傅春燕，廖雅芳，陳 宇，劉永輝，曾 立，彭 玲，王 楊

（1.邵陽(yáng)學(xué)院藥學(xué)院，湖南邵陽(yáng)422000；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，湖南長(zhǎng)沙410008）

顱腦損傷（Traumatic brain injury，TBI）是一種常見(jiàn)的神經(jīng)外科損傷，伴有血腦屏障破壞、腦水腫形成、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等病理癥狀［1］。在我國(guó)，TBI患者的人數(shù)在逐年增加，其死亡率和致殘率居各類創(chuàng)傷首位［2］。目前治療TBI 方法主要有手術(shù)治療和藥物治療，活血化瘀類中藥治療方法被證明能降低患病率、提高存活率［3］。血府逐瘀湯具有活血化瘀作用，由地黃、當(dāng)歸、赤芍、牛膝、枳殼、桃仁、紅花、甘草、桔梗、川芎及柴胡組成。研究表明，血府逐瘀湯具有調(diào)節(jié)血脂代謝、改善動(dòng)脈粥樣硬化、舒張血管、增加血流量等作用［4］，臨床上已用于TBI治療［5］。但其成分復(fù)雜，治療TBI 的有效成分與作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)建立“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”的相互作用網(wǎng)絡(luò)，從基因?qū)用娼馕黾膊〉牟±磉^(guò)程，挖掘網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)來(lái)闡釋藥物作用，揭示多分子藥物協(xié)同作用的機(jī)制［6］。近年來(lái)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已成功應(yīng)用于中藥作用機(jī)制的闡釋［7］。

本課題組已對(duì)血府逐瘀湯的化學(xué)成分進(jìn)行了研究［8］，并對(duì)其治療TBI進(jìn)行了藥代動(dòng)力學(xué)［9］與代謝組學(xué)研究［10］，但是其治療TBI 的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用靶點(diǎn)還不明確。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論，構(gòu)建活性成分與藥物靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，篩選出血府逐瘀湯治療TBI 的有效成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過(guò)KEGG、GO 富集分析以及分子對(duì)接驗(yàn)證探究血府逐瘀湯治療TBI 的分子作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究血府逐瘀湯提供理論基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 血府逐瘀湯活性成分篩選

數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP（http：//tcmsp.com/tcmsp.php）提供了中藥化學(xué)成分在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄特性［11］，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、腸上皮通透性（Intestinal epithelial permeability，Caco-2）＞0.4 和類藥性（Drug like，DL）≥0.18（Drugbank中的平均值）篩選血府逐瘀湯活性成分。

1.2 活性成分藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

活性成分的靶點(diǎn)信息由TCMSP 檢索而得。TCMSP整合了HIT數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//lifecenter.sgst.cn/hit/）（獲得實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的藥物的靶點(diǎn)）和SysDT 模型（用于預(yù)測(cè)沒(méi)有被驗(yàn)證的化合物的潛在靶點(diǎn)）的信息，數(shù)據(jù)涵蓋面廣［11］。通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//stringdb.org/），輸入藥物靶點(diǎn)名稱并選擇“Homo sapiens”物種，將藥物靶點(diǎn)校正為正式名稱。

1.3 TBI相關(guān)靶點(diǎn)和潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

Genecards（http：//www.genecards.org）、OMIM（http：//omim.org/）和DisGeNET（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET）數(shù)據(jù)庫(kù)用來(lái)檢索與疾病TBI相關(guān)的基因，通過(guò)關(guān)鍵詞“craniocerebral injury”和“traumatic brain injury”搜索得到TBI疾病靶點(diǎn)信息，利用Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）獲得TBI 疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)交集，即潛在治療靶點(diǎn)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)的獲取

數(shù)據(jù)庫(kù)STRING 對(duì)靶點(diǎn)間相互作用具有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和預(yù)測(cè)功能［12］，可獲取蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作（Protein-protein interaction，PPI）數(shù)據(jù)。本研究用來(lái)預(yù)測(cè)“Homo sapiens”物種的蛋白質(zhì)之間關(guān)系，設(shè)置條件為置信度得分（Confidence score）＞0.9。

1.5 網(wǎng)絡(luò)建設(shè)與分析

（1）采用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，采用“Network analyzer”功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，?jì)算節(jié)點(diǎn)中心度（Degree）和介數(shù)中心性值（Betweenness），以Degree ＞20為條件篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)。

（2）利用血府逐瘀湯的中藥、活性化合物及關(guān)鍵靶點(diǎn)的信息構(gòu)建“中藥-化合物-靶標(biāo)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，在Cytoscape 中進(jìn)行拓?fù)浞治?，獲得節(jié)點(diǎn)中心度和介數(shù)中心性值數(shù)據(jù)，進(jìn)而獲得血府逐瘀湯治療TBI 的有效成分。

1.6 富集分析

應(yīng)用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行富集分析，找出關(guān)鍵靶點(diǎn)參與調(diào)控血府逐瘀湯治療TBI 的途徑，篩選出KEGG 代謝通路和GO 生物過(guò)程通路，兩者均設(shè)閾值為P< 0.05 且FDR< 0.05的篩選條件。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

對(duì)篩選出的有效成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，使用PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）得到關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)，從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得有效成分3D結(jié)構(gòu)，采用AutoDock vina 軟件（http：//vina.scripps.edu/）對(duì)有效成分及其關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，計(jì)算結(jié)合能大小，將結(jié)合能最低的構(gòu)象用PyMol 軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 血府逐瘀湯活性化合物

共篩選出血府逐瘀湯中174 種活性成分，其中桃仁13 種、紅花21 種、當(dāng)歸2 種、生地黃9 種、赤芍20 種、川芎6 種、柴胡16 種、枳殼5 種、桔梗4 種、牛膝17種以及甘草86種。

2.2 TBI疾病靶點(diǎn)、藥物靶點(diǎn)及潛在靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到血府逐瘀湯活性成分127 種，所對(duì)應(yīng)的藥物靶點(diǎn)2 899 個(gè)，去除重復(fù)值得到256 個(gè)活性成分。檢索TBI 疾病靶點(diǎn)，去除重復(fù)值得到1 301 個(gè)。取藥物靶點(diǎn)和TBI 疾病靶點(diǎn)經(jīng)維恩分析，得140個(gè)潛在靶點(diǎn)，兩者關(guān)系如圖1。

圖1 藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)維恩圖Fig.1 Venn diagram of drug targets and disease targets

2.3 網(wǎng)絡(luò)分析

將STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建潛在靶點(diǎn)的PPI 數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape 軟件可視化（圖2），經(jīng)Network analyzer 分析得關(guān)鍵靶點(diǎn)10 個(gè)，其有關(guān)信息見(jiàn)表1。利用Cytoscape 軟件構(gòu)建“中藥-化合物-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（圖3），圖中共有113 個(gè)節(jié)點(diǎn)和330 條邊，充分說(shuō)明了血府逐瘀湯“多成分-多靶點(diǎn)”作用特點(diǎn)。由圖3 可知，有93 種活性化合物參與關(guān)鍵靶點(diǎn)的調(diào)控，經(jīng)拓?fù)浞治龅没衔锕?jié)點(diǎn)的Degree 平 均 值 為3.55，Betweenness 平 均 值 為0.003 77，其中11個(gè)活性成分刺芒柄花素、槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、黃芩素、柚皮素、川陳皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷甾醇和楊梅酮的Degree 和Betweenness 值均大于平均值（見(jiàn)表2），可推知這些成分為有效成分。血府逐瘀湯主要通過(guò)這11 種有效成分調(diào)控關(guān)鍵靶點(diǎn)，在治療TBI 時(shí)發(fā)揮重要作用。

表1 關(guān)鍵靶點(diǎn)Tab.1 Key targets

表2 關(guān)鍵靶點(diǎn)調(diào)控信息Tab.2 Key target regulation information

圖2 潛在靶點(diǎn)的PPI互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI interaction network of potential targets

圖3 中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)關(guān)系圖Fig.3 Relationship between traditional Chinese medicine-active components-key targets

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)富集分析

運(yùn)用DVIAD 數(shù)據(jù)庫(kù)將關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 注釋分析，以富集倍數(shù)（Fold enrichment）＞73為條件篩選出排名靠前的生物過(guò)程（Biological process）（圖4），主要有：血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的正調(diào)控，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子刺激的細(xì)胞反應(yīng)，NO 生物合成過(guò)程的正調(diào)控，凋亡過(guò)程中半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)控，脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路等。

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of key targets

KEGG 富集結(jié)果（圖5）顯示，與血府逐瘀湯治療TBI 的關(guān)鍵靶點(diǎn)相關(guān)的重要信號(hào)通路有：NOD 樣受體信號(hào)通路，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路，腫瘤壞死因子信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路等。

圖5 關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of key targets

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果

分子對(duì)接結(jié)合能是評(píng)價(jià)有效成分與其作用靶點(diǎn)形成穩(wěn)定構(gòu)象的重要指標(biāo)，一般地，結(jié)合能越低，構(gòu)象越穩(wěn)定。結(jié)合能小于-4.25 kJ/mol 表明有一定的結(jié)合活性，小于-5 kJ/mol 表明有較好結(jié)合活性，小于-7 kJ/mol 表明有較強(qiáng)結(jié)合活性［13］。本研究中的10 個(gè)有效成分與其靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果如表3，結(jié)果表明，有90%的成分與其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的結(jié)合能小于-5 kJ/mol，18%的成分的結(jié)合能小于-7 kJ/mol，進(jìn)一步證實(shí)了上述分析結(jié)果的可靠性。用PyMol軟件將結(jié)合能小于-7 kJ/mol 的結(jié)果可視化得到圖6，由圖可知，刺芒柄花素、異鼠李素、楊梅酮、柚皮素和β-谷甾醇與其關(guān)鍵靶點(diǎn)有較強(qiáng)的結(jié)合活性，它們通過(guò)氫鍵等分子間作用力形成較穩(wěn)定的構(gòu)象。其中刺芒柄花素通過(guò)活性位點(diǎn)附近的MET-42 和GLN-60-M兩個(gè)氨基酸以氫鍵結(jié)合到ESR1靶點(diǎn)；異鼠李素與活性位點(diǎn)附近的DG-18、DG-22、DG-23、DG-24 四個(gè)氨基酸結(jié)合到ESR1 靶點(diǎn)；楊梅酮與MET-42、DLN-60 兩個(gè)氨基酸結(jié)合到ESR1 靶點(diǎn)；柚皮素與DA-14、DA-26、DT-12、DG-11、DG-13 五個(gè)氨基酸結(jié)合到ESR1 靶點(diǎn)；β-谷甾醇與SER-559 氨基酸結(jié)合到JUN 靶點(diǎn)；刺芒柄花素與LEU-577、ARG541 兩個(gè)氨基酸結(jié)合到JUN 靶點(diǎn)；β-谷甾醇與LYS-546 氨基酸結(jié)合到HSP90AA1 靶點(diǎn)；異鼠李素與THR-106、LYS-165、VAL-83、YLS-79、LEU-86、VAL-34 六個(gè)氨基酸結(jié)合到MAPK14 靶點(diǎn)；楊梅酮與ARG-23、THR-91、GLN-3 三個(gè) 氨 基酸 結(jié) 合到MAPK14靶點(diǎn)。

圖6 結(jié)合能最低的有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接模式圖Fig.6 Molecular docking mode diagram with the lowest binding energy between pharmacodynamic ingredients and key targets

表3 有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 The validation results of molecular docking between pharmacodynamic components and key targets

續(xù)表

3 討論與結(jié)論

本研究構(gòu)建了血府逐瘀湯有效成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析與分子對(duì)接分析得到了血府逐瘀湯治療TBI的活性成分和作用靶點(diǎn)。其中刺芒柄花素、異鼠李素、楊梅酮、柚皮素、β-谷甾醇、漢黃芩素、黃芩素、木犀草素、川陳皮素、槲皮素等化學(xué)成分與炎癥反應(yīng)、血管新生、NO 合成以及細(xì)胞凋亡等作用機(jī)制相關(guān)，分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果表明刺芒柄花素、異鼠李素、楊梅酮、柚皮素、β-谷甾醇和ESR1、JUN、HSP90AA1、MAPK14 等關(guān)鍵靶點(diǎn)有很強(qiáng)的結(jié)合力，推測(cè)這些有效成分是通過(guò)作用于這些關(guān)鍵靶點(diǎn)，參與調(diào)節(jié)NOD樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路和TNF 信號(hào)通路而發(fā)揮治療TBI的作用。

IL6 是一種細(xì)胞因子，在神經(jīng)炎癥條件下，TBI患者腦組織中的IL6（白細(xì)胞介素-6）表達(dá)上調(diào)，腦脊液中的IL6 蛋白水平升高［14］。槲皮素、漢黃芩素和柚皮素都能抑制IL6 的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，改善TBI 繼發(fā)性損傷［14-16］。柚皮素能減輕腦水腫，防止血腦屏障被破壞，降低IL6 等炎性物質(zhì)表達(dá)［16］，還能通過(guò)VEGF 信號(hào)通路抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，減少炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管新生，減輕繼發(fā)性腦損傷［17］。木犀草素屬于黃酮類化合物，可通過(guò)作用腦缺血的關(guān)鍵靶點(diǎn)調(diào)控血管增殖與生成，調(diào)控促炎性因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，有利于抗腦缺血、保護(hù)腦損傷［18-19］。β-谷甾醇是一種潛在的天然藥物，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、調(diào)控細(xì)胞凋亡［20-21］等功能。刺芒柄花素通過(guò)上調(diào)抗氧化蛋白的表達(dá)，減少炎癥，增強(qiáng)受損大腦的抗氧化能力，對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷起神經(jīng)保護(hù)作用［22］。在TBI 亞急性期，黃芩素可通過(guò)抑制MAPK 和NF-κB信號(hào)通路，抑制促炎因子產(chǎn)生和MAPK 磷酸化，減少神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷，改善缺血再灌注誘導(dǎo)的腦損傷［23］。川陳皮素可通過(guò)調(diào)節(jié)缺血性腦損傷中Akt/mTOR 和TLR4/NF-kB 信號(hào)通路改善異丙酚誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用［24］。

血府逐瘀湯的活性成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)，其中關(guān)鍵靶點(diǎn)為TP53、JUN、AKT1、IL6、MAPK1、VEGFA、HSP90AA1、CXCL8、MAPK14、ESR1 等。這些靶點(diǎn)中，TP53 是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵靶點(diǎn)，腦損傷后TP53 水平顯著上升，抑制該靶點(diǎn)有利于改善腦損傷［25］。JUN 作為轉(zhuǎn)錄因子在神經(jīng)元凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用［26］，AKT1 可以阻止JUN 磷酸化，對(duì)缺血性腦損傷具有保護(hù)作用［27］。TBI 后腦灌注不足或缺血可誘導(dǎo)腦神經(jīng)元中PGHS-2 基因表達(dá)，該表達(dá)是由缺氧和葡萄糖剝奪協(xié)同誘導(dǎo)的，這種誘導(dǎo)由MAPK 家族的一個(gè)或多個(gè)成員介導(dǎo)［28］，MAPK14 還參與自噬調(diào)節(jié)過(guò)程，具有抗炎、減輕炎癥導(dǎo)致的神經(jīng)毒性作用［29］。VEGFA 能促進(jìn)血管新生，增強(qiáng)血管通透性，改善腦損傷后缺血狀態(tài)，是治療腦缺血的重要靶點(diǎn)［30］。HSP90AA1 的表達(dá)與雙相情感障礙有關(guān)，對(duì)TBI 患者其水平明顯增加［31］。由CXCL8 介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞向炎癥部位移動(dòng)，并干擾TBI預(yù)后，其表達(dá)水平的降低對(duì)神經(jīng)有保護(hù)作用［32］。ESR1 是與腦損傷后抑郁相關(guān)的靶點(diǎn)，其表達(dá)水平降低會(huì)使抑郁癥狀更加明顯［33］。

血府逐瘀湯治療TBI的機(jī)制與血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)、NO 生物合成以及細(xì)胞凋亡等生物過(guò)程相關(guān)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子具有高度特異性，能促進(jìn)血管生成，介導(dǎo)血管通透性增加，刺激內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞反應(yīng)，分泌腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子，對(duì)血-腦屏障完整性有一定的保護(hù)作用，能改善腦損傷后神經(jīng)功能［34］。血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移涉及血管新生、組織損傷修復(fù)等病理過(guò)程，TBI 后血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子顯著增多，血腦屏障通透性顯著增大，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)抑制因子可抑制這些改變，從而緩解繼發(fā)性腦損傷［35］。脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的誘因之一，其生理功反映在宿主細(xì)胞膜表面上的Toll 樣受體4（TLR4）［36］。脂多糖與TBI 患者損傷程度成正相關(guān)，它能阻斷炎癥細(xì)胞激活，通過(guò)脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng)對(duì)腦組織的損傷［37］。NO生物合成信號(hào)通路中，NO 作為臨床判斷TBI嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一，對(duì)腦損傷具有雙重作用，一方面，NO 作為神經(jīng)遞質(zhì)在腦損傷初期擴(kuò)張腦血管、改善血流量起保護(hù)作用；另一方面，NO 具有神經(jīng)毒性，會(huì)損傷腦細(xì)胞［38］。血府逐瘀湯通過(guò)促進(jìn)NO 合成酶（eNOS）的表達(dá)和活性，提高胞內(nèi)、外NO 水平，促進(jìn)血管新生而達(dá)到保護(hù)作用［39］。血府逐瘀湯通過(guò)半胱氨酸蛋白酶在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，它能抑制蛋白合成，下調(diào)半胱氨酸蛋白酶表達(dá)，明顯改善神經(jīng)功能，減輕繼發(fā)性腦損傷［40］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析有其局限性，譬如槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇等常見(jiàn)成分幾乎成了萬(wàn)能活性分子，這與它們本身具有的活性有關(guān)，當(dāng)然還需通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證和深入分析。本研究還存在一定局限性，第一，所用的數(shù)據(jù)庫(kù)是實(shí)時(shí)更新的，本研究結(jié)果只在現(xiàn)有程度上揭示血府逐瘀湯作用機(jī)制；第二，本研究只進(jìn)行了分子對(duì)接結(jié)果驗(yàn)證，還需要進(jìn)行體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，從多維度角度進(jìn)一步驗(yàn)證。研究血府逐瘀湯治療TBI的信號(hào)通路具有重要的臨床意義，除了體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證血藥效成分外，還可以選擇幾個(gè)重要的信號(hào)通路或幾個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行體內(nèi)外深入研究。