徐 廣，李品明，譚秋生，楊 毅，鄧才富*，楊永東，羅 舜

（1.重慶市藥物種植研究所中藥材生產(chǎn)質(zhì)量控制研究中心，重慶南川408435；2.重慶市道地藥材工程技術(shù)中心，重慶 南川408435）

天麻為蘭科植物天麻［Gastrodia elataBl.］的干燥塊莖，自古為名貴中藥材之一，《中國藥典》［1］記載：性甘、平，歸肝經(jīng)，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)的功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載天麻具有“治風(fēng)”和“補(bǔ)益”兩大功效?！侗静菥V目》記載天麻“補(bǔ)益上藥，天麻為第一，久服益氣力，能長陰肥健，增長壽命。消臃腫，下肢滿，寒疝下血”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，天麻具有多種藥理活性［2-4］，付亞軒等［5］通過對(duì)天麻抗抑郁作用藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其機(jī)制分析，發(fā)現(xiàn)天麻具有良好的抗抑郁作用；張志龍等［6］研究分析了天麻對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病具有很好療效；同時(shí)天麻還能防治精神病［7］。除傳統(tǒng)用藥之外，天麻在民間一直有不同形式的食用習(xí)慣。在2020 年1 月2 日，國家衛(wèi)健委、國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布文件，確定天麻為藥食同源物質(zhì)種類。由于野生資源的日漸減少，各地主要以人工栽培為主［8-9］。項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)在種質(zhì)篩選和挖掘過程中對(duì)不同產(chǎn)地的天麻商品開展了相關(guān)質(zhì)量分析，以期為天麻在食、藥研究和產(chǎn)品開發(fā)方面提供參考。

1 材料與儀器

l.1 樣品

采集的樣品詳細(xì)信息如表1所示。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

所有樣品均為項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)于2 月下旬至3 月中旬在九個(gè)天麻種植基地的天麻栽培品中采收，經(jīng)重慶市藥物種植研究所鄧才富研究員鑒定其基源均為蘭科植物天麻G.elataBl.。每組樣品選取2 500 g新鮮天麻的混合樣快速洗凈泥沙后，用YEN 50液體真空濃縮煎藥機(jī)蒸汽蒸制20 min，裝盤放入50℃烘箱干燥10 h 后取出切厚片2~4 mm，繼續(xù)50℃烘干，粉碎過篩放冰箱備用。

1.2 試劑及儀器

乙醇（分析純，重慶川東化工，批號(hào)20160601）；乙腈（色譜純，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)2013120101）；水（為現(xiàn)制超純水）；天麻素對(duì)照品、對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110807-201608、111970-201501）。

高效液相色譜儀（LC-20AT，島津）；電子天平（METTLER AL104，梅特勒-托利多）；電子天平（CPA225D，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Molecular標(biāo)準(zhǔn)智能型純水機(jī)（上海摩勒科學(xué)儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-1000DE，昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG，上海龍躍儀器有限公司）；箱式電阻爐（SX2-8-10，上海龍躍儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-8，上海汗諾儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總灰分和浸出物測定方法

按《中國藥典》（2020 年版）“天麻”標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下規(guī)定測定總灰分和浸出物含量。

2.2 指標(biāo)成分測定方法

2.2.1 色譜條件

按《中國藥典》（2020 年版）“天麻”標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下“含量測定”規(guī)定測定，乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97）為流動(dòng)相；檢測波長為220 nm，理論板數(shù)按天麻素峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取天麻的對(duì)照品天麻素和對(duì)羥基苯甲醇適量，用乙腈-水（3∶97）混合溶液配置成每l mL各含天麻素50 μg、對(duì)羥基苯甲醇25 μg 的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備

取天麻樣品（過三號(hào)篩）約2 g，精密稱量，置250 mL 具塞錐形瓶中，加入稀乙醇50 mL，密塞，稱重，超聲處理（功率400 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱重，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液10 mL，濃縮至近干無醇味，殘?jiān)右译?水（3∶97）混合溶液溶解，定容于25 mL 量瓶中，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.4 線性關(guān)系試驗(yàn)

取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品液稀釋1、2、4、8、16、32 倍，按2.2.1 項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，以峰面積為Y 值，進(jìn)樣量為X 值進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：天麻素：Y=320 878X-339 071，R2=0.950 7；對(duì)羥基苯甲醇：Y=1 107 752.9X-1 168 210.3，R2=0.951 1。

2.2.5 方法學(xué)考察

按照《中國藥典》方法學(xué)考察了儀器精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)，以天麻素和對(duì)羥基苯甲醇色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積為參數(shù)，RSD均小于3%。

2.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2010，Origin 8 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和相關(guān)圖表繪制，以中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行相關(guān)性分析，提取共有色譜峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1 進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（Principal component analysis，PCA）和正交校正的偏最小二乘分析（Orthogonal partral least squares，OPLS）。

2.4 結(jié)果與分析

2.4.1 不同產(chǎn)地天麻質(zhì)量分析

不同產(chǎn)地天麻樣品的質(zhì)量分析數(shù)據(jù)如表2 所示：分析9個(gè)不同產(chǎn)地人工栽培天麻的質(zhì)量，結(jié)果表明，總灰分最低值為2.01%，最高值為3.24%，遠(yuǎn)低于藥典規(guī)定的不超過4.5%標(biāo)準(zhǔn)，表明各地人工栽培環(huán)節(jié)對(duì)灰分的影響較??；浸出物最低值為20.33%，最高值為33.17%，其最低值都大大高于藥典規(guī)定的不低于15.0%的含量標(biāo)準(zhǔn)。藥典規(guī)定的雙指標(biāo)（天麻素和對(duì)羥基苯甲醇）的含量不低于0.25%，實(shí)驗(yàn)樣品的雙指標(biāo)成分含量之和均高于該規(guī)定。研究結(jié)果表明試驗(yàn)天麻樣品品質(zhì)好，但有差異性。

表2 不同產(chǎn)地天麻樣品質(zhì)量分析Tab.2 Quality analysis from different origins of G.elata Bl.

為了比較數(shù)據(jù)間的差異性，對(duì)表2 中指標(biāo)成分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行了變異系數(shù)分析，從9 個(gè)不同產(chǎn)地樣品的總灰分和浸出物變異系數(shù)都較小，表明產(chǎn)地間這兩個(gè)指標(biāo)的差異較小。9 個(gè)不同產(chǎn)地樣品的指標(biāo)成分天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的變異系數(shù)分別是浸出物變異系數(shù)的2.39 倍和2.97 倍，表明就檢測指標(biāo)而言，不同產(chǎn)地人工栽培天麻的品質(zhì)差異較大。

2.4.2 不同產(chǎn)地天麻樣品相似度分析

將9 批天麻樣品的HPLC 圖譜以*.cdf 格式導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2012A 版軟件，得到圖譜疊加圖譜，如圖1 所示。以S1 為圖譜作為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法、多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配產(chǎn)生8 個(gè)共有峰。同時(shí)采用對(duì)照品對(duì)其2 個(gè)共有峰進(jìn)行了指認(rèn)，峰7 為天麻素，峰8 為對(duì)羥基苯甲醇，如圖2 所示。計(jì)算不同產(chǎn)地天麻樣品之間的HPLC圖譜相似度，繪制相似度熱圖，如圖3所示。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的天麻相似度系數(shù)0.336~0.981，表明不同產(chǎn)地的人工種植天麻樣品的內(nèi)在質(zhì)量差異較大。

圖1 不同產(chǎn)地天麻樣品HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC Fingerprints of G.elata Bl.

圖2 天麻指紋圖譜（A）與對(duì)照品HPLC圖（B）Fig.2 Reference fingerprint（A）of G.elata Bl.and HPLC chromatogram（B）of reference substances

圖3 不同產(chǎn)地天麻樣品HPLC相似度熱圖Fig.3 Hot map of fingerprint similarty from G.elata Bl.

2.4.3 化學(xué)模式質(zhì)量特征分析

2.4.3.1 HCA分析

將不同產(chǎn)地天麻樣品的8個(gè)共有峰的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SICMA 14.1軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行HCA分析。通過HCA 分析得聚類樹狀圖，如圖4 所示，在歐式距離小于5 時(shí)，聚為四類，S2、S5、S8 和S9 聚為一類，S1和S6 聚為一類，S3 和S7 聚為一類，S4 單獨(dú)聚為一類。在歐式距離小于12 時(shí)，聚為兩類，S1 和S6 聚為一類，其他為一類。

圖4 不同產(chǎn)地天麻聚類分析樹狀圖Fig.4 Cluster analysis from different origins of G.elata Bl.

2.4.3.2 PCA分析

為了更直觀的闡明不同產(chǎn)地栽培天麻質(zhì)量特征的差異性，利用SICMA 14.1軟件對(duì)其共有峰數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA 分析，其得分圖可以提供可視化的天麻分類圖。模型參數(shù)R2X 為0.777，Q2為0.21，表明模型可靠，預(yù)測能力強(qiáng)，結(jié)果如圖5所示。

由圖5 可知，不同產(chǎn)地天麻樣品區(qū)分良好，S2、S5、S8 和S9 聚為一類，S1 和S6 聚為一類，S3 和S7 聚為一類，S4 單獨(dú)聚為一類。表明9 組不同產(chǎn)地天麻的質(zhì)量差異性大，同時(shí)也表明聚類分析的可靠性。

圖5 PCA得分圖Fig.5 PCA score scatter plot

2.4.3.3 OPLS分析

為了更好地解釋樣品間差異，探尋樣品間貢獻(xiàn)率大的特征峰，對(duì)其共有峰峰面積進(jìn)行OPLS 分析得到散點(diǎn)圖（圖6）、VIP值圖（圖7）和載荷散點(diǎn)圖（圖8）。結(jié)果顯示，模型參數(shù)R2X = 0.818，R2Y = 0.322，Q2= 0.37。表明模擬擬合程度和預(yù)測能力較好，該模型能作為天麻質(zhì)量特征的HPLC 模式識(shí)別方法。由圖6可知，樣品的數(shù)據(jù)點(diǎn)均落在95%置信區(qū)間內(nèi)，說明各個(gè)天麻樣品的化學(xué)成分相似，但分散區(qū)域較大，說明各個(gè)天麻樣品在整體質(zhì)量上存在較大的差異。由圖7篩選出能引起不同天麻樣品成分差異的主要標(biāo)記性成分（VIP ＞1 且誤差條范圍在X ＞0 以上的成分），從圖7 中，滿足VIP 值要求的成分有3個(gè)，強(qiáng)弱依次為峰7、峰5和峰8，其中峰7為天麻素，峰8 為對(duì)羥基苯甲醇。同時(shí)在圖8 中也顯示這三個(gè)化合物的變量離原點(diǎn)的距離較遠(yuǎn)，說明這三個(gè)成分是不同天麻間差異性的主要標(biāo)記物。

圖6 OPLS得分圖Fig.6 OPLS score scatter plot

圖7 VIP值圖Fig.7 VIP score

圖8 載荷散點(diǎn)圖Fig.8 Loading scatter plot

3 討論

本次樣品采集依托于種質(zhì)資源收集引進(jìn)，在天麻產(chǎn)地上樣本量偏小，且只在一個(gè)地方采集了一個(gè)基地的混合樣品，試驗(yàn)的總體豐富度上有所欠缺。但從數(shù)據(jù)結(jié)果來看，天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量變異系數(shù)較大，表明以指標(biāo)成分考察的話，不同地區(qū)之間天麻在具體內(nèi)含物之間差異較大。通過指紋圖譜相似度和化學(xué)模式分析，不同產(chǎn)地的天麻相似度系數(shù)0.336~0.981之間，聚為兩大類，三小類；共有峰的峰7、峰5 和峰8 為不同樣品間成分差異的主要標(biāo)記物。基于指紋圖譜相似度和化學(xué)模式分析能為天麻的產(chǎn)地識(shí)別提供一定程度的技術(shù)支持。

中藥材質(zhì)量受地域環(huán)境、種植技術(shù)和管理水平的影響較大，隨著種植技術(shù)的突破和大健康產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，天麻的種植區(qū)域不斷擴(kuò)大，包括了全國大部分地區(qū)。本研究中樣品來源涵蓋了西南、西北、華中幾大區(qū)域的部分傳統(tǒng)天麻產(chǎn)區(qū)。從分析結(jié)果來看，同處西南地區(qū)的南川、江油、青川和彝良四個(gè)產(chǎn)區(qū)，天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的總含量整體上較高，同時(shí)在四個(gè)產(chǎn)區(qū)收集的天麻樣品的生長海拔均在1 000 m 以上，海拔高度是否影響了天麻內(nèi)含物的有效積累［10］，項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)將在種質(zhì)研究的基礎(chǔ)上開展不同海拔梯度條件下人工栽培天麻的最適區(qū)域栽培研究，為優(yōu)質(zhì)天麻的高效栽培提供技術(shù)支撐。