劉秀珍 王蘊(yùn)紅 張冰 彭慶文

1 安慶師范大學(xué)體育學(xué)院（安徽安慶246133）

2 首都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)與健康學(xué)院（北京100191）

3 清華大學(xué)體育部（北京100084）

4 懷化學(xué)院體育學(xué)院（湖南懷化418000）

馬拉松是目前最受歡迎的一項(xiàng)長(zhǎng)跑體育賽事，但同時(shí)也是一項(xiàng)高風(fēng)險(xiǎn)的運(yùn)動(dòng)。勞力性熱射?。╡xertional heat stroke，EHS）是馬拉松運(yùn)動(dòng)員發(fā)生猝死的重要原因[1]。勞力性熱射病是在運(yùn)動(dòng)中體溫調(diào)節(jié)系統(tǒng)不堪重負(fù)時(shí)發(fā)生的核心體溫過(guò)高（＞40℃/＞104℉）以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[2]。勞力性熱射病是一種醫(yī)學(xué)急癥，病情進(jìn)展極快，半小時(shí)內(nèi)沒(méi)有接受快速降溫處理的患者發(fā)生多器官衰竭乃至死亡的病例明顯上升[3]。對(duì)于確診病例或疑似患者，必須在現(xiàn)場(chǎng)快速冷卻治療，然后才是轉(zhuǎn)運(yùn)到急診部[4]。

勞力性熱射病發(fā)病機(jī)制涉及高溫?zé)釗p傷、胃腸道缺血、熱休克反應(yīng)、凝血系統(tǒng)激活、腎臟水鹽代謝失衡等方面[5-7]。其冷卻治療機(jī)制可能與腎臟水鹽代謝、熱損傷、胃腸道炎癥變化、凝血功能等有關(guān)，其中水鹽代謝與體溫調(diào)節(jié)密切相關(guān)[8，9]?？估蚣に兀╲asopressin），是機(jī)體調(diào)節(jié)水平衡的重要激素，其分泌異常增多與運(yùn)動(dòng)性疾病的發(fā)生發(fā)展密不可分。Oh 及Siegel[10，11]的研究表明，在馬拉松等耐力性運(yùn)動(dòng)中發(fā)生的勞力性熱射病及運(yùn)動(dòng)性低鈉血癥與機(jī)體嚴(yán)重脫水引起的抗利尿激素過(guò)度分泌有關(guān)。Kim 等[12]的研究表明，冷應(yīng)激能誘導(dǎo)抗利尿激素mRNA 表達(dá)顯著性下調(diào)，但是有關(guān)冷卻治療是否能誘導(dǎo)勞力性熱射病患者抗利尿激素的改變并沒(méi)有進(jìn)一步的研究結(jié)果?？估蚣に赜? 種受體，分別是受體1（V1）、受體2（V2）和受體3（V3），其中V2 受體主要分布在腎臟集合管，介導(dǎo)抗利尿激素在腎臟中對(duì)水的重吸收，發(fā)揮抗利尿作用[13，14]。Sun 等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，低溫環(huán)境引起大鼠V2 受體合成中V2 mRNA 表達(dá)顯著性降低及利尿現(xiàn)象。但是冷卻治療是否通過(guò)調(diào)控抗利尿激素及其受體V2 對(duì)機(jī)體水代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，國(guó)內(nèi)尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究探討了冷卻治療對(duì)抗利尿激素及其受體V2 mRNA 及蛋白表達(dá)的影響，為勞力性熱射病冷卻治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與測(cè)試過(guò)程

7 周齡雄性Sprague-Dawley 大鼠，初始體重為237.82 ± 30.78 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食，人工光照控制晝夜節(jié)律，室溫20℃~25℃，濕度45%~50%。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 天，隨機(jī)分為6 組，常溫對(duì)照組（normal control group，NC 組）8 只、熱射病發(fā)病組（heat stroke onset group，HSO 組）9 只、熱射病休息1 組（heat stroke rest group 1，HSR1 組）9 只、熱射病冷浸1 組（heat stroke cold group 1，HSC1 組）7 只、熱射病休息2 組（heat stroke rest group 2，HSR2 組）9 只和熱射病冷浸2 組（heat stroke cold group 2，HSC2 組）8只，各組大鼠體重?zé)o顯著性差異。在高溫運(yùn)動(dòng)至力竭建立勞力性熱射病大鼠模型及冷卻治療期間進(jìn)行體溫測(cè)試，測(cè)試時(shí)間點(diǎn)分別為運(yùn)動(dòng)前、運(yùn)動(dòng)后、冷浸5 min或休息5 min、休息60 min。對(duì)完成預(yù)定實(shí)驗(yàn)的大鼠取材，進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)試：血液測(cè)試指標(biāo)為紅細(xì)胞比容（hematocrit，Hct）和抗利尿激素；腎臟測(cè)試指標(biāo)為抗利尿激素受體V2 mRNA 表達(dá)和V2 蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及測(cè)試過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及測(cè)試過(guò)程

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備與冷卻治療

1.2.1 適應(yīng)性訓(xùn)練

熱射病組大鼠在建模前先進(jìn)行為期5 天的適應(yīng)性訓(xùn)練。跑臺(tái)坡度設(shè)置為0。起始運(yùn)動(dòng)速度為18 m/min，每天遞增2 m/min，最后達(dá)到26 m/min。起始運(yùn)動(dòng)時(shí)間為30 min，每天遞增10 min，最后達(dá)到60 min。適應(yīng)性訓(xùn)練安排見(jiàn)表1。

表1 大鼠適應(yīng)性訓(xùn)練安排

1.2.2 勞力性熱射病大鼠模型建立

適應(yīng)性訓(xùn)練后休息3 天，大鼠在跑臺(tái)上進(jìn)行一次性高溫力竭運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)，建立勞力性熱射病大鼠模型。高溫力竭運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)在高溫高濕實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，溫度控制為36℃±1℃，濕度控制為75% ±5%相對(duì)濕度（relative humidity，RH）。根據(jù)Bedford[16]最大攝氧量表及大鼠高溫力竭運(yùn)動(dòng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定大鼠進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)時(shí)坡度為5°，速度為28 m/min，相當(dāng)于最大攝氧量60%~80%的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。根據(jù)Lam[17]報(bào)道的經(jīng)典型熱射病大鼠模型（暴露在高溫環(huán)境中的大鼠直腸溫度上升到約42℃和平均動(dòng)脈壓從峰值下降到約25毫米汞柱）和Chang[18]報(bào)道的熱運(yùn)動(dòng)至力竭誘導(dǎo)勞力性熱射病大鼠模型以及勞力性熱射病大鼠建模預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定勞力性熱射病大鼠模型診斷標(biāo)準(zhǔn)為大鼠在高溫環(huán)境中運(yùn)動(dòng)至力竭，并使直腸溫度上升到約42℃。大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭標(biāo)準(zhǔn)為不能維持既定運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，滯留于跑臺(tái)后擋板，使用聲、電刺激及毛刷連續(xù)驅(qū)趕3次無(wú)效。

1.2.3 冷水浸泡治療方案

根據(jù)Riana[7]報(bào)道的海軍陸戰(zhàn)隊(duì)馬拉松運(yùn)動(dòng)中勞力性熱射病冷卻治療方案和Stewart[6]報(bào)道的耐力運(yùn)動(dòng)中勞力性熱射病患者院前冷卻治療案例設(shè)定大鼠冷水浸泡預(yù)實(shí)驗(yàn)，建立大鼠冷水浸泡方案。本研究冷水浸泡方案最終確定為19℃（實(shí)際溫度為19℃±1℃），冷水浸泡5 min。大鼠休息溫度設(shè)定為室溫20℃（實(shí)際溫度為20℃±1℃）。高溫運(yùn)動(dòng)至力竭建立勞力性熱射病大鼠模型后，HSR1 組大鼠休息5 min，HSC1 組大鼠冷浸5 min，HSR2組大鼠休息5 min+60 min，HSC2組大鼠冷浸5 min，休息60 min。HSC1 組和HSC2 組大鼠用于觀(guān)察冷卻治療后不同時(shí)間點(diǎn)的生理反應(yīng)變化，HSC1 組用于觀(guān)察冷卻治療后即刻效果，HSC2 組用于觀(guān)察冷卻治療后60 min效果。HSR1組和HSR2組大鼠用于觀(guān)察未經(jīng)冷卻治療相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的生理反應(yīng)變化，HSR1組用于觀(guān)察休息5 min效果（與HSC1組對(duì)照），HSR2組用于觀(guān)察休息60 min 效果（與HSC2 組對(duì)照）。冷卻速率以大鼠冷浸5 min 期間單位時(shí)間內(nèi)核心體溫的減少量來(lái)表示，其計(jì)算公式為v＝。

1.3 取材及處理

按照0.32 ml/100 g 體重的劑量給大鼠注射10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉。冰上解剖大鼠，從腹主動(dòng)脈取4 ml 血液，2 ml 血液用于測(cè)試血常規(guī)，另2 ml 血液用于測(cè)試抗利尿激素；摘取腎臟后立即放入液氮中冷凍及保存。

1.4 測(cè)試指標(biāo)與方法

1.4.1 核心體溫測(cè)試

采用北京搏貝科技有限公司JNT-200 型鼠肛溫計(jì)測(cè)量大鼠直腸溫度作為核心體溫。測(cè)量方法為：將溫度計(jì)探頭插入大鼠直腸6.5 cm，固定探頭，待讀數(shù)穩(wěn)定后讀取數(shù)值[9]。

1.4.2 血液紅細(xì)胞比容

采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)試大鼠血常規(guī)，單管測(cè)定，選取Hct 指標(biāo)進(jìn)行研究，儀器為日本光電工業(yè)株式會(huì)社MEK-7222K 血細(xì)胞分析儀，試劑由上海東湖生物醫(yī)學(xué)有限公司提供，批內(nèi)差：CV≤1.5%，批間差：CV≤2%。

1.4.3 血清抗利尿激素

采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)試大鼠血清抗利尿激素，單管測(cè)定，儀器為美國(guó)ThermoMK3 酶標(biāo)儀，ELISA 試劑盒來(lái)自美國(guó)Enzolife 公司，批內(nèi)差：CV≤10%，批間差：≤15%。

1.4.4 腎臟V2mmRRNNAA表達(dá)

采用熒光定量qRT-PCR 檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)試腎臟V2 mRNA 表達(dá)。根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)查找的目的基因V2及內(nèi)參GAPDH 的基因序列設(shè)計(jì)引物，由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成（見(jiàn)表2）。取適量組織放入液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉末并轉(zhuǎn)移到EP 管中，用美國(guó)Invitrogen 公司提供的Trizol試劑抽提總RNA，用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入特異性引物，采用EvaGreen 飽和染料Mix 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR 檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù)三次。獲取CT 值、平均CT 值、△CT 值和△△CT 值，采用2-△△CT相對(duì)定量公式計(jì)算V2基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 熒光定量qRT-PCR引物

1.4.5 腎臟V2蛋白表達(dá)

1）蛋白抽提：預(yù)冷RIPA 蛋白抽提試劑，加入cocktail 蛋白酶抑制劑；12000 rpm 離心15 min。取上清，進(jìn)行蛋白定量。2）BCA 法蛋白定量：按照BCA 蛋白定量試劑盒使用說(shuō)明測(cè)定蛋白濃度。3）Western Blot 檢測(cè)：根據(jù)目的蛋白的分子量，配制10%分離膠，濃縮膠濃度為5%。將樣本分別加入凝膠孔中，30 μg/孔。電泳條件為：濃縮膠恒壓90 V，20 min；分離膠恒壓150 V，根據(jù)預(yù)染蛋白marker 確定電泳時(shí)間。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜條件為：100 V 恒壓；0.22 μm 孔徑PVDF 膜，60 min。5%BSA-TBST 室溫封閉，水平搖床孵育1 h。一抗孵育：5%BSA-TBST稀釋一抗（抗利尿激素，1∶2000；GAPDH，1∶1000，Abcam公司），一抗來(lái)源為兔，4℃水平搖床孵育過(guò)夜。第2 日，TBST 洗膜：3×10 min。二抗孵育：5%BSA-TBST 稀釋二抗[山羊抗兔IgG（H+L），HRP，1∶10000，Abcam 公司]，室溫孵育1 h。將ECL 發(fā)光液滴加到膜的蛋白面，反應(yīng)3~5 min。膠片曝光：10 s~5 min，顯影2 min，定影。4）計(jì)算結(jié)果：采用Image J 軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值，Western Blot 結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示。組間比較應(yīng)用非參數(shù)檢驗(yàn)K 個(gè)獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，有顯著性后再進(jìn)行后續(xù)檢驗(yàn)；后續(xù)檢驗(yàn)采用非參數(shù)檢驗(yàn)2 個(gè)獨(dú)立樣本Mann-Whitney U 檢驗(yàn)方法。采用非參數(shù)檢驗(yàn)2 個(gè)相關(guān)樣本W(wǎng)ilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn)方法對(duì)同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠核心體溫及冷卻速率

高溫運(yùn)動(dòng)前，各組大鼠核心體溫在H 檢驗(yàn)中有顯著性差異（P＜0.01）。后續(xù)U 檢驗(yàn)和Wilcoxon 檢驗(yàn)結(jié)果如表3 所示。高溫運(yùn)動(dòng)前，與NC 組比較，HSO 組大鼠核心體溫顯著升高（P＜0.01）；而參加高溫運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)的5組（HSO 組、HSR1 組、HSC1 組、HSR2 組和HSC2 組）大鼠核心體溫相互間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。同一組大鼠運(yùn)動(dòng)后核心體溫與運(yùn)動(dòng)前比較，HSC1 組和HSC2組顯著升高（均P＜0.05）；HSO組、HSR1組與HSR2組顯著升高（均P＜0.01）。高溫運(yùn)動(dòng)后各組大鼠核心體溫?zé)o顯著性差異（P＞0.05）。與HSR1 組比較，冷浸5 min 后的HSC1 組大鼠核心體溫顯著降低（P＜0.01）。與HSR2組比較，冷浸5 min 后的HSC2 組大鼠核心體溫顯著降低（P＜0.01）。與HSR2 組比較，冷浸5 min+休息60 min后的HSC2 組大鼠核心體溫顯著降低（P＜0.05）。參加冷浸的HSC1組和HSC2組大鼠在冷浸期間的冷卻速率分別為1.18 ± 0.25℃/min 和1.10 ± 0.26℃/min，二者之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠運(yùn)動(dòng)前、后各時(shí)間點(diǎn)核心體溫及冷卻速率比較

2.2 大鼠血液紅細(xì)胞比容

各組大鼠紅細(xì)胞比容在H 檢驗(yàn)中有顯著性差異（P＜0.05）。后續(xù)U 檢驗(yàn)結(jié)果如表4 所示，與NC 組比較，HSO 組大鼠紅細(xì)胞比容顯著升高（P＜0.05）。其余組間比較均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表4 各組大鼠紅細(xì)胞比容比較

2.3 大鼠血清抗利尿激素

各組大鼠血清抗利尿激素在H 檢驗(yàn)中有顯著性差異（P＜0.05）。后續(xù)U 檢驗(yàn)結(jié)果如表5 所示，與NC 組比較，HSO 組大鼠血清抗利尿激素顯著升高（P＜0.01）。其余組間比較均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表5 各組大鼠抗利尿激素比較

2.4 大鼠腎臟V2mRNA表達(dá)

各組大鼠腎臟V2 mRNA 表達(dá)在H 檢驗(yàn)中有顯著性差異（P＜0.01）。后續(xù)U 檢驗(yàn)結(jié)果如表6 所示，與NC組比較，HSO 組大鼠腎臟V2 mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與HSO 組比較，常溫休息HSR1 組和HSR2 組腎臟V2 mRNA 表達(dá)無(wú)顯著性差異（均為P＞0.05），經(jīng)過(guò)冷浸的HSC1 組和HSC2 組大鼠腎臟V2 mRNA 表達(dá)均顯著降低（均為P＜0.01）；與休息HSR1組比較，冷浸HSC1組大鼠腎臟V2 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與休息HSR2 組比較，冷浸HSC2 組大鼠腎臟V2 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。

表6 各組大鼠腎臟V2 mRNA表達(dá)比較

2.5 大鼠腎臟V2蛋白表達(dá)

各組大鼠腎臟V2 蛋白表達(dá)在H 檢驗(yàn)中有顯著性差異（P＜0.01）。后續(xù)U 檢驗(yàn)結(jié)果如表7 所示，與NC 組比較，HSO 組大鼠腎臟蛋白表達(dá)顯著性升高（P＜0.01）；與HSO 組比較，常溫休息HSR1 組和HSR2 組大鼠腎臟V2 蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（均為P＞0.05），經(jīng)過(guò)冷浸的HSC1 組和HSC2 組大鼠腎臟V2 蛋白表達(dá)顯著降低（均為P＜0.05）；與休息HSR1 組比較，冷浸HSC1 組大鼠腎臟V2 蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與休息HSR2組比較，冷浸HSC2 組大鼠腎臟V2 蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表7 各組大鼠腎臟V2蛋白表達(dá)比較

3 討論

3.1 冷療對(duì)EHS大鼠核心體溫的影響

本研究中常溫對(duì)照組未經(jīng)過(guò)適應(yīng)性訓(xùn)練，而5 個(gè)勞力性熱射病模型組均參加了適應(yīng)性訓(xùn)練。建模前，經(jīng)過(guò)適應(yīng)訓(xùn)練的熱射病發(fā)作HSO組大鼠核心體溫顯著高于未經(jīng)過(guò)適應(yīng)訓(xùn)練的常溫對(duì)照組，但是經(jīng)過(guò)適應(yīng)訓(xùn)練的5 組大鼠相互之間核心體溫并無(wú)顯著性差異。張婷等[19]建立了經(jīng)典型與勞力性熱射病動(dòng)物模型，用于研究?jī)煞N模型大鼠各主要器官病理改變的異同，大鼠未進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。Zhang 等[20]建立了勞力性熱射病大鼠模型，用于研究紅景天苷對(duì)線(xiàn)粒體的保護(hù)作用，大鼠在建模前未進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。與張婷及Zhang 的研究有所不同的是，本研究在勞力性熱射病大鼠建模前均進(jìn)行了適應(yīng)性訓(xùn)練，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)適應(yīng)訓(xùn)練的大鼠核心體溫明顯高于未經(jīng)過(guò)適應(yīng)訓(xùn)練的大鼠，說(shuō)明適應(yīng)性訓(xùn)練會(huì)引起大鼠核心體溫上升。

勞力性熱射病動(dòng)物模型包括大鼠模型和小鼠模型。Chang 等[18]的研究表明，大鼠在36℃高溫下運(yùn)動(dòng)至力竭時(shí)出現(xiàn)了核心體溫過(guò)高、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、血壓較低等熱射病癥狀。King 等[21]分別在37.5℃、38.5℃和39.5℃高溫下利用轉(zhuǎn)輪建立了熱射病小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙（失去意識(shí)）時(shí)的最高核心體溫為42.1℃～42.5℃。與Chang 及King 的研究相類(lèi)似，本研究中，高溫運(yùn)動(dòng)至力竭的5 組大鼠均出現(xiàn)了勞力性熱射病癥狀，包括運(yùn)動(dòng)后核心體溫上升到42.0℃左右和出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙（意識(shí)喪失），符合勞力性熱射病建模標(biāo)準(zhǔn)，表明勞力性熱射病建模成功。

冷水浸泡（cold water immersion，CWI）多用于既往體健的運(yùn)動(dòng)員或士兵在勞力性熱射病發(fā)作最初幾分鐘時(shí)的快速降溫急救。Wohlfert 等[22]的研究表明，冷水浸泡由于降溫速率最快從而成為勞力性熱射病冷卻急救公認(rèn)最有效的方法，患者急救后幾乎全部存活。本研究中，HSC1 組大鼠在19℃冷浸5 min 后核心體溫由42.00℃降到36.10℃，且顯著低于HSR1 組大鼠在20℃環(huán)境中休息5 min 后的核心體溫（39.68℃）；HSC2 組大鼠在19℃冷浸5 min 后核心體溫由41.76℃降到36.36℃，且顯著低于HSR2 組大鼠在20℃環(huán)境中休息5 min 后的核心體溫（39.13℃），說(shuō)明19℃冷浸5 min 對(duì)勞力性熱射病大鼠核心體溫已產(chǎn)生顯著影響。Wohlfert等[23]對(duì)運(yùn)動(dòng)員10℃冷水浸泡時(shí)的冷卻速率進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)預(yù)冷組和對(duì)照組在核心體溫從39.5℃降溫到38℃期間的冷卻速率分別為0.18℃/min 和0.19℃/min。Godek 等[24]的研究發(fā)現(xiàn)：對(duì)39℃下熱運(yùn)動(dòng)至力竭或核心體溫上升到39.5℃的運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行10℃冷水浸泡時(shí)，越野賽運(yùn)動(dòng)員的冷卻速率（0.26℃/min）高于足球運(yùn)動(dòng)員（0.16℃/min），但二者均被認(rèn)為是理想的冷卻速率（dT/dt＞0.155℃/min）；其中越野賽運(yùn)動(dòng)員核心體溫下降2℃至正常所需的時(shí)間僅為8 min。與前人的研究有所不同，本研究中兩組熱射病大鼠冷水浸泡5 min 期間冷卻速率分別為1.18℃/min 和1.10℃/min，比人體冷卻速率更快，時(shí)間更短，提示不同物種在體溫調(diào)節(jié)方面可能存在較大的差異性。本研究中在20℃環(huán)境中休息60 min后，HSR2 組和HSC2 組大鼠核心體溫均有所下降；且HSC2 組大鼠核心體溫顯著低于HSR2 組大鼠，說(shuō)明20℃環(huán)境休息不僅可以降溫，而且有助于延續(xù)冷卻治療效果。

3.2 冷療對(duì)EHS大鼠血液濃縮程度的影響

血常規(guī)指標(biāo)紅細(xì)胞比容是反映血液濃縮/稀釋程度的重要指標(biāo)，在臨床上常用于識(shí)別病人的脫水情況。全軍重癥醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)和全軍熱射病防治專(zhuān)家組[25，26]在中國(guó)熱射病診斷與治療專(zhuān)家共識(shí)中指出，勞力性熱射病發(fā)作時(shí)，因機(jī)體大量脫水引起血液濃縮及炎癥變化，導(dǎo)致血常規(guī)檢測(cè)異常，表現(xiàn)為紅細(xì)胞比容異常升高，血紅蛋白升高，血小板初期正常，繼而迅速下降，白細(xì)胞計(jì)數(shù)異常升高、中性粒細(xì)胞百分比偏高等癥狀。本研究中HSO組大鼠在高溫力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)勞力性熱射病發(fā)作時(shí)出現(xiàn)紅細(xì)胞比容顯著性升高，表明紅細(xì)胞比容是勞力性熱射病病理生理學(xué)改變的敏感指標(biāo)。

Riana 等[7]的研究提出：冷水浸泡是確保馬拉松等耐力運(yùn)動(dòng)所致勞力性熱射病患者存活的冷卻急救方案，隨后應(yīng)該立刻檢測(cè)血液指標(biāo)，包括血常規(guī)、電解質(zhì)、血糖、腎功能等，治療脫水、電解質(zhì)異常和急性腎功能衰竭等。Erkus 等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，冷暴露會(huì)引起人體紅細(xì)胞比容下降。本研究中冷浸后即刻及其后60 min時(shí)，紅細(xì)胞比容有下降趨勢(shì)，但未見(jiàn)顯著性差異。這提示紅細(xì)胞比容對(duì)冷卻治療期間的溫度變化不敏感。脫水是引起紅細(xì)胞比容改變的根本原因。冷卻治療對(duì)紅細(xì)胞比容沒(méi)有明顯影響，提示冷卻治療未能明顯改善熱射病機(jī)體脫水狀況。

3.3 冷療對(duì)EHS大鼠血清抗利尿激素的影響

Casa 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體過(guò)度脫水會(huì)引起體溫升高，并增加罹患熱射病風(fēng)險(xiǎn)?？估蚣に厥菣C(jī)體調(diào)節(jié)水代謝的關(guān)鍵性激素，能促進(jìn)腎臟對(duì)水的重吸收，起到抗利尿（抗脫水）效果。Saissy 等[29]的研究表明，勞力性熱射病會(huì)引起急性肝衰竭，這不僅與高熱會(huì)直接損傷肝實(shí)質(zhì)有關(guān)，也與抗利尿激素分泌過(guò)多使血液再分配引起急性肝缺血病情加重有關(guān)。在研究24小時(shí)超級(jí)耐力賽中相關(guān)低鈉血癥的發(fā)生率時(shí)，Chlibkova 等[30]研究表明，運(yùn)動(dòng)性低鈉血癥與運(yùn)動(dòng)過(guò)程中抗利尿激素過(guò)度釋放有關(guān)。本研究中，勞力性熱射病發(fā)作時(shí)，血清抗利尿激素明顯升高。上述研究結(jié)果表明，機(jī)體在通過(guò)抗利尿（抗脫水）途徑調(diào)節(jié)機(jī)體水平衡的過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)抗利尿激素過(guò)度釋放情況，使得機(jī)體水代謝發(fā)生障礙，不僅會(huì)引起運(yùn)動(dòng)性低鈉血癥和急性肝損傷，也會(huì)導(dǎo)致勞力性熱射病。這提示血液抗利尿激素是勞力性熱射病病理生理學(xué)改變的敏感指標(biāo)。Jasnic 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，4℃冷暴露60 min 對(duì)大鼠血清抗利尿激素含量沒(méi)有明顯影響。本研究中，在冷浸后即刻及其后60 min 時(shí)，血清抗利尿激素均未出現(xiàn)顯著性變化，也說(shuō)明冷浸并不能明顯改善抗利尿激素過(guò)度釋放情況。由于抗利尿激素的合成部位（下丘腦）與釋放部位（垂體后葉）并不一致，導(dǎo)致抗利尿激素釋放入血的過(guò)程滯后于抗利尿激素的合成過(guò)程。冷浸對(duì)熱射病大鼠血清抗利尿激素沒(méi)有明顯影響，其機(jī)制可能與抗利尿激素釋放入血的過(guò)程滯后于下丘腦抗利尿激素的合成有關(guān)，因此，冷卻治療與抗利尿激素的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

3.4 勞力性熱射病大鼠冷卻治療期間抗利尿激素及受體調(diào)節(jié)機(jī)制探討

抗利尿激素受體為G 蛋白耦聯(lián)受體（G proteincoupled receptors，GPCRs），包括V1、V2 和V3 三種類(lèi)型。其中V2 受體位于腎臟集合管細(xì)胞的基底側(cè)膜，介導(dǎo)抗利尿激素在腎臟對(duì)水的重吸收，起到抗利尿（抗脫水）效果。Milander 等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，鐵人三項(xiàng)運(yùn)動(dòng)中V2 受體基因的高度表達(dá)與機(jī)體嚴(yán)重脫水導(dǎo)致的體重丟失存在顯著相關(guān)。Bes 等[33]的研究進(jìn)一步證實(shí)，腎臟過(guò)度抗利尿會(huì)誘導(dǎo)V2 基因發(fā)生致病性突變，導(dǎo)致腎病綜合征患者出現(xiàn)低鈉血癥。本研究中，勞力性熱射病發(fā)作時(shí)，除了嚴(yán)重脫水外，腎臟抗利尿激素受體V2 mRNA 及V2 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，說(shuō)明機(jī)體在通過(guò)抗利尿（抗脫水）途徑調(diào)節(jié)機(jī)體水平衡的過(guò)程中出現(xiàn)了抗利尿激素受體過(guò)度分泌情況，表明抗利尿激素受體V2 過(guò)度分泌與機(jī)體致病有關(guān)，提示血液抗利尿激素受體V2是勞力性熱射病病理生理學(xué)改變的敏感指標(biāo)。

包括人類(lèi)在內(nèi)的大多數(shù)哺乳動(dòng)物在冷暴露時(shí)會(huì)發(fā)生利尿現(xiàn)象，但是利尿的機(jī)制并不完全一致。Sun 等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期冷暴露（5℃）引起大鼠腎水排泄增多，血漿抗利尿激素水平無(wú)明顯變化，腎臟抗利尿激素受體V2 mRNA 表達(dá)顯著降低，說(shuō)明長(zhǎng)期冷暴露引起大鼠利尿是由于腎臟V2 受體的抑制，而不是抗利尿激素的抑制。Broman 等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，冷誘導(dǎo)低體溫大鼠（核心體溫為28℃）出現(xiàn)明顯的利尿利鈉，并伴有腎小球?yàn)V過(guò)率、尿滲透壓和血漿抗利尿激素顯著下降，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，滲透壓不受低體溫或去氨加壓素（選擇性V2 受體激動(dòng)劑）影響，說(shuō)明低體溫所致的利尿是由于抗利尿激素和腎髓質(zhì)高滲減少所致，而不是V2 受到了抑制。本研究重點(diǎn)探討冷卻治療對(duì)勞力性熱射病大鼠抗利尿激素及V2 受體的影響，結(jié)果顯示，在冷浸后即刻及60 min 時(shí)，調(diào)節(jié)水代謝的V2 mRNA 表達(dá)均顯著性下調(diào)、V2 蛋白表達(dá)均顯著減少，抗利尿激素均未出現(xiàn)顯著性變化。這些結(jié)果說(shuō)明，冷卻治療后，抗利尿激素過(guò)度釋放情況未見(jiàn)明顯好轉(zhuǎn)，但是抗利尿激素受體V2過(guò)度分泌情況得到改善。這提示冷浸可以在一定程度上改善水代謝的調(diào)節(jié)，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制V2 受體的分泌，減弱機(jī)體的過(guò)度抗利尿反應(yīng)。本研究中60 min 的20℃環(huán)境休息延續(xù)了冷浸5 min（或休息5 min）對(duì)抗利尿激素、V2 mRNA 和V2 蛋白表達(dá)的影響，提示60 min 的20℃環(huán)境休息有助于維持冷卻治療（或常溫休息）效果。

4 結(jié)論

冷浸可以快速有效地降低熱射病大鼠核心體溫，對(duì)血液Hct及抗利尿激素沒(méi)有明顯影響，但能夠顯著抑制腎臟抗利尿激素受體V2 mRNA 及蛋白表達(dá)，改善水代謝的調(diào)節(jié)。