杜少波，張 勐，陳曉文，董志強(qiáng)，謝惠春*

（1.青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海西寧810008；2.青海省青藏高原藥用動植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810008）

獨(dú)一味系唇形科獨(dú)一味屬多年生草本植物獨(dú)一味［Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo］的干燥根莖或全草，廣泛分布于青海、西藏、云南、甘肅等海拔3 000 m 以上的石質(zhì)高山草甸或強(qiáng)度風(fēng)化的碎石灘上［1-2］，其干燥后表面呈枯黃色，性甘味苦，歸肝經(jīng)，是青藏高原重要的大宗藏藥和常用草藥［3］，具有抗菌、抗腫瘤、止血化瘀、鎮(zhèn)痛消炎以及增強(qiáng)免疫等功效［4-5］。早在20 世紀(jì)80 年代，對獨(dú)一味成分的研究就已經(jīng)開展［6］，其中環(huán)烯醚萜類化合物、黃酮類化合物、苯乙醇苷類化合物被認(rèn)為是其主要存在的成分，也是主要發(fā)揮藥效作用的成分和特征性成分［3，7］。但是目前針對其化學(xué)研究主要集中在傳統(tǒng)的化學(xué)成分分離與鑒定上，具有操作復(fù)雜，周期性長等顯著缺點(diǎn)［8-9］，而且多數(shù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道年限久遠(yuǎn)，缺乏全面性和創(chuàng)新性。

為了進(jìn)一步闡明獨(dú)一味藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)［10-11］對其成分進(jìn)行了全面的分析與鑒定，進(jìn)一步完善了其化學(xué)成分的構(gòu)成，為其質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了參考和科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器

Xevo G2-XS QTof 液質(zhì)聯(lián)用儀、ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱（美國Waters 公司）；Secura513-1CN 精密天平（德國Sartorius公司）；KQ3200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；R-220SE 大型濃縮系統(tǒng)（瑞士Buchi 公司）；Eyela FDU-2110 型冷凍干燥機(jī)（日本EYELA 東京理化器械株式會社）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）；5810R 臺式高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf Centrifuge公司）。

1.2 試劑與樣品

1.2.1 試劑

甲醇、異丙醇（色譜級LC，德國Merck 公司）；乙腈、甲酸（質(zhì)譜級LC/MS，德國Merck 公司）；氫氧化鈉（ACS 級，ACS reagent≥97%，美國Sigma 公司）；亮氨酸腦啡肽（Standards Kit for Tof G2-S，美國Waters公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；超純水由Milli-Q 超純水儀制備；其它試劑均為分析純。

1.2.2 對照品

咖啡酸（CAS：331-39-5）；芹菜素（CAS：520-36-5）；木犀草素（CAS：491-70-3）；綠原酸（CAS：327-97-9）；馬錢苷（CAS：18524-94-2）；山梔苷甲酯（CAS：64421-28-9）；胡麻屬苷（CAS：117479-87-5）；木犀草苷（CAS：5373-11-5）；8-O-乙酰山梔苷甲酯（CAS：57420-46-9）；毛蕊花糖苷（CAS：61276-17-3）；異毛蕊花苷（CAS：61303-13-7）；連翹酯苷B（CAS：81525-13-5）；所有對照品純度均≥98%，購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 供試樣品

獨(dú)一味樣品采自青海省瑪沁縣（經(jīng)度100°8′23″，緯度33°24′47″，海拔4 156 m），由青海省藥用動植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任陳志教授鑒定為獨(dú)一味。樣品進(jìn)行自然風(fēng)干，粉碎過篩（50 目篩）分裝后，在-20℃冰箱中冷凍保存。

2 方法

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.01%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫，程序設(shè)置見表1。柱溫40℃，體積流量0.3 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

2.1.2 質(zhì)譜方法

電噴霧離子源（ESI）在負(fù)離子條件下，Continuum 模式，采集MSE數(shù)據(jù)。校正液為200 pg/μL 亮氨酸腦啡肽，0.5 mmol 甲酸鈉。掃描范圍m/z50~1 200，掃描時(shí)間0.2 s，檢測時(shí)間20 min。低能量碰撞電壓（CE）6 V，高能量碰撞電壓為20~60 V；負(fù)離子模式的毛細(xì)管電壓為2.0 kV，錐孔電壓為60 V，離子源溫度為100℃，輔助噴霧電離與去溶劑氣體為高純度氮?dú)?，去溶劑化溫?50℃，錐孔氣體流量50 L/hr，去溶劑化氣體流量600 L/hr。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的配制

分別取咖啡酸、芹菜素、木犀草素、綠原酸等12種對照品適量置于量瓶中，加甲醇溶解，配置成濃度為0.25 mg/mL 溶液，上機(jī)前依據(jù)化合物的溶解情況，用適量75%乙腈稀釋后，冷凍離心10 min（12 000 r/min，10℃），離心管取出后輕放，取上清液，分別存儲到2 mL的透明樣品瓶中。

2.2.2 供試樣品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取獨(dú)一味提取物粉末0.1 g，置于具塞玻璃試管，加入6 mL 色譜甲醇浸沒，50℃水浴，超聲提取1 h，搖勻后靜置5 min。取提取液上清200 μL，HLB 固相萃取柱吸附，依次用0.5 mL 純甲醇和0.5 mL75%乙腈洗脫，收集洗脫液混合，標(biāo)記為DYW，經(jīng)冷凍離心10 min 后（12 000 r/min，10℃），取上清裝入2 mL透明樣品瓶，即得供試樣品溶液。

2.3 數(shù)據(jù)采集與處理

數(shù)據(jù)工作站為Masslynx 4.1 軟件，通過提取MS質(zhì)譜圖和相關(guān)碎片信息，基于其內(nèi)置的質(zhì)譜分析平臺，包括ChemSpider 在線數(shù)據(jù)庫（PubMed、Pub-Chem、MassBank 等）和中藥數(shù)據(jù)庫（TCM Chiese［UNIFI1.7］），結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和Scifinder 數(shù)據(jù)進(jìn)行成分判別分析。

3 結(jié)果

檢測獨(dú)一味供試樣品，得到獨(dú)一味負(fù)離子模式下總離子色譜圖（Total ions chromatograph，TIC）如圖1 所示?？Х人帷⑶鄄怂?、木犀草素、綠原酸等12 個(gè)對照品負(fù)離子模式下總離子色譜圖如圖2所示。根據(jù)精確質(zhì)荷比，二級碎片離子信息，結(jié)合對照品和文獻(xiàn)信息，共鑒定推測出65 個(gè)化合物，其中23 個(gè)屬于苯乙醇苷類化合物，17 個(gè)屬于環(huán)烯醚萜類化合物，15 個(gè)屬于黃酮類化合物，10 個(gè)屬于其他種類化合物，12 個(gè)化合物經(jīng)對照品比對確認(rèn)；其中肉蓯蓉苷D、京尼平苷、5-甲基帚木糖苷、烏蘇酸等22 個(gè)化合物首次在該屬得到鑒定，結(jié)果如表2所示，22個(gè)首次鑒定化合物結(jié)構(gòu)式如圖3所示。

圖3 22個(gè)首次在該屬鑒定的化合物結(jié)構(gòu)式Fig.3 Structural formulas of 22 compounds identified for the first time in this genus

表2 獨(dú)一味的UPLC-Q-TOF-MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)Tab.2 The mass spectrometry data of L.rotata

圖1 獨(dú)一味負(fù)離子模式TIC圖Fig.1 The TIC of L.rotata under negative ion mode

圖2 對照品負(fù)離子模式TIC圖Fig.2 The TIC of standards under negative ion mode

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

3.1 環(huán)烯醚萜類化合物

環(huán)烯醚萜類化合物的基本母核是環(huán)烯醚萜醇，具有環(huán)狀烯醚及半縮醛羥基。半縮醛羥基性質(zhì)活潑，故該類化合物多以苷類存在［12］，其在高能量狀態(tài)下，容易脫去母環(huán)上的功能基團(tuán)，丟失中性H2O、CO2、CH3OH、CH3COOH 和糖基部分［13］。以化合物23 為例，其準(zhǔn)離子峰為m/z493［M+COOH］-，推斷其分子式為C19H28O12，在裂解過程中，首先脫去一分子葡萄糖形成m/z285［M-H-GLc］-的特征性碎片離子，再脫去一分子乙酸和一分子水形成m/z207［M-H-GLc-CH3COOH-H2O］-碎片離子，進(jìn)一步脫去一分子甲醇形成m/z175［M-H-GLc-CH3COOH-H2O-CH3OH］-的特征碎片離子，通過查閱文獻(xiàn)［14］和與對照品比對，確定化合物23 為8-O-乙酰山梔苷甲酯，其二級質(zhì)譜圖和裂解途徑如圖4和圖5 所示。

圖4 8-O-乙酰山梔苷甲酯的二級質(zhì)譜圖Fig.4 MS spectrum of 8-O-Acetyl shanzhiside methylester

圖5 8-O-乙酰山梔苷甲酯的裂解途徑Fig.5 The cleavage pathway of 8-O-Acetyl shanzhiside methylester

3.2 苯乙醇苷類化合物

苯乙醇苷類化合物通常是由苯乙醇苷元、糖、咖啡?；M成的，所以在質(zhì)譜的鑒定中經(jīng)常會存在［M-H-Caffeoy］-和［M-H-GLc］-的特征性碎片離子［15］。以化合物30為例，其準(zhǔn)離子峰為m/z623［MH］-，推斷其分子式為C29H36O15，在裂解過程中，首先脫去一分子咖啡?；纬蒻/z461［M-H-Caffeoy］-的特征性碎片離子，再通過脫一分子鼠李糖形成m/z315［M-H-caffeoy-C6H10O4］-的特征性碎片離子，再脫去一分子糖基和-分子水形成m/z135［M-HCaffeoy-C6H10O4-GLc-H2O］-的特征性碎片離子，通過查閱文獻(xiàn)［16］和與對照品比對，確定化合物30為毛蕊花糖苷，其二級質(zhì)譜圖和裂解途徑如圖6 和圖7所示。

圖6 毛蕊花糖苷的二級質(zhì)譜圖Fig.6 MS spectrum of Acteoside

圖7 毛蕊花糖苷的裂解途徑Fig.7 The cleavage pathway of Acteoside

3.3 黃酮類化合物

黃酮類化合物主要由苷元和糖苷組成，發(fā)生裂解時(shí)主要脫去其糖基部分形成苷元結(jié)構(gòu)，然后苷元離子進(jìn)一步發(fā)生Retro Diels-Alder（RDA）裂解反應(yīng)或者脫羰基反應(yīng)［17］。以化合物29為例，其準(zhǔn)離子峰為m/z447［M-H］-，推斷分子式為C21H20O11，在裂解過程中，首先脫去糖基部分形成m/z285［M-H-Glc］-的特征碎片離子，進(jìn)一步發(fā)生RAD 裂解反應(yīng)產(chǎn)生m/z151［C7H5O4］-的特征碎片離子，再進(jìn)一步脫去一分子水形成m/z133［M-H-Glc-1，3A＋-H2O］-的特征性離子，通過查閱文獻(xiàn)［18］和與對照品比對，確定化合物29 為木犀草素-7-O-葡萄糖苷，其二級質(zhì)譜圖和裂解途徑如圖8和圖9所示。

圖8 木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷的二級質(zhì)譜圖Fig.8 MS spectrum of Luteolin-7-O-β-D-glucoside

圖9 木犀草素-7-O-葡萄糖苷的裂解途徑Fig.9 The cleavage pathway of Luteolin-7-O-β-D-glucoside

4 討論與結(jié)論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)對獨(dú)一味化學(xué)成分進(jìn)行了全面系統(tǒng)的分析，整體上明確了獨(dú)一味化學(xué)成分構(gòu)成，為獨(dú)一味藥理藥效研究提供了新的角度和方向，對深入挖掘分析其藥效物質(zhì)和闡明作用機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4.1 基于UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)對獨(dú)一味化學(xué)成分的分析鑒定

研究表明，中藥材的質(zhì)量及藥效作用主要是由其化學(xué)成分所決定的，而化學(xué)成分的構(gòu)成也揭示了中藥材藥效物質(zhì)的基礎(chǔ)，兩者是相輔相成，密不可分的［19］。本研究采用靈敏度高、選擇性高、穩(wěn)定性高、分辨率高、掃描范圍廣的UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)鑒定出獨(dú)一味成分的構(gòu)成主要包含環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類和黃酮類化合物，這與現(xiàn)有的研究結(jié)果一致［20］。本研究從3 種類型的化合物中首次鑒定了蓯蓉苷D、京尼平苷、5-甲基帚木糖苷、烏蘇酸等22 個(gè)化合物，其中新鑒定的化合物中屬于苯乙醇苷類化合物的最多。除了3種典型的化合物類型外，本研究還鑒定出羥基積雪草酸、6-姜酚、阿江欖仁酸、烏蘇酸、咖啡酸等10個(gè)其他類型的化合物，進(jìn)一步豐富了獨(dú)一味化學(xué)成分的構(gòu)成。

4.2 獨(dú)一味主要有效成分研究與探討

在過往對獨(dú)一味藥理藥效作用的研究報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，獨(dú)一味中環(huán)烯醚萜類化合物具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛和止血功效［21-23］，它可以通過抑制組織胺和Prostaglandin（PG）等相關(guān)炎癥因子的合成與釋放，從而達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛的作用［24］，也可以通過提高小鼠血漿中纖維蛋白的含量，縮短凝血酶的時(shí)間，達(dá)到止血的效果［25］，其中的8-O-乙酰山梔苷甲酯更是被認(rèn)為是環(huán)烯醚萜類化合物主要發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)［26-28］，這可能與其在獨(dú)一味中的含量較高有關(guān)，試驗(yàn)結(jié)果也證明了8-O-乙酰山梔苷甲酯確實(shí)在質(zhì)譜中具有較高響應(yīng)值。除此之外，試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)環(huán)烯醚萜類化合物中的馬錢苷酸和苯乙醇苷類化合物中的連翹酯苷B、毛蕊花糖苷也都具有較高的響應(yīng)值，此前有研究表明它們具有抗氧化、抗炎殺菌、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等多種生理活性［29-31］，說明它們可能和8-O-乙酰山梔苷甲酯一樣是獨(dú)一味中主要發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)，這些都有待進(jìn)一步的研究。綜上所述，在后期研究中可以針對3 種典型化合物類型分別進(jìn)行成分提取，比較它們之間的藥理藥效差異情況；也可以通過對單體化合物進(jìn)行分離提取鑒定，再結(jié)合藥理實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步闡述獨(dú)一味藥理藥效機(jī)制。