倪子軼

（上海辰山植物園，城市園藝技術(shù)研發(fā)與推廣中心，上海201602）

鴿子蘭（Peristeria elataHook.）是蘭科，鴿蘭屬多年生大型落葉草本植物，也是該屬的模式種，是巴拿馬的國(guó)花，受到《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》附錄Ⅰ的保護(hù)［1］，其花形奇特、花大色純，葉形飄逸，植株健美，是一種優(yōu)良的觀賞植物。鴿子蘭既適用于室內(nèi)栽培，亦能作為優(yōu)良的切花材料，極具開(kāi)發(fā)潛力，而且其花期主要在7～10 月，花序開(kāi)花可持續(xù)月余。從商業(yè)價(jià)值來(lái)看，開(kāi)花的時(shí)間限制了鴿子蘭作為觀花產(chǎn)品的使用，若能將其花期改變至元旦、春節(jié)等花卉消費(fèi)旺季，必能大大提高其商品價(jià)值，促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，因此有必要對(duì)鴿子蘭進(jìn)行花期調(diào)控技術(shù)研究。

現(xiàn)階段，鴿子蘭的相關(guān)研究主要集中在形狀觀測(cè)、組培快繁［2］等方面。鴿子蘭的花芽生長(zhǎng)情況、花器官分化進(jìn)程、成花因子及相關(guān)生理變化等方面的研究報(bào)道較少，花芽分化規(guī)律的研究報(bào)導(dǎo)在其他蘭科植物領(lǐng)域也非常罕見(jiàn)，現(xiàn)有的報(bào)道中指出可使用石蠟切片的方式進(jìn)行觀察研究［3-5］。為明確鴿子蘭成花機(jī)理，需對(duì)其花芽分化進(jìn)行觀察，為后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 材料備置

試驗(yàn)材料為假鱗莖直徑大于5 cm，具5 年苗齡且大小一致的鴿子蘭植株，于上海辰山植物園蘭科溫室進(jìn)行常規(guī)保育管理。

自2019 年7 月下旬至2019 年8 月下旬止，每隔三天取樣一次鴿子蘭花芽，每次取花芽塊1～2 個(gè)，取樣后立即置于含福爾馬林5 mL、冰醋酸5 mL、70%酒精90 mL 固定液中固定保存其花芽，用于石蠟切片，以確定鴿子蘭花芽分化的時(shí)期［6-8］。

1.2 材料固定

按試驗(yàn)設(shè)定的間隔取樣，每次取3 個(gè)花芽。在完成取樣后，應(yīng)盡快將樣品放在固定液中，需固定24 h 以上。為了加快鴿子蘭花芽吸收固定液，排出花芽間隙的空氣和固定液中溶解的空氣，把材料在真空泵中抽氣20～30 min，取出后更換新的固定液，常溫或者4℃冰箱保存。材料無(wú)法立即處理時(shí)，應(yīng)置于70%酒精長(zhǎng)期保存。

2 試驗(yàn)方法

2.1 脫水-透明

將材料置于75%、85%、95%酒精中進(jìn)行脫水各1 h，100%酒精換兩次，每次1 h；取出材料置于體積比為2∶1、1∶1、1∶2 的酒精、二甲苯溶液中各1 h，然后轉(zhuǎn)入純二甲苯溶液中浸泡1 h。

2.2 浸蠟

浸蠟時(shí)，如遇石蠟?zāi)?，通常由于溫度太低?dǎo)致未達(dá)到浸蠟效果；如遇材料收縮，則由于溫度過(guò)高所致，甚至導(dǎo)致無(wú)法切片。經(jīng)脫水-透明后的花芽放入體積比1∶1石蠟、二甲苯中45℃過(guò)夜，第二天升溫至50℃，4 h后升溫至60℃，4 h后將溶液換成純石蠟液過(guò)夜，第三天再次更換純石蠟液并升溫至61℃，4 h 后升溫至62℃過(guò)夜，第四天可進(jìn)行包埋處理。

2.3 包埋

將熔化后的石蠟倒入紙盒內(nèi)，倒入的量為滿盒，同時(shí)，鑷子需通過(guò)酒精燈燒熱，并立即放入盒內(nèi)，按需要的切面調(diào)整材料的朝向和位置，材料之間留有一定的間隙，便于后續(xù)操作。利用包埋機(jī)4℃平臺(tái)降溫凝固。

2.4 粘塊、修塊

粘塊：將包埋好的蠟條根據(jù)材料位置分割成小塊，用刀片稍加修整成正方形，準(zhǔn)備木塊并放少量蠟液，刀片通過(guò)酒精燈加熱，用刀片將木塊上的蠟液磨平，也便于固定小木塊和蠟塊。

修塊：修塊是減少切片褶皺、保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵步驟，需將花芽的位置修整清晰，修去蠟塊切面的石蠟。明確花芽位置后將左右兩側(cè)的石蠟修平整。通過(guò)修整位于組織塊的上下邊緣石蠟，使切片呈帶狀且平整。

2.5 切片-黏片

黏片劑需提前制備，過(guò)濾后的蛋清液作為溶液甲存放于5℃冰箱保存，溶液乙為無(wú)菌水。展片臺(tái)溫度設(shè)置為45℃。提前用棉布和酒精擦干凈載玻片，在展片臺(tái)上平放備用。

按照切片的角度，將木塊固定在切片機(jī)上，通過(guò)勻速操作，使得切片呈帶狀，在載玻片上滴1滴溶液甲，抹勻后再滴1～2 滴溶液乙，使用鑷子將切片帶平鋪在載玻片上。在展片臺(tái)上平放載玻片，烘干后即可進(jìn)行下一步操作。

2.6 脫蠟-染色

載玻片置于純二甲苯Ⅰ（脫蠟1 h）→純二甲苯Ⅱ（脫蠟1 h）→純二甲苯Ⅲ（脫蠟1 h）→純二甲苯Ⅳ（脫蠟1 h）→體積比1∶1 酒精、二甲苯溶液（15 min）→100%酒精（15 min）→95%酒精（15 min）→85%酒精（15 min）→75%酒精（15 min）→1%番紅染色（大于4 h 或過(guò)夜）→75% 酒精（10 min）→85% 酒精（10 min）→95% 酒 精（10 min）→0.5% 固 綠 染 色（10 s）→100% 酒 精Ⅰ（20 min）→100% 酒 精Ⅱ（20 min）→體積比1∶1 酒精、二甲苯溶液（20 min）→純二甲苯Ⅴ（20 min）→純二甲苯Ⅵ（20 min）。

2.7 封片

傾斜拿住載玻片，用滴管取中性樹(shù)膠1～2 滴于載玻片上，取蓋玻片從載玻片底部自下而上覆蓋，利用通風(fēng)櫥初步吹干，1天后轉(zhuǎn)入烘箱43℃烘干。

在數(shù)碼顯微照相裝置（DP73型號(hào)，OLYMPUS 公司）下觀察并照相。

3 結(jié)果與分析

3.1 花的形態(tài)特征

鴿子蘭的花序由假球莖的基底部伸出，花梗較高，可達(dá)100 cm 以上，花朵可達(dá)10 朵?；ㄐ?yàn)槁菪蜔o(wú)限花序，開(kāi)花自下而上，單花的花徑約4～5 cm，花白色，肉質(zhì)，杯狀，散發(fā)出幽香。鴿子蘭因其花朵內(nèi)的唇瓣與蕊柱看似一只停坐的鴿子而得名［9］，每年7～8月為盛花期。

3.2 花器官形態(tài)分化過(guò)程

觀察切片可得，花朵形態(tài)可觀察到的鴿子蘭花器官分化過(guò)程大致分為萼片原基分化期、花瓣原基分化期、和蕊柱分化期。

3.2.1 萼片原基分化期

小花原基膨大且寬，頂部凹陷，從邊緣分化出的突起為萼片原基，從橫切面上可以看到兩個(gè)突起的萼片原基，且不斷伸長(zhǎng)發(fā)育出兩個(gè)萼片（圖1）。圖1中SE為花萼原基。

圖1 萼片原基分化期Fig.1 Sepal primordium differentiation phase

3.2.2 花瓣原基分化期

萼片原基內(nèi)側(cè)的小花原基產(chǎn)生變化，寬而平，頂部?jī)?nèi)凹，形成“V”字形缺口，舌狀凸起是唇瓣原基（圖2）。圖2中SE為花萼原基，PE為花瓣原基。

圖2 花瓣原基分化期Fig.2 Petal primordium differentiation phase

3.2.3 和蕊柱分化期

和蕊柱原基是花瓣原基在持續(xù)變長(zhǎng)時(shí)，和蕊柱原基分化時(shí)，內(nèi)側(cè)分化出的新突起，頂端膨大成橢圓形，并分化形成花粉囊，在和蕊柱基部?jī)?nèi)出現(xiàn)凹陷，發(fā)育為蕊喙，此時(shí)，和蕊柱分化期出現(xiàn)（圖3，圖4）。圖3與圖4中SE 為花萼原基，PE 為花瓣原基，L為唇瓣，CO為和蕊柱原基。

圖3 和蕊柱原基分化期（Ⅰ）Fig.3 Column primordium differentiation phase（Ⅰ）

圖4 和蕊柱原基分化期（Ⅱ）Fig.4 Column primordium differentiation phase（Ⅱ）

3.3 討論

根據(jù)石蠟切片結(jié)果所示，花序原基分化和花蕾原基分化期在采樣時(shí)已完成，可見(jiàn)當(dāng)花序出現(xiàn)時(shí)，鴿子蘭已完成這兩個(gè)時(shí)期。推測(cè)在花芽明顯可分辨，即最初采樣約2 cm 樣本（圖5）前，此時(shí)可通過(guò)剝除外苞片用顯微鏡辨別花序（圖6）。

圖5 鴿子蘭的花芽Fig.5 Bud of P.elata

圖6 鴿子蘭的花序Fig.6 Inflorescence of P.elata

鴿子蘭在花芽分化之前過(guò)渡到生殖生長(zhǎng)的這一轉(zhuǎn)化過(guò)程中，其頂端分生組織的形態(tài)顯著變化。隨著生殖生長(zhǎng)的開(kāi)始，花序原基逐漸延伸成圓錐形，其過(guò)程類似于紅球姜花芽的分化［10］。

從切片展現(xiàn)的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，若需觀察花序原基分化和花蕾原基分化期前的分化狀態(tài)，應(yīng)更早采樣，即于肉眼無(wú)法分辨葉芽、花芽時(shí)采樣。在處理花芽材料時(shí)，可適當(dāng)留有苞片，作為休眠期、萌動(dòng)期、花芽分化前期［11］的參照物。