所測(cè)5種成分紫外最大吸收波長(zhǎng)各不相同，如果采用單一波長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)某種成分峰面積較小、測(cè)量不準(zhǔn)確的情況。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[5-9]，在200～400 nm用DAD檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定了5種成分紫外最大吸收波長(zhǎng)。根據(jù)樣品中5種化合物的含量，綜合考量峰面積大小、檢測(cè)精度、操作方便，計(jì)算簡(jiǎn)單等因素，確定在230 nm波長(zhǎng)處測(cè)定丹酚酸B、芍藥苷和五味子醇甲的含量，丹參素鈉含量測(cè)定采用286 nm波長(zhǎng)，丹參酮ⅡA含量的測(cè)定采用270 nm波長(zhǎng)。

2.2 流動(dòng)相和流速的選擇

采用等度洗脫很難將4種成分與其他復(fù)雜成分分離開(kāi)，因此建立一種梯度洗脫方法[10-12]。分別考察了乙腈和甲醇與水、0.05%磷酸溶液、0.1%磷酸溶液的多種組合，結(jié)果乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相效果最好，5種成分色譜峰峰形尖銳，分離度好。流速分別考察了1.0、1.5和2.0 mL/min 3種流速，經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，最終選擇了2.0 mL/min流速，既可以保證分離效果同時(shí)大大縮短了時(shí)間，極大提高了工作效率。

2.3 提取方法的選擇

考察了加熱回流和超聲波兩種提取方法，測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差別，故選擇易操作的超聲法。對(duì)超聲提取時(shí)間(30、60和80 min)也做了考察，發(fā)現(xiàn)超聲30 min結(jié)果偏小，超聲60 min與80 min結(jié)果差別不明顯，故提取時(shí)間定為60 min。

2.4 線性方程與檢出限

分別吸取混標(biāo)溶液5、10、20 、25、30 μL，按1.3色譜條件測(cè)試，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)，繪制方程。

將混標(biāo)溶液溶液不斷稀釋?zhuān)?.3色譜條件測(cè)試，通過(guò)測(cè)量11次空白溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差，從而得出檢出限和定量限。5種組分的回歸方程，檢出限和定量限見(jiàn)表1。

2.5 精密度試驗(yàn)

取混合標(biāo)液20 μL，按1.3色譜條件測(cè)定6次，丹參素鈉、丹參酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍藥苷峰面積的RSD分別為1.3%、1.0%、1.1%、0.9%和1.2%(n=6)，表明儀器精密度良好。

表1 5種化合物線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Tab.1 Linear range, linear equation, correlation coefficient, detection limit and quantification limit of 5 compounds

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取相同樣品6份，按1.2中的方法制備，按1.3中色譜條件進(jìn)樣20 μL，分別測(cè)定丹參素鈉、丹參酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍藥苷的含量，結(jié)果平均含量分別為5.89、0.37、0.24、4.68和1.22 mg/g ，RSD分別為1.4%、1.4%、1.2、1.6和1.5%，說(shuō)明本方法有較好的重復(fù)性。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別于0、2、4、8、12、24 h測(cè)定樣品溶液，結(jié)果丹參素鈉、丹參酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍藥苷峰面積的RSD分別為1.81%、1.43%、1.12%、1.29%和1.34%，說(shuō)明樣品溶液放置24 h具有良好的穩(wěn)定性。

2.8 回收率試驗(yàn)

取同一批樣品各1 g，置50 mL量瓶中，共6份，分別精密加入丹參素鈉、丹參酮ⅡA、五味子醇甲、丹酚酸B和芍藥苷單標(biāo)溶液3.5 mL、0.8 mL、0.6 mL、2.5 mL和3 mL，按1.2中方法制備，分別測(cè)定，得到加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，平均回收率范圍在99.18%～101.69%，說(shuō)明此方法有良好的準(zhǔn)確性。

表2 回收率試驗(yàn)Tab.2 Recovery test

續(xù)表2

3 結(jié)語(yǔ)

建立了冠心生脈丸中丹參素鈉、芍藥苷、丹酚酸B、五味子醇甲、丹參酮ⅡA 5種成分含量同時(shí)測(cè)定的高效液相色譜方法。測(cè)定的5種物質(zhì)涉及冠心生脈丸中3種重要中藥材，為冠心生脈丸藥品質(zhì)量監(jiān)控提供了重要方法。