張宏龍，嚴(yán) 俊，2，3，4，5，李 汛，2，3，4，5

1蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000

2蘭州大學(xué)第一醫(yī)院普外科，蘭州 730000

3甘肅省生物治療與再生醫(yī)學(xué)重點實驗室，蘭州 730000

4蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤防治中心，蘭州 730000

5甘肅省肝膽胰外科研究所，蘭州 730000

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第六大常見的癌癥，在癌癥相關(guān)死因中排名第三，每年導(dǎo)致約75萬人死亡[1]。我國的乙型肝炎發(fā)病率很高，加之肝硬化、黃曲霉素感染、化學(xué)毒物的接觸等，使中國的HCC病例占到了全球的47%[2]。由于HCC患者就診時多處于晚期，給HCC的治療增加了巨大困難，預(yù)后常較差，所以積極探索HCC發(fā)生發(fā)展、診斷預(yù)后和治療的新策略至關(guān)重要。在過去10年中，表觀遺傳學(xué)修飾，尤其是啟動子甲基化在HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，微小RNA(microRNA，miRNA)的CpG島異常甲基化可以調(diào)節(jié)miRNA的表達，并影響其靶基因的表達和功能，進而控制腫瘤的生物學(xué)行為。下面將詳細闡述miRNA甲基化在HCC的發(fā)生、診斷、預(yù)后和臨床治療中的近期關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)，為肝癌的臨床治療提供新的思路。

miRNA甲基化概述

miRNA是一類包含約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，它們可以通過靶向互補特定的信使RNA(messenger RNA，mRNA)在基因表達的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而導(dǎo)致mRNA降解或翻譯過程抑制[3]。miRNA的成熟從初級miRNA(pri-miRNA)開始，然后由Drosha/DGCR8異二聚體在細胞核中加工產(chǎn)生前體miRNA(pre-miRNA)，隨后與Exportin 5及其催化伴侶Ran-GTP結(jié)合使其從細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中，被RNase Ⅲ型酶Dicer剪切成大約長22個核苷酸的成熟miRNA雙鏈體，最后被解旋酶解螺旋產(chǎn)生有功能的單鏈miRNA[4]。越來越多的研究表明，miRNA的異常表達與多種疾病有關(guān)，包括癌癥、炎癥和自身免疫性疾病，并且可以作為早期篩查、預(yù)后和治療的生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。

近年來，人們發(fā)現(xiàn)miRNA的表達受表觀遺傳的調(diào)控，如啟動子甲基化或組蛋白修飾，與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。值得注意的是，大約50%的miRNA基因都與其CpG島相關(guān)，這表明DNA甲基化在調(diào)節(jié)miRNA的表達中起著至關(guān)重要的作用[6]。異常的DNA甲基化可分為低甲基化和高甲基化，DNA低甲基化是指DNA甲基化的喪失，導(dǎo)致基因表達上調(diào)，相反，DNA高甲基化意味著先前未甲基化的位點獲得甲基化標(biāo)記，則導(dǎo)致穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄沉默和減少的基因表達[4]。就像編碼基因一樣，DNA甲基化也可以通過甲基化miRNA啟動子區(qū)域中的CpG島來抑制miRNA的轉(zhuǎn)錄，進而影響許多疾病的狀態(tài)[7]。

隨著對腫瘤的研究日益深入，miRNA基因出現(xiàn)在與癌癥相關(guān)的基因組區(qū)域中的現(xiàn)象屢見不鮮，并在其中扮演著癌基因與抑癌基因兩個相反的角色[8]。miRNA在受DNA異常甲基化調(diào)節(jié)的過程中，癌基因和抑癌基因通過DNA低甲基化和高甲基化而分別激活和沉默，進一步闡明了腫瘤細胞癌變的機制[9]。

miRNA甲基化與HCC的發(fā)生發(fā)展

近年來，人們發(fā)現(xiàn)miRNA甲基化參與到HCC的發(fā)病當(dāng)中。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和其他生物化學(xué)毒物通過使某些特定miRNA異常甲基化，促進HCC的發(fā)生。

miRNA甲基化參與HBV感染引起的HCC發(fā)生發(fā)展HBV感染引起的HCC病例占到了70%～80%，其中乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)起著至關(guān)重要的作用。HBx可以調(diào)節(jié)表觀遺傳分子(包括miRNA、甲基化、乙?；?的表達和活性，從而導(dǎo)致多種途徑和功能的紊亂[10]。

MiR- 132是由轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白從17號染色體的基因間區(qū)轉(zhuǎn)錄而來的，已被證明在HCC中下調(diào)[11]。為了研究miR- 132在HCC進展的功能屬性，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR- 132通過滅活A(yù)kt信號通路，特別是通過降低Akt磷酸化和細胞周期蛋白D1的濃度在HCC中發(fā)揮抑癌作用，并且與HCC中的HBx表達負(fù)相關(guān)。分析其原因可能是HBx與DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)結(jié)合，從而引起miR- 132啟動子的超甲基化使其表達沉默，最終導(dǎo)致HCC的發(fā)生和加速進展[12]。MiR- 205已被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中表達下調(diào)[13- 15]，同樣在HCC組織中，miR- 205直接靶向HBx，通過抑制HBx的表達在HCC組織中起著抑癌作用。進一步研究表明HBx能夠通過誘導(dǎo)miR- 205啟動子的超甲基化來抑制miR- 205，從而消除了miR- 205的腫瘤抑制作用，增強肝癌細胞的生長[16]。除此之外，也有研究報道，miR- 137通過靶向抑制Notch1的表達，減弱HBx-siRNA處理的MHCC97H細胞增殖[17]。Notch1已被證明通過調(diào)節(jié)E-鈣黏著蛋白而與HCC細胞中的血管生成和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化形成相關(guān)，進而促進HCC侵襲和復(fù)發(fā)[18-19]。而HBx可以通過誘導(dǎo)miR- 137的甲基化來下調(diào)miR- 137的表達，進而促進HCC的發(fā)生發(fā)展[17]。總的來說，HBx誘導(dǎo)的DNA甲基化導(dǎo)致miRNA表達的表觀遺傳抑制，為HBV介導(dǎo)的肝癌發(fā)生提供新的見解。

miRNA甲基化參與生物化學(xué)毒物引起HCC發(fā)生發(fā)展霉菌毒素是農(nóng)作物中一種常見的致癌物，成為撒哈拉以南非洲肝癌發(fā)病的主要危險因素[20]。霉變玉米所含的霉菌毒素污染物鐮刀菌酸(fusaric acid，F(xiàn)A)是一種對動植物均有毒性的真菌毒素[21]。為了探究表觀遺傳修飾是否在FA毒性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，有研究指出，F(xiàn)A通過降低DNMT1/3A/3B的表達并增加DNA甲基化結(jié)構(gòu)域2(methyl CpG binging domain protein 2，MBD2)的表達來誘導(dǎo)HepG2細胞中的整體DNA低甲基化，而整體DNA低甲基化則通過引起基因組不穩(wěn)定和增加突變頻率被認(rèn)為是癌癥的標(biāo)志[22]，從而認(rèn)為FA會導(dǎo)致包括肝癌在內(nèi)多種腫瘤的發(fā)生。進一步的結(jié)果表明，F(xiàn)A通過使miR- 29b啟動子區(qū)去甲基化進而上調(diào)HepG2細胞中miR- 29b的表達。而miR- 29b則可以直接靶向DNMT3A和DNMT3B，并通過抑制轉(zhuǎn)錄激活因子Sp1間接靶向DNMT1，從而下調(diào)DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表達，最終誘導(dǎo)整體DNA低甲基化改變，提供了FA誘導(dǎo)基因毒性和細胞毒性的表觀遺傳調(diào)控機制[23]。因此，miRNA甲基化可能作為一種新的機制參與FA誘導(dǎo)的整體DNA甲基化不足以促進肝癌發(fā)生。

除此之外，還有一些有機化學(xué)污染物會導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。三氯乙烯(trichlorethylene，TCE)是一種被廣泛用于工業(yè)的揮發(fā)性有機溶劑，并因污染空氣、土壤和水源而受到人們關(guān)注。MiR- 182- 5p是一種致癌的miRNA，可以在包括肝癌在內(nèi)的各種腫瘤中均過表達[24- 26]。研究表明，TCE暴露通過下調(diào)DNMT3A/3B導(dǎo)致miR- 182- 5p啟動子區(qū)域的甲基化不足，從而使其過表達上調(diào)。而miR- 182- 5p的上調(diào)又會反過來抑制Cited2(一種腫瘤抑制因子)，Cited2增強細胞增殖并因此促進TCE肝癌的發(fā)生[27]。呋喃是一種廣泛存在于烹飪食品中的重要化學(xué)污染物，國際癌癥研究機構(gòu)將其歸為可能的人類致癌物[28]。miR- 375已被鑒定為一種抑癌miRNA，在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤中下調(diào)[29]。研究顯示miR- 375在呋喃誘導(dǎo)肝癌發(fā)生中穩(wěn)定下調(diào)，并與miR- 375結(jié)合的組蛋白H3K9和H3K27的基因特異性胞嘧啶DNA高度甲基化有關(guān)[30]。總之，表觀遺傳修飾在多種致癌物致肝癌發(fā)生的過程中發(fā)揮重要作用，miRNA甲基化可能是其中重要的一方面，在預(yù)防肝癌發(fā)生中值得更深入研究。

miRNA甲基化與HCC的臨床診斷和預(yù)后

目前，甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)仍是最廣泛使用的肝癌血清生物標(biāo)志物，在肝癌的篩查、診斷和預(yù)后評估中起著重要作用。然而，由于其在早期肝癌臨床診斷的敏感性較低[31]，并且在慢性肝炎和肝硬化的血清中也常常升高[32- 33]，臨床應(yīng)用存在一定爭議。幸運的是，研究發(fā)現(xiàn)肝癌的miRNA甲基化生物標(biāo)志物可能有助于提高肝癌診斷和預(yù)后的準(zhǔn)確性。

miRNA高甲基化與HCC診斷和預(yù)后的關(guān)系大量研究表明，許多miRNA在肝癌發(fā)生過程中作為抑癌基因，并且高甲基化誘導(dǎo)的miRNA表觀遺傳沉默可能是HCC癌變的潛在機制，參與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和血管生成[34]。

MiR- 200家族由位于染色體1p36(miR- 200a、miR- 200b和miR- 429)和染色體12p13.3(miR- 200c和miR- 141)上的5個成員組成[35]。它們被認(rèn)為是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，導(dǎo)致腫瘤的侵襲和擴散，是原發(fā)性腫瘤向遠處轉(zhuǎn)移的重要一步[36]，并且CpG島的DNA甲基化是引起miR- 200家族失調(diào)的機制之一。有相關(guān)研究指出，miR- 200b被DNA甲基化部分沉默，并可以通過直接靶向HCC中的BMI1和ZEB1來抑制腫瘤生長和侵襲[37- 38]。其次，基于超甲基化的miR- 200b表達下調(diào)與HCC患者頻繁的復(fù)發(fā)(HR=2.49)和較高的死亡率(HR=2.76)顯著相關(guān)，并且在誘導(dǎo)和維持癌癥干細胞的腫瘤起始中發(fā)揮獨特作用[38]。再者，lncRNA GIHCG被證明在HCC中高表達，并且高GIHCG表達與HCC患者較差的生存期相關(guān)。進一步探討其機制，發(fā)現(xiàn)GIHCG表現(xiàn)出癌基因的作用是通過上調(diào)miR- 200b/a/429啟動子H3K27三甲基化和DNA甲基化水平，并最終抑制miR- 200b/a/429的表達來促進HCC細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[39]。總之，miR- 200 DNA甲基化直接或間接與HCC的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān)，并且介導(dǎo)癌癥干細胞干性調(diào)節(jié)是HCC干細胞臨床治療的潛在靶點。

除miR- 200家族之外，還有很多miRNA在HCC的發(fā)生發(fā)展中表現(xiàn)出相似的功能。MiR- 192啟動子高度甲基化可能使miR- 192- 5p的表達沉默，維持肝癌干細胞特性，激活可能允許的亞肝細胞群體獲得腫瘤起始能力，從而促進HCC的進展，導(dǎo)致HCC患者不良的預(yù)后[40]。MiR- 142在HCC中呈現(xiàn)出高甲基化狀態(tài)，用甲基化抑制劑5-氮雜胞苷(5-azacytidine，5-Aza)可以恢復(fù)miR- 142的表達，以靶向抑制TGF-β依賴性肝癌增殖，上間-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和促血管生成的能力，這也部分解釋了miR- 142 表達降低與HCC不良臨床結(jié)局相關(guān)的原因[41]。MiR- 639在肝癌細胞和組織中的表達水平均降低，這可以部分歸因于DNMT3A對miR- 639啟動子進行超甲基化，miR- 639的沉默減弱了其對MYST2和ZEB1的靶向抑制作用，增強了HCC細胞的增殖、遷移和侵襲[42]。另外，miR- 9、miR- 122、miR- 124、miR- 129、miR- 146等[43- 47]腫瘤抑制因子通過DNA高甲基化在HCC中均表達下調(diào)。miRNA甲基化與肝癌發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，目前研究多集中在細胞水平，仍需要大樣本臨床資料驗證DNA甲基化在HCC患者早期診斷和預(yù)后中的價值。

miRNA低甲基化與HCC診斷和預(yù)后的關(guān)系此外，在HCC組織和細胞中還可以檢測到DNA低甲基化誘導(dǎo)的多種miRNA過表達，它們充當(dāng)致癌基因促進HCC的發(fā)生發(fā)展，并作為生物標(biāo)志物參與肝癌的診斷和預(yù)后，還是肝癌治療的潛在靶點，具有重大意義。

已有研究報道，19號染色體miRNA簇(C19MC)含有59個成熟的miRNA，是HCC的關(guān)鍵致病因素[48- 49]。有學(xué)者對C19MC miRNA進行了Kaplan-Meier生存分析，發(fā)現(xiàn)miR- 512- 1、miR- 516a- 1和miR- 519a- 2水平與HCC患者的OS呈負(fù)相關(guān)；進一步的COX比例模型表明高表達的miR- 512- 1和miR- 516a- 1是影響HCC患者OS的獨立危險因素，HR分別為1.521和1.662；ROC曲線也顯示T分期聯(lián)合3-miRNA比單純T分期作為預(yù)后模型AUC值從0.728增加至0.76；并且這3種miRNA的啟動子區(qū)域表現(xiàn)出一致的低甲基化，提示與HCC預(yù)后相關(guān)的C19MC miRNA受啟動子區(qū)低甲基化調(diào)控而表達上調(diào)，從而有望成為HCC診斷和治療的潛在靶標(biāo)[50]。另外，DNA低甲基化誘導(dǎo)高水平的hsa-miR- 21- 5p與包括HCC在內(nèi)的6種腫瘤患者較差的OS相關(guān)(HR>1)，其中，在HCC患者中的HR為1.6，表明miR- 21低甲基化在HCC患者預(yù)后不良中的重要價值[51]。然而，人們對于miR- 429在HCC中的作用產(chǎn)生了不同的看法。有研究表示miR- 429通過直接靶向PTEN/PI3K/AKT/β-catenin軸來促進HCC細胞遷移和侵襲，并認(rèn)為其啟動子區(qū)域的甲基化不足是操縱HCC細胞遷移和侵襲的初始因素[52]。與上文所述的miR- 429在HCC組織和細胞中表達下調(diào)的觀點相反[39]，分析miR- 429可能在HCC發(fā)生發(fā)展的不同階段表現(xiàn)不同的作用。

綜上所述，不同的miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能承擔(dān)不同的角色，即使同一種miRNA也可能在不同腫瘤或腫瘤發(fā)生的不同階段發(fā)揮不同的作用。miRNA甲基化異?？赡苁怯绊懜伟┌l(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵信號，有助于肝癌的早期篩查、診斷和疾病預(yù)后。然而，miRNA甲基化生物標(biāo)志物僅限于實驗室研究階段，其特異性和敏感性尚待確認(rèn)。因此，迫切需要找到更多有價值的甲基化生物標(biāo)志物，以早期警示肝癌的發(fā)生和發(fā)展。

miRNA甲基化藥物與HCC治療

對于未發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移且肝功能良好的HCC患者，當(dāng)前臨床實踐指南建議手術(shù)切除。對于不可切除的HCC，多采用局部消融、肝動脈介入治療、精準(zhǔn)治療、系統(tǒng)治療和肝移植的綜合療法。作為HCC中重要的生物標(biāo)志物，啟動子DNA高甲基化可能被用作該疾病潛在脫甲基劑的靶標(biāo)[53]。miRNA在肝癌中的作用已進行大量研究，這使得miRNA甲基化生物標(biāo)志物成為可能的治療靶標(biāo)。由于大多改變miRNA甲基化狀態(tài)來治療HCC的臨床研究尚少，以下將重點介紹3種用于HCC治療的miRNA甲基化藥物。

樹突狀納米姜黃素姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的聯(lián)苯類化合物，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤的治療特性[54]。已經(jīng)確定姜黃素在誘導(dǎo)DNA甲基化中的巨大潛力，但是它的低生物利用度阻礙其臨床應(yīng)用，因此，樹突狀納米姜黃素(dendrosomal nanocurcumin，DNC)在無任何不良反應(yīng)的前提下，增加了姜黃素在癌細胞中的吸收，并可通過修飾失調(diào)的表觀遺傳機制來延緩HCC的進展，為進一步臨床治療奠定基礎(chǔ)[55- 56]。

DNC通過沉默HepG2和Huh7細胞系中的DNMT1/3A/3B來恢復(fù)miR- 34s的表達，進而降低Huh7和HepG2細胞的生存能力[56]。另外，依賴DNC的miR- 29a和miR- 185的過表達可以下調(diào)DNMT1/3A/3B的表達，并隨后通過DNA甲基化使HCC中MEG3的表達增加[57]。這些結(jié)果提示，DNC可以過表達miRNA來阻止肝癌進展。雖然研究中已報道DNMT表達下調(diào)，但并沒有直接指出miRNA的甲基化狀態(tài)，還需要更深入的研究將DNC與miRNA甲基化聯(lián)系起來，以明確DNC在臨床尤其是HCC治療中的應(yīng)用前景。

卡斯蒂霉素卡斯蒂霉素(casticin，CAS)是從葡萄果中提取的一種聚甲基黃酮，具有抗癌等多種藥理活性。已經(jīng)有研究表明，miR- 148a- 3p是一種抑制腫瘤的miRNA，可在包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤中表達沉默[58- 60]。并且miR- 148a- 3p與DNMT1之間的負(fù)向調(diào)控參與促進和維持HCC干性特征，而CAS則抑制DNMT1的活性，使miR- 148a- 3p去甲基化，通過使增強其表達，抑制HCC細胞干性特征[60]。因此，CAS可能是人類肝癌的一種輔助治療劑，還需要更深入的臨床研究進一步證實。

三氧化二砷三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)是一種古老的藥物，已被描述為可用于治療許多癌癥，尤其是在急性早幼粒細胞白血病的治療中，ATO可誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡[61- 63]。為了探索ATO在肝癌耐藥性中的表觀遺傳調(diào)控，有研究發(fā)現(xiàn)，ATO通過誘導(dǎo)DNA去甲基化激活了miR- 148a，從而通過靶向p65來降低NF-κB的表達并抑制CSC的表型，使HCC細胞對5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)和奧沙利鉑藥物敏感[64]。這一發(fā)現(xiàn)揭示了ATO在增強HCC對化療藥物敏感的新機制，有望成為HCC治療策略的潛在方法。

此外，還有研究報道，DNA甲基化調(diào)節(jié)的miR- 193a- 3p通過靶向抑制SRSF2表達來促使HCC對5-FU的耐藥[65]?？偟膩碚f，在肝癌治療期間，miRNA甲基化藥物可以降低全基因組或特定miRNA的甲基化水平，從而抑制肝癌細胞的生長。通過針對DNMT的活性和DNA甲基化模式的改變，來探索miRNA在HCC治療中的應(yīng)用已成為一種新策略。

小結(jié)與展望

在過去的十多年里，技術(shù)的進步使miRNA甲基化領(lǐng)域發(fā)生了革命性的變化，并在HCC中發(fā)現(xiàn)了許多表觀遺傳失調(diào)的miRNA，這些miRNA由CpG島超甲基化和低甲基化調(diào)控，所以miRNA基因的異常DNA甲基化可能在肝癌臨床應(yīng)用中發(fā)揮潛在的價值。本篇綜述提供了全面的證據(jù)，證明miRNA甲基化與HCC的發(fā)生發(fā)展、診斷預(yù)后、治療和耐藥密切相關(guān)(圖1)。然而，miRNA甲基化生物標(biāo)志物尚未應(yīng)用于臨床，許多可能改變miRNA甲基化狀態(tài)的藥物正在臨床試驗中，對HCC的表觀遺傳診斷和治療仍存在許多未來的挑戰(zhàn)。因此，了解表觀遺傳變化與HCC的因果關(guān)系，揭示特定甲基酶在HCC治療策略中的作用，對HCC相關(guān)的miRNA甲基化的詳細機制進行更深入的研究，并利用最新的技術(shù)將基因組學(xué)與靶向表觀遺傳重編程和表觀遺傳因子的直接操作結(jié)合起來，可以增強人們對miRNA甲基化在HCC中全新認(rèn)識，實現(xiàn)完全的臨床應(yīng)用。