張文艷，林宇琪，劉宏瑩，張 偉

(吉林農(nóng)業(yè)科技學院，吉林 吉林 132101)

0 引言

枸杞是茄科枸杞屬植物，為明亮的橙紅色橢球漿果，屬傳統(tǒng)名貴藥材。中醫(yī)認為它有補腎、明目、潤肺的功效，用于肝腎不足所致的頭暈目眩、視力減退、消渴等證，且療效確切顯著，故有“紅寶”之稱[1-2]。糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，目前臨床上用來治療糖尿病的藥物主要有胰島素及化學藥物，但磺脲類藥物容易發(fā)生低血糖及體重增加，個別病人會出現(xiàn)皮膚過敏反應、白細胞減少等；二甲雙胍胃腸道反應多見，長期應用可能會影響維生素B12的吸收；胰島素增敏劑起效較慢，可導致水鈉潴留，引起水腫及體重稍增，增加心衰風險及心功能3級以上禁用等,都存在著副作用[3]?；诖耍瑢τ谔烊槐＝∑返难芯砍蔀橐环N趨勢。為開發(fā)藥食同源的枸杞，探索了枸杞不同組分降糖活性，針對糖尿病進行安全有效的治療，為枸杞資源的綜合利用及開發(fā)治療糖尿病的藥物和功能性食品提供了參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥材

枸杞為2018年9月份成熟的寧夏枸杞，為茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)枸杞(Lyciumbarbarum)的果實。

1.2 動物

健康昆明種小鼠55只，雌雄各半，體重20±2 g，購于長生生物制品有限公司。動物分籠飼養(yǎng)，每籠10只，喂以普通飼料，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境保持在室溫20℃～25℃，相對濕度40%～60%。

1.3 儀器與試劑

UV759CRT型紫外分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司生產(chǎn))，血糖儀安穩(wěn)免調(diào)碼型(三諾生物傳感股份有限公司生產(chǎn))，三諾安穩(wěn)血糖試條(三諾生物傳感股份有限公司生產(chǎn))，四氧嘧啶(美國Sigma公司生產(chǎn)，批號C10317497)，鹽酸二甲雙胍腸溶片(貴州天安藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號20190420)，蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，批號100081-200406)，其他所用試劑皆為分析純。

2 方法

2.1 試驗前處理

將枸杞放置于鼓風干燥箱中55℃下干燥。將烘干后的枸杞粉碎，過20目篩，裝入密封袋中，放入冰箱備用。

2.2 枸杞有效成分的提取

精確稱量枸杞1 000 g，加入適量體積為30%、60%、90%的乙醇，在超聲功率100 W、提取溫度為50℃的條件下超聲輔助提取30 min，提取3次，合并濾液，將總提取液濃縮至無醇味。

2.3 枸杞黃酮類化合物的分離

取一定量的D101大孔樹脂對有效成分進行分離純化，枸杞總提取液通過大孔樹脂吸附，依次使用蒸餾水、60%乙醇和80%的乙醇進行洗脫。60%的乙醇洗脫液濃縮至無醇味，定容至500 mL，置于冰箱備用。

2.4 枸杞黃酮含量測定方法

2.4.1 對照品溶液制備

稱取10 mg蘆丁標準品，用60%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，配成濃度為0.2 mg/mL的標準液。

2.4.2 標準曲線繪制

分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL濃度0.2 mg/mL蘆丁溶液置于10 mL容量瓶中，加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，搖勻后靜置6 min；再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻后靜置6 min；加4 mL 4% NaOH溶液，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，在波長510 nm處測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標，蘆丁濃度(C)為橫坐標，進行線性回歸，計算回歸方程[4]。

2.4.3 黃酮含量測定

精密吸取60%乙醇洗脫液1.0 mL于50 mL容量瓶中，加入60%乙醇稀釋至刻度，搖勻。精確吸取稀釋洗脫液1 mL，置于25 mL容量瓶中，按照上述方法在510 nm波長處測定吸光度平行3次，代入回歸方程計算樣品中黃酮含量。

2.5 降血糖動物試驗

2.5.1 糖尿病小鼠模型的建立

本試驗采用四氧嘧啶誘發(fā)糖尿病動物模型方法，用滅菌生理鹽水將四氧嘧啶配制成10 mg/mL的溶液，正常小鼠購買后，所有動物自由飲水、食。適應性喂養(yǎng)一周后(測空腹血糖，作為該批小鼠的基礎血糖值)，除空白對照小組小鼠5只外，其余禁食不禁水15 h后，腹腔注射新鮮配制的四氧嘧啶160 mg/kg，72 h后對禁食不禁水4 h的小鼠尾靜脈取血，使用血糖儀檢測血糖濃度，選取血糖≥16.7 mmol/L者用于實驗[5]。

2.5.2 實驗小鼠的分組與給藥

在未進行建模的正?？瞻讓φ战M小鼠中隨機選取5只作為空白組，并將建模成功的小鼠隨機分為11組，每組5只，模型組、陽性對照組、藥物A1、A2、A3(黃酮低、中、高劑量組)。各組給藥劑量如下：空白組、模型組灌胃等劑量生理鹽水，陽性對照組灌胃鹽酸二甲雙胍200 mg/kg，藥物A1、A2、A3為灌胃黃酮25.8、51.6、103.2 mg/kg，連續(xù)灌胃20 d。

2.6 測定指標

2.6.1 體重

每天定時給藥，共給20 d，間隔5 d稱量每只小鼠的體重并記錄(0 d、5 d、10 d、15 d、20 d)，觀察各組小鼠體重增減情況。

2.6.2 空腹血糖

每天定時給藥，共給20 d，間隔5 d尾靜脈取血一次，用血糖儀檢測空腹血糖(0 d、5 d、10 d、15 d、20 d)。檢測之前，小鼠更換墊料，稱重并禁食不禁水12 h。在第20 d測完血糖后按下式計算降糖率：

2.6.3 糖耐量

末次給藥后，進行腹腔注射葡萄糖耐量實驗，小鼠空腹6 h后，按小鼠體重腹腔注射新鮮配制的200 mg/mL葡萄糖溶液2 g/kg，尾靜脈取血，用血糖儀測定注射葡萄糖后0、30、60和120 min時間點的血糖值。血糖值結果用 mmol/L表示，計算曲線下面積(AUC)，比較各組的葡萄糖耐量水平。血糖曲線下面積S(mmol/L)=(a+2b+3c+4d)/4，其中a、b、c、d分別為灌胃葡萄糖溶液0、30、60、120 min后的血糖值[6]。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結果與分析

3.1 枸杞黃酮含量測定結果

按照枸杞黃酮含量測定方法得出蘆丁標準曲線回歸方程為y=8.858 6x+0.004 7，R2=0.999 2(y為吸光度，x為黃酮濃度)。以此測定黃酮的含量，得出枸杞黃酮的含量為1.72 mg/g。

3.2 枸杞中黃酮類化合物對糖尿病小鼠體重的影響

從表1可以看出，小鼠體重在22.19～41.14 g，空白組的小鼠在正常進食的情況下體重隨著時間的變化呈現(xiàn)遞增趨勢，模型組小鼠因在高血糖的影響下進食、進水量增加，但體重隨著時間變化體重呈現(xiàn)遞減；陽性對照組在高血糖的影響下，但是在鹽酸二甲雙胍片的作用下體重變化不明顯；A1組小鼠體重隨著時間變化均呈下降趨勢；A2、A3小鼠的體重在給藥過程中體重先增加后減少，小鼠的體重有所下降或下降到正常值。

表1 枸杞不同組分對糖尿病小鼠體重的影響

3.3 枸杞中黃酮類化合物對糖尿病小鼠空腹血糖的影響

根據(jù)表2可以看出，空白組小鼠因未得糖尿病所以空腹血糖沒有變化；模型組小鼠因沒有對其進行治療，其空腹血糖值持續(xù)增高；陽性對照組小鼠的血糖有著明顯的降低糖尿病小鼠空腹血糖值，平均降糖率為47.17%；A1、A2、A3組小鼠均有降血糖的趨勢，但隨著濃度的增加小鼠降血糖效果越明顯。

表2 枸杞不同組分對糖尿病小鼠空腹血糖的影響

3.4 枸杞中黃酮類化合物對糖尿病小鼠糖耐量的影響

由從表3可以看出，各組小鼠的血糖值均在30 min時達到最高峰，30 min后，黃酮類化合物能不同程度地降低葡萄糖負荷后糖尿病小鼠的血糖值。各組與空白組相比較而言，0 min時A1、A3組小鼠均呈極顯著差異(P<0.01)，30 min時藥物組都呈極顯著差異(P<0.01)，60 min時陽性對照組、B3組與空白對照組成極顯著差異，120 min時A3均成極顯著差異(P<0.01)；與模型組相比較，0 min時陽性對照、A2組呈顯著差異(P<0.05)，30 min時A2組成極顯著差異(P<0.01)，與陽性對照、A3組呈顯著差異(P<0.05)，60 min時陽性對照、A1、A2組呈極顯著差異，120 min時陽性對照、A、A2呈極顯著差異(P<0.01)；從曲線下面積(AUC)來看陽性對照、A1均與空白組、模型組呈極顯著差異(P<0.01)，A3與空白組呈極顯著差異，A3組與模型組呈顯著差異(P<0.05)。

表3 枸杞不同組分對糖尿病小鼠糖耐量的影響

4 結論

四氧嘧啶是自由基激活劑，可使胰島中超氧陰離子及過氧化氫等自由基濃度增高，致細胞損傷壞死，引起胰島素的合成分泌障礙，進而引發(fā)糖尿病[11]。

采用四氧嘧啶造模方法，綜合考察了枸杞多糖、黃酮、總生物堿的降糖效果并將其進行了對比，為枸杞資源的綜合利用及開發(fā)治療糖尿病藥物和功能性食品提供了參考依據(jù)。但具體的降糖效果及枸杞降糖活性組分作用機理及有效成分有待進一步研究。