李建軍，吳素方，白豐璽

河南省胸科醫(yī)院結(jié)核二科，鄭州 450008

肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB)是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，PTB在中國(guó)的死亡率和發(fā)病率均居前兩位[1]。因此，致力于PTB藥物研究以提高治愈率、降低發(fā)病率和死亡率具有重要的意義。乙胺丁醇(ethambutol，EMB)是一種用于治療結(jié)核病的藥物，也是一種抑制細(xì)胞壁合成的抑菌藥物[2]。有報(bào)道EMB、異煙肼、利福平、吡嗪酰胺聯(lián)合應(yīng)用在PTB患者的治療中，可有效改善患者的臨床癥狀，療效顯著，安全性較好[3]。而關(guān)于EMB對(duì)PTB大鼠的藥理作用及其作用機(jī)制報(bào)道較少。因此，本研究擬通過(guò)構(gòu)建PTB大鼠模型，探討EMB對(duì)PTB大鼠的治療作用以及其作用機(jī)制。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株和試劑8周齡，體重為200～220 g的SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)自廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2021- 0057。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循3R原則，本研究得到本院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(2020- 07- 025)。標(biāo)準(zhǔn)人型結(jié)核菌株H37Rv購(gòu)自南京萊富賽生物科技有限公司。鹽酸乙胺丁醇片購(gòu)自沈陽(yáng)紅旗制藥有限公司；Janus激酶(Janus kinase，JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)信號(hào)通路激活劑Colivelin購(gòu)自南京肽業(yè)生物科技有限公司；白細(xì)胞介素(interleukin，IL)- 6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL- 1β、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)ELISA檢測(cè)試劑盒、JAK2、磷酸化JAK2(phosphorylated JAK2，p-JAK2)、STAT3、磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3，p-STAT3)、GAPDH兔多克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；PowerSoil DNA 分離試劑盒購(gòu)自廣州勝創(chuàng)生物科技有限公司；BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自碧云天生物有限公司。

實(shí)驗(yàn)分組及樣本采集將60只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、PTB組、PTB+EMB組、PTB+EMB+Colivelin組，每組15只。除對(duì)照組外，其他組均參照文獻(xiàn)[4]對(duì)大鼠注射0.2 ml 5 mg/ml的結(jié)核桿菌懸液以構(gòu)建PTB模型。造模24 h后，PTB+EMB組大鼠按照30 mg/kg的劑量灌胃EMB[5]，按照體表面積換算，用藥劑量相當(dāng)于人的1.26倍，且需腹腔注射等體積的生理鹽水；PTB+EMB+Colivelin組大鼠按照30 mg/kg的劑量灌胃EMB同時(shí)按照1 mg/kg的劑量腹腔注射JAK/STAT信號(hào)通路激活劑Colivelin[6]，對(duì)照組、PTB組大鼠均需灌胃等量的生理鹽水且腹腔注射等體積的生理鹽水，各組大鼠連續(xù)給藥4周，1次/d。分別監(jiān)測(cè)各組大鼠在給藥第1、14、28天時(shí)的體重變化。末次給藥后，大鼠禁食，自由飲水24 h。肛周消毒后，通過(guò)腹部按摩催促大鼠排便。然后，用無(wú)菌鑷子收集1～2 g糞便并儲(chǔ)存在-80 ℃的無(wú)菌冷凍保存管中，用于隨后的糞便DNA提取和菌群檢測(cè)。收集各組大鼠血清用于IL- 6、TNF-α、IL- 1β、IFN-γ的檢測(cè)，外周血用于T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的檢測(cè)。上述檢測(cè)完成后，通過(guò)腹腔注射5%戊巴比妥鈉溶液麻醉并處死大鼠，收集各組大鼠肺組織，分為3部分，一部分用于計(jì)數(shù)結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)，一部分用于HE染色，一部分用于Western blot實(shí)驗(yàn)。

結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)計(jì)數(shù)取大鼠肺組織研磨成勻漿，用4%硫酸消化后，加入pH=7的2.5 mol/L NaOH，將該混合物接種于斜面培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)5周后計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上的結(jié)核分枝桿菌。

HE染色取大鼠肺組織，于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、包埋后，切成5 μm切片，將切片常規(guī)脫蠟、水化、HE染色、中性樹(shù)膠干燥。在光學(xué)顯微鏡鏡下觀察肺組織的病理變化。

ELISA法檢測(cè)嚴(yán)格按照IL- 6、TNF-α、IL- 1β、IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)各組大鼠血清中IL- 6、TNF-α、IL- 1β、IFN-γ水平。

大鼠T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平，并嚴(yán)格參考要求操作。

大鼠腸道菌群屬水平的相對(duì)豐度檢測(cè)取0.2 g糞便樣品于1 ml Ep管中，使用PowerSoil DNA分離試劑盒提取糞便DNA，利用NanoDrop 2000評(píng)估DNA質(zhì)量和濃度。隨后，用無(wú)菌水將各樣品稀釋至1 ng/μl。以稀釋的基因組DNA樣品為PCR 擴(kuò)增模板，使用引物(正向：515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3’，反向：806R：5’-GGACTACHVGGGT-WTCTAAT- 3’)擴(kuò)增細(xì)菌總DNA中16S rRNA V4區(qū)基因進(jìn)行擴(kuò)增建庫(kù)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序，下載原始測(cè)序數(shù)據(jù)后，進(jìn)行質(zhì)控步驟，通過(guò)序列拼接、過(guò)濾、去嵌合得到優(yōu)化序列，QIIME軟件計(jì)算大鼠腸道菌群屬水平的相對(duì)豐度。

Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)利用放射免疫沉淀法裂解液裂解大鼠肺組織勻漿，離心得上清。BCA試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，通過(guò)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)，將分離的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，利用5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入一抗JAK2(1∶1000)、p-JAK2(1∶1000)、STAT3(1∶2000)、p-STAT3(1∶2000)、GAPDH(1∶1000)于4 ℃下孵育過(guò)夜。用PTBST洗滌膜3次，并與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗在常溫下孵育1 h，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白顯色情況。以GAPDH為內(nèi)參，通過(guò)Image J 軟件分析目的蛋白的灰度值。

結(jié) 果

體重變化重復(fù)測(cè)量方差分析組間比較，各組間及不同時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F交互=31.411，P<0.001；F組間=501.281，P<0.001；F時(shí)間=116.475，P<0.001)。給藥第14、28天4組大鼠體重變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)；給藥第14天各組大鼠體重明顯高于給藥第1天(P均<0.001)；給藥第28天時(shí)各組大鼠體重明顯高于給藥第1、14天(P均<0.001)(表1)。

表1 各組大鼠在給藥第1、14、28天時(shí)的體重變化

肺組織結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)與對(duì)照組0 lg10比較，PTB組(9.23±0.78) lg10(q=45.360，P<0.001)、PTB+EMB組(3.47±0.39) lg10(q=17.053，P<0.001)、PTB+EMB+Colivelin組(6.55±0.26) lg10(q=32.190，P<0.001)結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)均顯著增加；與PTB組比較，PTB+EMB組(q=28.307，P<0.001)、PTB+EMB+Colivelin組(q=13.171，P<0.001)結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)均顯著減少；與PTB+EMB組比較，PTB+EMB+Colivelin組結(jié)核分枝桿菌菌落數(shù)顯著增加(q=15.136，P<0.001)。

肺組織病理變化HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠肺組織形態(tài)正常，肺泡、支氣管清晰可見(jiàn)，無(wú)增生、壞死的發(fā)生；PTB組大鼠肺組織呈現(xiàn)嚴(yán)重的病理改變，如出現(xiàn)大量結(jié)核結(jié)節(jié)、增生、壞死、滲出等；PTB+EMB組大鼠肺組織形態(tài)存在少許病理變化，僅出現(xiàn)增生，尚未出現(xiàn)壞死的情況；PTB+EMB+Colivelin組大鼠有較為嚴(yán)重的增生、壞死、滲出發(fā)生(圖1)。

血清中炎癥因子的表達(dá)在對(duì)照組、PTB組、PTB+EMB組、PTB+EMB+Colivelin組中IL- 6分別為(26.43±4.03)、(65.18±6.50)、(38.95±4.98)、(57.42±5.96) pg/ml，TNF-α分別為(5.41±1.25)、(19.44±2.08)、(10.03±3.10)、(16.26±2.78) ng/ml，IL- 1β分別為(25.33±5.51)、(68.19±7.44)、(38.95±5.87)、(56.19±6.05) pg/ml，IFN-γ分別為(125.56±11.34)、(52.23±4.18)、(108.87±8.22)、(74.45±3.06) pg/ml。與對(duì)照組比較，PTB組(q分別為27.537、22.549、26.515，P均<0.001)、PTB+EMB組(q分別為8.897、7.425、8.426，P均<0.001)、PTB+EMB+Colivelin組(q分別為22.022、17.438、19.091，P均<0.001)大鼠血清中IL- 6、TNF-α、IL- 1β水平顯著升高，IFN-γ水平顯著降低(q分別為38.037、8.657、26.511，P均<0.001)；與PTB組比較，PTB+EMB組(q分別為18.640、15.124、18.089，P均<0.001)、PTB+EMB+Colivelin組(q分別為5.514、5.111、7.423，P分別為0.001、0.003、0.000)大鼠血清中IL- 6、TNF-α、IL- 1β水平顯著降低，IFN-γ水平顯著升高(q分別為29.380、11.526，P均<0.001)；與PTB+EMB組比較，PTB+EMB+Colivelin組大鼠血清中IL- 6、TNF-α、IL- 1β水平顯著升高(q分別為13.125、10.013、10.665，P均<0.001)，IFN-γ水平顯著降低(q=17.854，P<0.001)。

A.對(duì)照組；B.PTB組；C.PTB+EMB組；D.PTB+EMB+Colivelin組

T淋巴細(xì)胞亞群變化在對(duì)照組、PTB組、PTB+EMB組、PTB+EMB+Colivelin組中CD3+分別為(61.29±10.52)%、(42.73±6.64)%、(55.18±8.05)%、(40.59±8.05)%，CD4+分別為(42.96±7.11)%、(17.59±4.67)%、(37.24±6.05)%、(22.59±5.11)%，CD8+分別為(21.08±5.01)%、(46.34±3.89)%、(30.42±4.58)%、(41.35±4.72)%，CD4+/CD8+分別為12.04±0.42、0.38±0.15、1.19±0.31、0.55±0.18。與對(duì)照組比較，PTB組(q分別為8.525、16.909、22.472，P均<0.001)、PTB+EMB+Colivelin組(q分別為9.5089、13.576、20.171，P均<0.001)大鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+顯著降低，CD8+顯著升高(q分別為21.414、17.184，P均<0.001)，而PTB+EMB組大鼠CD4+/CD8+顯著降低(q=11.507，P<0.001)；與PTB組比較，PTB+EMB組大鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+顯著升高(q分別為5.719、13.096、10.965，P均<0.001)，CD8+顯著降低(q=13.496，P<0.001)；與PTB+EMB組比較，PTB+EMB+Colivelin組大鼠CD3+、CD4+、CD4+/CD8+顯著降低(q分別為6.702、9.764、8.664，P均<0.001)，CD8+顯著升高(q=9.266，P<0.001)(圖2)。

腸道菌群屬水平的相對(duì)豐度與對(duì)照組比較，PTB組大鼠腸道菌群中厭氧原體屬相對(duì)豐度顯著降低(q=6.390，P<0.001)，擬桿菌屬、消化球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、放線菌屬、乳酸桿菌科、疣微菌科、韋榮球菌科相對(duì)豐度顯著升高(q分別為11.804、8.654、14.453、13.566、17.474、19.151、16.981，P均<0.001)；與PTB組比較，PTB+EMB組大鼠腸道菌群中厭氧原體屬相對(duì)豐度顯著升高(q=6.685，P<0.001)，擬桿菌屬、消化球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、放線菌屬、乳酸桿菌科、疣微菌科、韋榮球菌科相對(duì)豐度顯著降低(q分別為6.441、28.322、8.827、8.637、13.763、8.618、12.718，P均<0.001)；與PTB+EMB組比較，PTB+EMB+Colivelin組大鼠腸道菌群中厭氧原體屬相對(duì)豐度顯著降低(q=5.302，P=0.002)，消化球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、放線菌屬、乳酸桿菌科、疣微菌科、韋榮球菌科相對(duì)豐度顯著升高(q分別為18.994、4.154、6.417、10.628、4.596、10.622，P分別為<0.001、0.024、<0.001、<0.001、<0.001、<0.001)(表2)。

A.對(duì)照組；B.PTB組；C.PTB+EMB組；D.PTB+EMB+Colivelin組

表2 各組大鼠腸道菌群屬水平的相對(duì)豐度比較

與對(duì)照組比較，aP<0.001；與PTB組比較，bP<0.001；與PTB+EMB組比較，cP=0.002，dP<0.001，eP=0.024aP<0.001 compared with the control group；bP<0.001 compared with the PTB group；cP=0.002，dP<0.001，eP=0.024 compared with the PTB+EMB group肺組織中JAK-STAT通路相關(guān)蛋白的表達(dá)對(duì)照組、PTB組、PTB+EMB組、PTB+EMB+Colivelin組JAK2分別為1.00±0.18、0.99±0.13、0.88±0.15、1.02±0.17，p-JAK2分別為1.00±0.15、2.34±0.31、1.43±0.24、2.15±0.27，STAT3分別為1.00±0.13、0.98±0.14、1.00±0.15、0.85±0.19，p-STAT3分別為1.00±0.12、2.07±0.25、1.38±0.19、1.92±0.21。與對(duì)照組比較，PTB組(q分別為12.007、12.073，P均<0.001)、PTB+EMB+Colivelin組(q分別為10.305、10.380，P均<0.001)p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著升高；與PTB組比較，PTB+EMB組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低(q分別為8.154、7.785，P均<0.001)；與PTB+EMB組比較，PTB+EMB+Colivelin組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著升高(q分別為6.452、6.093，P分別為0.002、0.003)；對(duì)照組、PTB組、PTB+EMB組、PTB+EMB+Colivelin組中JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分別為0.786、1.099，P分別為0.519、0.378)(圖3)。

討 論

PTB是一種由結(jié)核分枝桿菌感染引起的高度傳染性疾病，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、喘息、虛弱、體重減輕、食欲不振、寒戰(zhàn)、盜汗等[7]。本研究通過(guò)對(duì)大鼠注射0.2 ml 5 mg/ml的結(jié)核桿菌懸液以構(gòu)建PTB模型，HE染色結(jié)果顯示，PTB組大鼠肺組織呈現(xiàn)出嚴(yán)重的病理改變，如出現(xiàn)大量結(jié)核結(jié)節(jié)，增生、壞死、滲出現(xiàn)象明顯，且在第14、28天時(shí)PTB模型大鼠體重明顯低于對(duì)照組，表明PTB模型構(gòu)建成功。

JAK2：Janus激酶2；p-JAK2：磷酸化Janus激酶2；STAT3：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3；p-STAT3：磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3；Mr：相對(duì)分子質(zhì)量；1：對(duì)照組；2：PTB組；3：PTB+EMB組；4：PTB+EMB+Colivelin組

EMB作為一線抗PTB藥物之一[8]，已有研究表明，EMB可干擾結(jié)核分枝桿菌的菌體RNA合成過(guò)程，繼而抑制并殺滅結(jié)核分枝桿菌，臨床上EMB常用于結(jié)核分枝桿菌感染患者的治療[9]；EMB聯(lián)合利福噴丁用于治療PTB，可顯著改善炎癥因子IL- 6、TNF-α水平，提高臨床療效，減少不良反應(yīng)發(fā)生率[10]；IFN-γ在抗結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞免疫中具有重要作用，其能夠激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核桿菌的吞噬[11]。本研究結(jié)果顯示，與PTB組比較，PTB+EMB組大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)明顯改善，大鼠血清中炎癥因子IL- 6、TNF-α、IL- 1β水平顯著降低，IFN-γ水平顯著升高，提示EMB能夠改善PTB大鼠肺組織病理學(xué)，降低大鼠炎癥因子水平，促進(jìn)抗結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

T淋巴細(xì)胞在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量、比例以及功能若出現(xiàn)異常，均會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂進(jìn)而引起疾病[12]。劉雙紅[13]報(bào)道PTB好轉(zhuǎn)組患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+等T淋巴細(xì)胞亞群水平高于進(jìn)展組患者，但該水平低于對(duì)照組；王文萍等[14]研究顯示利福平聯(lián)合異煙肼治療PTB可明顯升高PTB患者CD3+、CD4+水平，降低CD8+水平。本研究結(jié)果顯示，與PTB組比較，PTB+EMB組大鼠外周血中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平顯著升高，提示EMB可改善PTB大鼠的免疫功能。

有研究顯示，結(jié)核分枝桿菌感染還會(huì)引起腸道微生物菌群的變化[15]。如PTB患者存在腸道菌群組成及多樣性改變，菌群定植能力低于健康人[16]；獼猴的腸道菌群狀況與結(jié)核分枝桿菌感染后的病情嚴(yán)重程度相關(guān)[17]。表明腸道菌群變化可引起結(jié)核分枝桿菌感染疾病的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，PTB組大鼠腸道菌群中擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、放線菌屬、乳酸桿菌科、疣微菌科、韋榮球菌科相對(duì)豐度顯著升高，經(jīng)EMB治療后，PTB組大鼠腸道菌群中消化球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、乳酸桿菌科、韋榮球菌科相對(duì)豐度顯著降低，這與Namasivayam等[18]的研究一致。提示EMB可抑制PTB大鼠腸道菌群失調(diào)。另有研究表明，腸道菌群的改變可以引起JAK-STAT信號(hào)通路的變化[19]。提示EMB抑制PTB大鼠腸道菌群失調(diào)可能與JAK-STAT通路有關(guān)，為了驗(yàn)證該推測(cè)，本研究檢測(cè)JAK-STAT通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，PTB組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著升高；與PTB組比較，PTB+EMB組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明EMB可能通過(guò)抑制腸道菌群失調(diào)引起的JAK/STAT信號(hào)通路改善PTB大鼠模型的感染。為進(jìn)一步驗(yàn)證該推測(cè)，本研究利用JAK/STAT信號(hào)通路激活劑Colivelin進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示與PTB+EMB組比較，PTB+EMB+Colivelin組p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著升高，肺組織病理變化加劇，炎癥因子水平升高，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+顯著降低，腸道菌群中消化球菌屬、乳酸桿菌科、韋榮球菌科相對(duì)豐度顯著升高，表明EMB可通過(guò)抑制JAK/STAT信號(hào)通路改善PTB大鼠模型的感染。

綜上，EMB可通過(guò)抑制JAK/STAT信號(hào)通路改善PTB大鼠模型的感染。但其是否亦通過(guò)其他通路發(fā)揮改善感染作用仍有待后續(xù)深入探究。此外，本研究尚存在不足：第一，檢測(cè)大鼠血清中炎癥因子表達(dá)和肺組織中JAK-STAT通路相關(guān)蛋白表達(dá)時(shí)，涉及的大鼠樣本量較少，可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響；第二，EMB對(duì)人的視神經(jīng)具有損害作用，而EMB對(duì)大鼠視神經(jīng)的影響尚未探究，這將是以后研究的重點(diǎn)，旨在為EMB的臨床使用排除各種不確定的因素。