杜園園，姜 雪，王文榮，湯絢麗，孫 玥

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院腎內(nèi)科 浙江省腎臟疾病防治技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310007

膜性腎病是一種自身免疫性疾病，是導(dǎo)致成人腎病綜合征的常見(jiàn)病因，按照發(fā)病原因可分為特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy，IMN)和繼發(fā)性膜性腎病(secondary membranous nephropathy，SMN)。Beck等[1- 2]鑒定出磷脂酶A2受體(phospholipase A2 receptor，PLA2R)是IMN的潛在靶抗原，約70%的IMN由PLA2R介導(dǎo)免疫反應(yīng)而致病。因此，有學(xué)者將這一類膜性腎病稱為PLA2R相關(guān)膜性腎病(PLA2R-associated membranous nephropathy，PLA2R-MN)[3]。Beck等[1]在發(fā)現(xiàn)PLA2R的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)從腎小球免疫復(fù)合物和血清中檢測(cè)到的抗體以IgG4為主，之后的多項(xiàng)研究[4- 6]也證實(shí)了這一點(diǎn)，在SMN、非免疫性腎小球疾病、自身免疫性疾病和正常人群中很少或未檢測(cè)到這種抗體[7]，提示IgG4與PLA2R-MN的發(fā)病密切相關(guān)。本研究比較PLA2R-MN患者腎穿刺時(shí)血清和尿液IgG4水平，并且隨訪PLA2R-MN患者治療1年后血、尿IgG4水平與疾病轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性，從而探討IgG4作為反映PLA2R-MN病情活動(dòng)和治療預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)的可能性。

對(duì)象和方法

對(duì)象選取2017年4月至2018年1月杭州市中醫(yī)院腎內(nèi)科經(jīng)腎活檢確診的PLA2R-MN 患者56例，SMN患者13例和IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)患者10例。PLA2R-MN患者腎組織PLA2R抗原檢測(cè)均為陽(yáng)性及排除SMN(包括腫瘤相關(guān)性膜性腎病、乙肝病毒相關(guān)性膜性腎病、狼瘡性膜性腎病、藥物及毒素相關(guān)性膜性腎病)，SMN腎組織PLA2R抗原檢測(cè)均為陰性(包括2例狼瘡性膜性腎病、2例干燥綜合征繼發(fā)膜性腎病、1例乙肝病毒相關(guān)性膜性腎病、8例原因未明的不典型膜性腎病等)，IgAN患者排除繼發(fā)性IgAN(包括過(guò)敏性紫癜性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、強(qiáng)直性脊柱炎、酒精性肝硬化和慢性肝病等疾病)。

一般實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)包括24 h尿蛋白定量、血清白蛋白、肝功能、腎功能、血糖、血脂、尿酸、抗可提取性抗原多肽抗體譜、抗核抗體、腫瘤標(biāo)志物(糖類抗原125、糖類抗原199、癌胚抗原等)及感染性疾病篩查。

腎組織標(biāo)本的采集和檢測(cè)所有患者在超聲實(shí)時(shí)引導(dǎo)下行經(jīng)皮腎穿刺活檢術(shù)，所取腎組織必須行免疫熒光、光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡檢查。

腎小球IgG4亞型檢測(cè)：采用異硫氰酸氟熒光素偶聯(lián)小鼠單克隆抗體，通過(guò)直接免疫熒光顯微鏡檢測(cè)腎小球IgG亞類沉積，免疫熒光染色強(qiáng)度從-到+++ (-陰性，+弱染色，++中染色，+++強(qiáng)染色)分級(jí)。

腎小球PLA2R表達(dá)：石蠟切片進(jìn)行PLA2R免疫染色，采用檸檬酸溶液和胃酶提取抗原，采用Elivision系統(tǒng)進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

電子顯微鏡檢查：根據(jù)Ehrenreich Churg分類法對(duì)膜性腎病的超微結(jié)構(gòu)結(jié)果進(jìn)行分期。

IgG和IgG4水平的檢測(cè)收集PLA2R-MN、SMN、IgAN患者腎活檢當(dāng)天，并且未曾接受激素或免疫抑制劑治療的血和尿標(biāo)本?？紤]到部分膜性腎病患者由于尿液中IgG排泄或免疫功能紊亂導(dǎo)致血IgG水平下降，隨機(jī)尿IgG4水平易受飲水量引起的尿液不同程度稀釋的影響，所有血清值用血IgG校正，所有尿值用尿肌酐校正。血IgG4/lgG由IgG4的濃度除以lgG的濃度獲得，IgG4/尿肌酐由IgG4的濃度除以尿肌酐的濃度獲得。

IgG4：具體操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行(試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供)。

IgG：采用散色比濁法，利用BN系統(tǒng)自動(dòng)完成血標(biāo)本IgG檢測(cè)。

治療評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)完全緩解：治療后24 h尿蛋白<0.3 g/L，血清白蛋白>40 g/L；部分緩解：治療后尿蛋白下降>50%，且每24 h尿蛋白為0.5～3.5 g，血清白蛋白>35 g/L；未緩解：治療后未達(dá)上述指標(biāo)。

隨訪所有患者均隨訪1年以上，收集患者腎穿刺1年后血、尿標(biāo)本，檢測(cè)血尿IgG4、IgG、尿肌酐。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件包，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(Q1，Q3)表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，多組等級(jí)變量之間的比較采用Kruskal WallisD檢驗(yàn)，兩組等級(jí)變量之間的檢驗(yàn)采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。相關(guān)系數(shù)采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一般情況56例PLA2R-MN患者中，32例表現(xiàn)為腎病綜合征或腎病范圍蛋白尿，24例表現(xiàn)為非腎病水平蛋白尿；5例表現(xiàn)為腎功能不全(估算腎小球?yàn)V過(guò)率<60 ml/min)，51例腎功能正常；37例血清白蛋白<30 g/L，19例血清白蛋白≥30 g/L；21例病理表現(xiàn)為Ⅰ期膜性腎病，29例為Ⅱ期膜性腎病，6例為Ⅲ期膜性腎病。13例SMN患者中，4例表現(xiàn)為腎病綜合征或腎病范圍蛋白尿，9例表現(xiàn)為非腎病水平蛋白尿。10例IgAN患者均表現(xiàn)為非腎病水平蛋白尿。與PLA2R-MN患者相比，SMN患者的性別比例、年齡、尿蛋白定量、血清白蛋白及血肌酐水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；IgAN患者的年齡、尿蛋白定量均明顯下降(P<0.001，P=0.021)，血清白蛋白及血肌酐水平均明顯升高(P<0.001，P=0.017)。與SMN患者相比，IgAN患者的年齡明顯降低(P=0.005)，血清白蛋白水平明顯升高(P<0.001)(表1)。

血IgG4/IgG和尿IgG4/尿肌酐PLA2R-MN患者血IgG4/IgG比值均顯著高于SMN及IgAN患者(P=0.009，P<0.001)，尿IgG4/尿肌酐均顯著高于SMN患者(P=0.008)(表2)。

PLA2R-MN中尿蛋白≥3.5 g/24 h患者血清IgG4/IgG比值有高于尿蛋白<3.5 g/24 h者的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.059)。腎功能不全組血清IgG4/IgG比值和尿IgG4/尿肌酐比值明顯高于腎功能正常組(P=0.049，P=0.015)。血清白蛋白水平<30 g/L者血清IgG4/IgG比值明顯高于血清白蛋白水平≥30 g/L者(P=0.005)。血清IgG4/IgG比值隨病理分期有逐漸升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.524)(表3)。

53例PLA2R-MN患者至少隨訪1年，3例患者失訪，發(fā)現(xiàn)11例患者未緩解，42例患者獲得完全或部分緩解后，血清白蛋白從(29.0±6.2) g/L上升至(37.3±5.24) g/L。緩解組腎穿刺時(shí)基線血清IgG4/IgG明顯低于未緩解組(P=0.005)(表4)。

表1 各組患者的臨床特征比較

表2 各組血IgG4/lgG及尿IgG4/尿肌酐的比較[M(Q1，Q3)]

表3 PLA2R-MN患者不同臨床表現(xiàn)時(shí)血清IgG4/IgG和尿IgG4/肌酐的比較[M(Q1，Q3)]

表4 PLA2R-MN患者不同轉(zhuǎn)歸時(shí)血清IgG4/IgG和尿IgG4/肌酐的比較[M(Q1，Q3)]

隨訪1年后，采集到27例PLA2R-MN患者的血清標(biāo)本，其中包括23例緩解患者及4例未緩解患者。緩解期患者血清IgG4/IgG中位數(shù)比值顯著降低(P<0.001)，未緩解者血清IgG4/IgG中位數(shù)比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.483)。僅9例PLA2R-MN患者采集到尿標(biāo)本。其中7例緩解，2例未緩解。緩解組患者中位尿IgG4/肌酐比值隨訪前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.499)(表5)。

表5 治療前后血IgG4/IgG及尿IgG4/肌酐水平的比較[M(Q1，Q3)]

相關(guān)性根據(jù)血清IgG4/IgG繪制受試者工作特征曲線，比較有無(wú)緩解患者的預(yù)后，受試者工作特征曲線下面積為0.775 (P=0.005)，截止值為10.24%(圖1)。Spearman相關(guān)性分析顯示，PLA2R-MN患者血清IgG4和尿液IgG4水平呈顯著相關(guān)性(rs=0.602，P<0.001)。

討 論

IMN是一種由內(nèi)源性抗原引起原位免疫復(fù)合物形成的自身免疫性疾病，其主要抗原為PLA2R，IgG4是抗PLA2R的主要抗體，IgG4與足細(xì)胞上的PLA2R特異性結(jié)合形成優(yōu)勢(shì)沉積，并通過(guò)激活甘露糖結(jié)合凝集素途徑或旁路途徑，產(chǎn)生C5- 9膜攻擊復(fù)合物，損傷足細(xì)胞，參與IMN的發(fā)病過(guò)程[8- 9]。IgG4是IgG亞類中比率最小的一種亞型，占血清總IgG水平的3%～4%。在PLA2R-MN患者中，IgG4做為抗PLA2R抗體的主要成分，在IgG中的比值有所升高。Kuroki等[10]通過(guò)ELISA法檢測(cè)血IgG4、IgG水平，發(fā)現(xiàn)IMN患者血中

圖1 血清IgG4/IgG判斷PLA2R-MN患者預(yù)后的受試者工作特征曲線

IgG4占總IgG的比率(即IgG4/IgG)高于膜型狼瘡性腎炎、膜增生性腎小球腎炎及健康對(duì)照者。國(guó)內(nèi)Li等[11]研究顯示IMN患者血和尿IgG4/IgG均顯著高于微小病變性腎病、局灶節(jié)段硬化性腎小球腎炎和健康志愿者。IgG4較其他IgG亞型有其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和電荷特性，IgG4與抗原形成的免疫復(fù)合物是小分子量，IgG4帶有負(fù)電荷，與腎小球基底膜的負(fù)電荷相斥，使得其親和力較低，容易解離而出現(xiàn)在患者尿液中[12]，因此，尿IgG4水平除了可能和血IgG4水平相關(guān)外，還與腎臟組織免疫復(fù)合物中IgG4沉積多少及清除等相關(guān)。SMN的腎組織中未發(fā)現(xiàn)IgG4沉積為主[13- 14]。而IgAN患者腎小球足細(xì)胞中沒(méi)有PLA2R和相關(guān)IgG4沉積，因此將其作為本研究的另一對(duì)照組。

本研究顯示，PLA2R-MN患者血清IgG4/IgG比值、尿IgG4/肌酐比值均顯著高于SMN患者，血清IgG4/IgG比值顯著高于IgAN患者，與既往研究[10- 11]結(jié)果一致。而SMN組與IgAN組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示檢測(cè)血清IgG4/IgG比值和尿IgG4/尿肌酐比值可作為診斷IMN的一種簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)的方法。IgG4是70% IMN患者PLA2R抗體的主要IgG亞類，因此，進(jìn)一步檢測(cè)抗PLA2R的血、尿IgG4水平可能是診斷IMN的較目前常用的檢測(cè)血PLA2R-IgG水平更準(zhǔn)確的一種無(wú)創(chuàng)手段，可以提高診斷的敏感性。

本研究顯示PLA2R相關(guān)膜性腎病患者緩解后血清IgG4/IgG比值明顯降低，無(wú)緩解患者血清IgG4/IgG比值無(wú)下降。此外，血清白蛋白≥30 g/L的患者其血清IgG4/IgG比例和尿IgG4/肌酐比值明顯低于IMN患者血清白蛋白<30 g/L的患者。腎功能正常的患者其血清IgG4/IgG比例明顯低于腎功能不全的患者。這些結(jié)果證實(shí)IgG4在IMN的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，提示血清IgG4/IgG比值與IMN疾病活動(dòng)密切相關(guān)。

針對(duì)兒童IMN患者的研究顯示，IgG呈節(jié)段性分布的以IgG1和IgG3為主，IgG呈全毛細(xì)血管襻分布的兒童IMN患者以IgG2和IgG4為主，提示IgG4的沉積可能與IMN的不同病程有關(guān)[15]。本研究按病理分期對(duì)IMN進(jìn)行分類時(shí)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期IMN患者血清IgG4和尿液IgG4差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明血清和尿液IgG4水平不能反映IMN腎臟病理的嚴(yán)重程度。

本研究觀察治療緩解組和未緩解組的血清和尿液IgG4水平的變化，在1年后進(jìn)行分析，結(jié)果表明緩解組的患者血清IgG4/IgG比值較基線值明顯下降，證實(shí)血清IgG4/IgG比值與IMN疾病活動(dòng)性密切相關(guān)。隨著疾病緩解和尿蛋白水平的提高，血清IgG4/IgG比值顯著降低，證實(shí)IgG4可能在IMN發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。此外，本研究顯示血清IgG4/IgG比值<10.24%的患者對(duì)治療有更好的反應(yīng)。因尿液樣本量少，尿液IgG4/肌酐未得出有意義的結(jié)果。

進(jìn)一步分析顯示血清和尿液IgG4水平之間存在相關(guān)性，提示尿IgG4和經(jīng)過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)的血清IgG4濃度有關(guān)。然而，血清或尿液IgG4水平與IgG4在腎臟中的沉積之間無(wú)相關(guān)性，表明尿液IgG4可能與腎臟組織中IgG4的清除無(wú)相關(guān)性或合并其他干擾因素。

本研究的局限性包括樣本量相對(duì)較小，特別是對(duì)照組的數(shù)量，以及隨訪時(shí)間有限。患者在隨訪期間的免疫抑制用藥方案不同，可能會(huì)影響預(yù)后。后續(xù)應(yīng)進(jìn)行更大的人群調(diào)查和更長(zhǎng)的隨訪時(shí)間。

綜上，PLA2R-MN患者的血清和尿液IgG4水平發(fā)生改變，因此，它們可能是膜性腎病疾病活動(dòng)的指標(biāo)。此外，血清IgG4/IgG比值<10.24%的患者有更好的治療反應(yīng)，支持血清和尿液IgG4水平，特別是血清IgG4水平作為預(yù)測(cè)PLA2R-MN緩解的潛在生物標(biāo)志物的潛力。