方 成 黎蘭詩(shī) 梁震宇 成良峰 戴習(xí)林

不同濃度亞硝酸鹽亞急性脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)與免疫功能的影響*

方 成 黎蘭詩(shī) 梁震宇 成良峰 戴習(xí)林①

(上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)試驗(yàn)教學(xué)示范中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心 上海 201306)

為闡明鹽度為5條件下不同濃度亞硝酸鹽亞急性脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦()生長(zhǎng)與免疫功能的影響，本研究設(shè)置5個(gè)亞硝酸鹽濃度組(0.50、0.90、1.70、3.20和6.00 mg/L)和對(duì)照組(0.05 mg/L)，檢測(cè)分析了亞硝酸鹽脅迫40 d后凡納濱對(duì)蝦免疫相關(guān)酶活性、丙二醛(MDA)含量以及免疫和生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，凡納濱對(duì)蝦死亡率隨亞硝酸鹽濃度的增加而升高，6.00 mg/L濃度組體質(zhì)量增長(zhǎng)率(WGR)和體長(zhǎng)增長(zhǎng)率(LGR)均顯著低于對(duì)照組(<0.05)。部分濃度組亞硝酸鹽對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和血清中的免疫相關(guān)酶活性具有一定的誘導(dǎo)作用。其中，當(dāng)亞硝酸鹽濃度高于0.50 mg/L時(shí)，肝胰腺超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著高于對(duì)照組(<0.05)；0.50、0.90和1.70 mg/L濃度組的過(guò)氧化氫酶(CAT)活性顯著高于對(duì)照組(<0.05)；血清中CAT和SOD活性隨亞硝酸鹽濃度的增加均呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)；0.90 mg/L濃度組的肝胰腺和血清中酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)活性均顯著高于對(duì)照組(<0.05)。MDA含量變化無(wú)明顯規(guī)律。此外，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性顯著升高(<0.05)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，除0.50 mg/L濃度組外，其他濃度組的和基因表達(dá)量顯著升高(<0.05)；各濃度組的和基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(<0.05)。經(jīng)亞硝酸鹽脅迫40 d后，各濃度組凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)和免疫功能均受到明顯的阻遏作用。在鹽度為5條件下，為確保凡納濱對(duì)蝦的健康養(yǎng)殖，亞硝酸鹽濃度應(yīng)控制在0.50 mg/L以內(nèi)。

凡納濱對(duì)蝦；亞硝酸鹽；酶活性；環(huán)境脅迫

凡納濱對(duì)蝦()是我國(guó)非常重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，自引入我國(guó)以來(lái)，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但養(yǎng)殖過(guò)程中出現(xiàn)的亞硝酸鹽成為了制約凡納濱對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。亞硝酸鹽是養(yǎng)殖水體中常見(jiàn)的化學(xué)物質(zhì)。氨氮在亞硝化作用下變?yōu)閬喯跛猁}，之后通過(guò)硝化作用轉(zhuǎn)變?yōu)橄跛猁}。但硝化作用與亞硝化作用一般無(wú)法達(dá)到平衡，因此，亞硝酸鹽容易在水體中積蓄。亞硝酸鹽可導(dǎo)致蝦類生長(zhǎng)和發(fā)育異常，病菌易感性增加(Tseng, 2004;臧維玲等, 1996; Mallasen,2006)，并會(huì)造成一定程度的組織損傷。一定濃度的亞硝酸鹽可使血淋巴與氧結(jié)合能力降低(Chen,1995)，最終導(dǎo)致蝦窒息死亡。彭自然等(2004)研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦在含有亞硝酸鹽的水體中養(yǎng)殖14 d后，其生長(zhǎng)和發(fā)育受到了明顯抑制。胡義波等(2005)研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦經(jīng)亞硝酸鹽脅迫后體內(nèi)血細(xì)胞減少，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受到明顯影響。吳中華等(1999)研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽慢性脅迫條件下，中國(guó)對(duì)蝦()各個(gè)組織均受到不同程度的影響，其中肝胰腺組織病變較為嚴(yán)重。Cheng等(2000)研究發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對(duì)蝦()經(jīng)亞硝酸鹽脅迫后，肝胰腺和中腸中亞硝酸鹽積累較多。Zhang等(2015)研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)氨氮和亞硝酸鹽聯(lián)合脅迫24 h后，羅氏沼蝦()血淋巴中活性氧升高，抗氧化酶活性受到影響。葛紅星等(2014)研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦在不同濃度亞硝酸鹽水體中暴露20 d后，對(duì)副溶血弧菌()的易感性提高?？傮w而言，一定濃度的亞硝酸鹽可對(duì)凡納濱對(duì)蝦的免疫功能和生長(zhǎng)造成較明顯的阻遏作用。近年來(lái)，關(guān)于亞硝酸鹽的研究主要集中于亞硝酸鹽對(duì)蝦類的急性毒性影響，主要研究短期亞硝酸鹽脅迫后蝦體內(nèi)抗氧化酶活性、氧化損傷以及對(duì)病菌易感性的變化，而較少有針對(duì)亞硝酸鹽對(duì)凡納濱對(duì)蝦亞急性毒性的研究。本實(shí)驗(yàn)研究凡納濱對(duì)蝦在5個(gè)不同亞硝酸鹽濃度的水體中養(yǎng)殖40 d后體內(nèi)部分免疫相關(guān)酶活性、免疫和生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)變化情況，以期為亞硝酸鹽亞急性脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦的影響提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用蝦取自上海申漕特種水產(chǎn)有限公司，挑選健康、體長(zhǎng)為(7.45±0.21) cm、體質(zhì)量為(4.75±0.51) g的凡納濱對(duì)蝦暫養(yǎng)于水泥池中。

1.2 亞硝酸鹽亞急性脅迫實(shí)驗(yàn)

凡納濱對(duì)蝦暫養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得知，凡納濱對(duì)蝦96 h半致死濃度(96h-LC50)約為30 mg/L，取該濃度的20%為最高濃度并按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置5個(gè)亞硝酸鹽濃度，分別為0.50、0.90、1.70、3.20和6.00 mg/L。每個(gè)處理設(shè)3組平行，每個(gè)平行放30尾蝦。對(duì)照組亞硝酸鹽濃度約為0.05 mg/L。實(shí)驗(yàn)在鹵蟲池中進(jìn)行，水體體積為100 L，每日換水1/2。每日利用分光光度計(jì)測(cè)得水體中亞硝酸鹽濃度，并使用10 g/L NaNO2溶液控制水體中的亞硝酸鹽濃度。

實(shí)驗(yàn)期間，溫度控制在26℃～27℃，鹽度為5，總氨氮≤0.5 mg/L，非離子氨≤0.02 mg/L，pH控制在7.8±0.2，24 h曝氣。每日投喂3次人工飼料(魚粉23%、酵母粉4%、大豆磷脂4%、豆粕20%、花生粕7.4%等)，每日投喂量為蝦體質(zhì)量的11%～16%。每日記錄蝦的死亡狀況。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行40 d后(取樣前停飼24 h)，每個(gè)平行取3尾蝦的肝胰腺放入離心管中，存放于–80℃冰箱，用于酶活測(cè)定和RNA提取。另外，使用1 mL注射器在第2腹肢基部抽取凡納濱對(duì)蝦的血淋巴，并放入離心管中。血淋巴存于4℃冰箱，放置24 h后離心取上清液，放置于–80℃冰箱，用于酶活測(cè)定。

1.3 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

通過(guò)以下公式計(jì)算得到不同濃度感染組的死亡率(MR)、體質(zhì)量增長(zhǎng)率(WGR)和體長(zhǎng)增長(zhǎng)率(LGR)。

死亡率(MR, %)=T/0×100% (1)

體質(zhì)量增長(zhǎng)率(WGR, %)=(T–0)/0×100% (2)

體長(zhǎng)增長(zhǎng)率(LGR, %)=(T–0)/0×100% (3)

式中，0為初始數(shù)量；T為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)死亡數(shù)量；0和T分別為初始平均體質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)平均體質(zhì)量；0和T分別為初始平均體長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)平均體長(zhǎng)。

1.4 抗氧化酶、代謝酶活性和MDA含量的測(cè)定

采用超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、丙二醛(MDA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)試劑盒(南京建成生物工程有限公司)測(cè)定凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和血清的生理生化指標(biāo)。

1.5 總RNA的提取

使用RNA Easy Fast動(dòng)物組織/細(xì)胞總RNA提取試劑盒(DP451)(北京天根生化科技有限公司)提取肝胰腺組織RNA。采用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定的RNA樣品的OD260 nm和OD280 nm值，確定其濃度，并計(jì)算二者比值以確定RNA的純度。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。

1.6 反轉(zhuǎn)錄及引物設(shè)計(jì)

按照PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(TaKaRa)將之前所提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA存放于–20℃冰箱中。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中凡納濱對(duì)蝦(DQ005531)、(AY518322)、(AY645906)等基因的保守區(qū)域和基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用引物序列

Tab.1 Sequences of the primers in this study

1.7 熒光定量PCR

使用ABI PRISM?7900 Sequence Detection System儀器，根據(jù)SYBR?Green Real-time PCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書，對(duì)各組實(shí)驗(yàn)樣品的目的基因和基因cDNA進(jìn)行定量測(cè)定。ABI PRISM?7900 Sequence Detection System的具體反應(yīng)程序設(shè)置為：94℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，60℃退火25 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。最后根據(jù)熔解曲線分析PCR產(chǎn)物質(zhì)量。采用2–??Ct計(jì)算法對(duì)各組樣品測(cè)得的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。采用SPSS 17.0和Excel 2010分析數(shù)據(jù)，使用Duncan′s multiple range test檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)差異，<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度亞硝酸鹽對(duì)凡納濱對(duì)蝦死亡率和生長(zhǎng)的影響

由表2可知，凡納濱對(duì)蝦死亡率隨亞硝酸鹽濃度的增加而升高。各濃度組死亡率均顯著高于對(duì)照組(<0.05)，6.00 mg/L濃度組死亡率為最高(<0.05)。

凡納濱對(duì)蝦體質(zhì)量增長(zhǎng)率和體長(zhǎng)增長(zhǎng)率總體上隨亞硝酸鹽濃度的增加呈降低的趨勢(shì)。6.00 mg/L濃度組體質(zhì)量增長(zhǎng)率和體長(zhǎng)增長(zhǎng)率為最低，并顯著低于對(duì)照組(<0.05)，其他濃度組體長(zhǎng)增長(zhǎng)率和體質(zhì)量增長(zhǎng)率組間無(wú)顯著差異(>0.05)。

表2 不同濃度亞硝酸鹽對(duì)凡納濱對(duì)蝦死亡率和生長(zhǎng)的影響

Tab.2 Effect of different concentrations of nitrite on growth performance and mortality rate of L. vannamei

2.2 不同濃度亞硝酸鹽對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗氧化酶活性和MDA含量的影響

除0.50 mg/L濃度組外，其他濃度組血清中SOD和CAT活性均高于對(duì)照組，其中，SOD和CAT活性分別在3.20和0.90 mg/L濃度組達(dá)到最高并顯著高于對(duì)照組(<0.05)(圖1a、圖1b)。除0.50 mg/L濃度組外，其他濃度組肝胰腺SOD活性均高于對(duì)照組，0.90 mg/L濃度組SOD活性為最高(<0.05)(圖1c)。如圖1d所示，0.50、0.90和1.70 mg/L濃度組肝胰腺CAT活性顯著高于對(duì)照組(<0.05)。3.20和6.00 mg/L濃度組CAT活性顯著低于對(duì)照組，且各組間存在顯著差異(<0.05)(圖1d)。

血清中AKP和ACP活性隨亞硝酸鹽濃度的增加總體呈升高的趨勢(shì)，而在肝胰腺中則呈波動(dòng)變化。3.20 mg/L濃度組血清AKP和ACP活性達(dá)到最高(<0.05)(圖1e、圖1f)。而肝胰腺中ACP和AKP活性在0.90 mg/L濃度組為最高(<0.05)(圖1g、圖1h)。

MDA含量總體呈波動(dòng)變化，其中，3.20 mg/L濃度組血清MDA含量顯著高于對(duì)照組(<0.05)，其他濃度組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(>0.05)(圖1i)。除0.50 mg/L濃度組，其他濃度組肝胰腺M(fèi)DA含量均高于對(duì)照組，其中，0.90、1.70和6.00 mg/L濃度組顯著高于對(duì)照組(<0.05) (圖1j)。

圖1 不同濃度亞硝酸鹽對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗氧化酶活性和MDA含量的影響

不同字母代表存在顯著差異(<0.05)，下同。

Different letters indicate significant difference (<0.05). The same as below.

2.3 不同濃度亞硝酸鹽對(duì)凡納濱對(duì)蝦代謝酶活性的影響

除0.50 mg/L濃度組外，其他濃度組GPT活性均顯著高于對(duì)照組(<0.05)。各濃度組GPT活性無(wú)顯著差異(0.05)(圖2a)。3.20和6.00 mg/L濃度組GOT活性顯著高于其他濃度組(0.05)，其他濃度組間無(wú)顯著差異(0.05)(圖2b)。

2.4 不同濃度亞硝酸鹽對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

除0.50 mg/L濃度組外，其他濃度組和基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(<0.05)。和基因表達(dá)量分別在6.00和3.20 mg/L濃度組達(dá)到最高(<0.05)(圖3a、圖3b)。、和基因均隨亞硝酸鹽濃度的增加呈降低的趨勢(shì)，各濃度組基因表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(<0.05)(圖3c～圖3e)。

2.5 不同濃度亞硝酸鹽對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

和基因表達(dá)量隨亞硝酸鹽濃度的增加總體呈先降低后升高的趨勢(shì)。各濃度組的基因表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(<0.05)，且各濃度組無(wú)顯著差異(>0.05)。6.00 mg/L濃度組的基因表達(dá)量升高，并顯著高于其他濃度組(<0.05)(圖4a、圖4b)。

基因表達(dá)量隨亞硝酸鹽濃度的增加呈波動(dòng)變化，0.50 mg/L濃度組達(dá)到最低并顯著低于對(duì)照組(<0.05)。0.90和6.00 mg/L濃度組顯著高于對(duì)照組(<0.05)。1.70和3.20 mg/L濃度組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(>0.05)(圖4c)。

圖2 不同濃度亞硝酸鹽對(duì)凡納濱對(duì)蝦GOT和GPT酶活性的影響

圖3 不同濃度亞硝酸鹽對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖4 不同濃度亞硝酸鹽對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

甲殼動(dòng)物在受到pH、重金屬等環(huán)境因子脅迫時(shí)，會(huì)發(fā)生生理功能紊亂和免疫功能下降(汪蕾等, 2016; Lyu,2014; 周萌等, 2015)，異物入侵會(huì)造成蝦的氧化損傷(Kultz, 2005)并最終導(dǎo)致細(xì)胞功能出現(xiàn)障礙，而抗氧化酶可幫助機(jī)體消除多余的自由基，從而使機(jī)體免受氧化損傷。SOD和CAT是凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)2種重要的抗氧化酶，可協(xié)同清除自由基(洪美玲等, 2007)。Zhang等(2015)對(duì)羅氏沼蝦進(jìn)行了氨氮和亞硝酸鹽的聯(lián)合急性脅迫實(shí)驗(yàn)，當(dāng)氨氮濃度為0 mg/L時(shí)，隨亞硝酸鹽濃度的升高，羅氏沼蝦血清中SOD活性先降低后升高。葛紅星等(2014)研究了不同濃度亞硝酸鹽(2、4、6和10 mg/L)急性脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫相關(guān)酶活性的影響，其中6和10 mg/L濃度組對(duì)各時(shí)間段的抗氧化酶活性有明顯的抑制作用，而其他濃度組不明顯。本研究中，除0.50 mg/L濃度組外，其他濃度組SOD活性均顯著升高，其中0.90和1.70 mg/L濃度組CAT活性顯著升高，較高濃度組(3.20和6.00 mg/L) CAT活性有一定程度的下降。這與上述研究結(jié)果不一致，原因可能是當(dāng)亞硝酸鹽濃度較低時(shí)出現(xiàn)“毒性興奮效應(yīng)”，而較高濃度的亞硝酸鹽則超出抗氧化酶的正常調(diào)節(jié)范圍。MDA是脂質(zhì)氧化過(guò)程中的產(chǎn)物(Liu, 2011)，其含量可反映機(jī)體所受的氧化損傷程度。本研究肝胰腺中各濃度組MDA含量升高時(shí)，SOD活性也相應(yīng)升高，說(shuō)明機(jī)體中的抗氧化酶活性會(huì)隨MDA含量的變化發(fā)生改變，以便及時(shí)幫助機(jī)體清除自由基。ACP和AKP是2種水解酶，在去磷酸化過(guò)程中起重要作用，且可參與機(jī)體解毒過(guò)程(何海琪等, 1992)。沈敏等(2019)研究發(fā)現(xiàn)，高鹽脅迫可使凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的ACP活性顯著升高，而當(dāng)鹽度高于45后，ACP活性降低。彭軍輝等(2018)研究發(fā)現(xiàn)，ACP和AKP活性隨氨氮脅迫時(shí)間的增加先升高后降低。本研究中，AKP與ACP活性總體呈升高的趨勢(shì)，未受到明顯抑制，原因可能是AKP和ACP仍在進(jìn)行解毒作用且亞硝酸鹽濃度沒(méi)有超出ACP和AKP的正常調(diào)節(jié)范圍。此外，GOT和GPT活性可反映機(jī)體肝組織健康狀態(tài)和功能，肝胰腺功能與免疫、代謝等能力息息相關(guān)，當(dāng)對(duì)蝦處于健康狀態(tài)時(shí)，血清中只有少量的轉(zhuǎn)氨酶；當(dāng)蝦肝組織受損時(shí)，肝細(xì)胞會(huì)向血淋巴中釋放大量轉(zhuǎn)氨酶(許宏慶等, 2006)。本研究中，除0.50 mg/L濃度組外，其他濃度組中的轉(zhuǎn)氨酶活性均顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明肝胰腺功能可能受到明顯影響。

肝胰腺是凡納濱對(duì)蝦重要的消化器官，具有代謝、消化和免疫等重要功能(蔣昊, 2009)，因此，肝胰腺是對(duì)蝦受到環(huán)境脅迫后的重要研究對(duì)象。Wang等(2009)研究發(fā)現(xiàn)，pH脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺基因的表達(dá)有誘導(dǎo)作用。本研究中，除0.50 mg/L濃度組外，其他濃度組肝胰腺基因表達(dá)量均顯著升高，與Wang等(2009)的結(jié)果相似，表明在亞硝酸鹽脅迫40 d后，肝胰腺中的SOD可能仍在發(fā)揮作用，且隨亞硝酸鹽濃度的增加，基因表達(dá)量升高以增強(qiáng)抗氧化能力。Zheng等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，日本對(duì)蝦()肝胰腺中基因表達(dá)量在高濃度亞硝酸鹽(20 mg/L)的影響下，短時(shí)間會(huì)明顯升高，但隨時(shí)間的增加，基因表達(dá)量逐漸降低。本研究中，基因表達(dá)量隨亞硝酸鹽濃度的增加顯著降低，原因可能是長(zhǎng)時(shí)間的亞硝酸鹽脅迫會(huì)對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，從而減少CAT的產(chǎn)生。值得注意的是，CAT酶量減少，但部分濃度組活性仍較高，造成該結(jié)果的原因有待研究。本研究中，基因表達(dá)量明顯升高，而基因則相反，表明凡納濱對(duì)蝦在SOD活性方面對(duì)亞硝酸鹽脅迫有較強(qiáng)適應(yīng)性。

硫氧還蛋白(TRX)是具有氧化還原活性的蛋白質(zhì)，屬于過(guò)氧化酶(PRX)家族。PRX廣泛存在于各種哺乳動(dòng)物、植物和無(wú)脊椎動(dòng)物中，具有多種生理功能，具有抗氧化、抗高溫等功能(Radyuk, 2003)。在無(wú)脊椎動(dòng)物中，PRX通過(guò)消除機(jī)體內(nèi)H2O2來(lái)參與體內(nèi)抗氧化反應(yīng)。郭慧等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽脅迫能顯著抑制凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中基因的表達(dá)。本研究各濃度組的基因表達(dá)量均顯著降低。說(shuō)明在長(zhǎng)時(shí)間的亞硝酸鹽脅迫下，肝胰腺中的TRX在抗亞硝酸鹽脅迫過(guò)程中被不斷消耗，且基因表達(dá)受到抑制。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(TGASE)在對(duì)蝦免疫功能中具有重要作用。Fagutao等(2012)研究發(fā)現(xiàn)，將日本對(duì)蝦基因沉默后，蝦體內(nèi)的血細(xì)胞數(shù)量顯著降低，同時(shí)抗菌肽和溶菌酶的基因表達(dá)顯著降低，細(xì)菌總數(shù)升高；Yao等(2019)研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白可與TGASE直接相互作用并調(diào)節(jié)其表達(dá)。以上研究表明，TGASE參與對(duì)蝦凝血過(guò)程。蝦類受到異物入侵時(shí)，血細(xì)胞會(huì)釋放TGASE并形成血漿蛋白(Maningas,2008)。盧芷程(2018)則發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌()可在短期內(nèi)誘導(dǎo)基因的表達(dá)，而隨時(shí)間延長(zhǎng)，基因表達(dá)量持續(xù)降低。說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間的環(huán)境脅迫會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)受到抑制。這與本研究結(jié)果基本一致，推測(cè)凡納濱對(duì)蝦的凝血功能可能受到一定程度的影響。

熱休克蛋白(HSPs)作為一種分子伴侶，可對(duì)各種外界刺激造成的細(xì)胞損傷進(jìn)行自我修復(fù)，并在蝦類的應(yīng)激反應(yīng)和先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用(雷愛(ài)瑩等, 2008)。當(dāng)蝦類機(jī)體內(nèi)自由基達(dá)到一定數(shù)量并超出機(jī)體消除自由基的能力后，熱休克蛋白基因會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)。董學(xué)興(2019)研究發(fā)現(xiàn)，短期氨氮脅迫可誘導(dǎo)羅氏沼蝦基因大量表達(dá)。本研究中，除0.50 mg/L濃度組外，其他濃度組基因表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，表明凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)自由基與抗氧化酶系統(tǒng)可能失衡，熱休克蛋白基因被誘導(dǎo)表達(dá)并參與機(jī)體修復(fù)。綜上所述，凡納濱對(duì)蝦總體上生理和免疫功能均受到抑制，但在SOD活性方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽會(huì)顯著抑制凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)。隨著亞硝酸鹽濃度的增加，體質(zhì)量增長(zhǎng)率和體長(zhǎng)增長(zhǎng)率均呈降低的趨勢(shì)，與肖威等(2020)的結(jié)果一致。本研究檢測(cè)的4種生長(zhǎng)相關(guān)基因均與凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)發(fā)育有非常密切的關(guān)系，其中，組織蛋白酶B (CTSB)在脊椎動(dòng)物中研究較多，它參與多種生理功能，如食物消化、免疫和蛻皮等過(guò)程(Wang, 2008; Stephen, 2012)。幾丁質(zhì)酶又被稱為殼多糖，是甲殼動(dòng)物在蛻皮過(guò)程中最重要的酶之一。呂黎等(2011)報(bào)道，幾丁質(zhì)酶在免疫方面起到一定作用。胰蛋白酶則具有消化食物和水解蛋白質(zhì)的功能。本研究中，各亞硝酸鹽濃度組胰蛋白酶基因和幾丁質(zhì)酶基因均顯著降低，表明凡納濱對(duì)蝦的消化功能受到了抑制。蝦類在遭受外界病原體或異物侵襲時(shí)，體內(nèi)的能量代謝會(huì)發(fā)生變化。由于外界環(huán)境的惡化，體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，包括DNA和蛋白質(zhì)損傷修復(fù)、細(xì)胞周期停滯或凋亡，并從細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)型至細(xì)胞的修復(fù)狀態(tài)(Kultz, 2005)。這些過(guò)程會(huì)消耗大量能量，從而影響蝦的生長(zhǎng)。本研究中，各濃度組胰蛋白酶基因和幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)量顯著降低，可能與凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)大量能量參與免疫調(diào)控及維持滲透壓平衡有關(guān)。李忠?guī)浀?2021)研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽可在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)迅速積累并加快其能量代謝，進(jìn)一步說(shuō)明亞硝酸鹽抑制凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的機(jī)制。郭慧等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽可顯著誘導(dǎo)基因的表達(dá)，之前郭慧等(2013)研究發(fā)現(xiàn)，CTSB可能參與細(xì)胞凋亡。本研究中，基因表達(dá)無(wú)明顯規(guī)律，可能因?yàn)樵摶蚬δ茌^復(fù)雜，未來(lái)需要作進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

在亞硝酸鹽濃度分別為0.50、0.90、1.70、3.20和6.00 mg/L，鹽度為5的水體中養(yǎng)殖40 d后，凡納濱對(duì)蝦各濃度組死亡率顯著升高，生長(zhǎng)性能和免疫功能受到阻遏，但在SOD活性方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性。各濃度組生長(zhǎng)相關(guān)酶基因表達(dá)量顯著降低，凡納濱對(duì)蝦消化功能受到抑制。此外，當(dāng)亞硝酸鹽濃度大于0.9 mg/L時(shí)，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺功能可能受到明顯影響。在鹽度為5條件下，為保證凡納濱對(duì)蝦的健康養(yǎng)殖，亞硝酸鹽濃度應(yīng)控制在0.50 mg/L以下。

CHEN J C, CHENG S Y. Hemolymph oxygen content, oxyhemocyanin, protein levels and ammonia excretion in the shrimpexposed to ambient nitrite. Journal of Comparative Physiology B Biochemical Systems and Environmental Physiology, 1995, 164(7): 530–535

CHENG S Y, CHEN J C. Accumulation of nitrite in the tissues ofexposed to elevated ambient nitrite after different time periods. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2000, 39(2): 183–192

DONG X X. Stress response ofto ammonia-N and its environmental effects in different culture patterns. Doctoral Dissertation of Shanghai Ocean University, 2019 [董學(xué)興. 羅氏沼蝦對(duì)氨氮的脅迫響應(yīng)及其不同養(yǎng)殖模式的環(huán)境效應(yīng). 上海海洋大學(xué)博士研究生學(xué)位論文, 2019]

FAGUTAO F F, MANINGAS M B, KONDO H,. Transglutaminase regulates immune-related genes in shrimp. Fish and Shellfish Immunology, 2012, 32(5): 711–715

GE H X, LI J, CHEN P,. Susceptibility ofto: The influence of environmental nitrite nitrogen. Journal of Fishery Sciences of China, 2014, 21(3): 629–636 [葛紅星, 李健, 陳萍, 等. 亞硝酸鹽氮脅迫下凡納濱對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌的易感性. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2014, 21(3): 629–636]

GUO H, TAN C T, YOU L Y,. Effects of nitrite stress on gene expression of antioxidant enzymes, heat shock protein and cathepsin B in hepatopancreas of. Journal of Guangdong Ocean University, 2017, 37(3): 117–122 [郭慧, 譚翠婷, 游林玉, 等. 亞硝酸鹽脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺抗氧化酶、熱休克蛋白和組織蛋白酶B基因表達(dá)量的影響. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 37(3): 117–122]

GUO H, XIAN J A, LI B,. Gene expression of apoptosis-related genes, stress protein and antioxidant enzymes in hemocytes of white shrimpunder nitrite stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology and Pharmacology, 2013, 157: 366–371

HE H Q, SUN F. Studies on the characteristics of acid and alkaline phosphatases in Chinese shrimp. Oceanologia et Limnologia Sinica, 1992, 23(5): 555–560 [何海琪, 孫鳳. 中國(guó)對(duì)蝦酸性和堿性磷酸酶的特性研究. 海洋與湖沼, 1992, 23(5): 555–560]

HONG M L, CHEN L Q, GU S Z,. Effects of ammonia exposure on immunity indicators of haemolymph and histological structure of hepatopancreas in Chinese mitten crab (). Journal of Fishery Sciences of China, 2007, 14(3): 412–418 [洪美玲, 陳立僑, 顧順樟, 等. 氨氮脅迫對(duì)中華絨螯蟹免疫指標(biāo)及肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2007, 14(3): 412–418]

HU Y B, WANG Y, JIANG N C. Effects of ammonia-N and nitrite-N on the hemocyte count and ultrastructure of.Journal of Zhejiang University (Science Edition), 2005, 32(6): 691–697 [胡義波, 王玥, 姜乃澄. 氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮對(duì)羅氏沼蝦血細(xì)胞及超微結(jié)構(gòu)的影響. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版), 2005, 32(6): 691–697]

JIANG H. Comparative proteomic profiles of the hepatopancreas inresponse to stresses. Doctoral Dissertation of Chinese Academy of Sciences (Institute of Oceanology), 2009 [蔣昊. 中國(guó)明對(duì)蝦在脅迫條件下肝胰臟的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究. 中國(guó)科學(xué)院研究生院(海洋研究所)博士研究生學(xué)位論文, 2009]

KULTZ D. Molecular and evolutionary basis of the cellular stress response. Annual Review of Physiology, 2005, 67: 225–257

LEI A Y, ZENG D G. Effects of compound Chinese herbal on the expression of heat stress protein 70 gene in white shrimp (). Journal of Southern Agriculture, 2008, 39(6): 830–833 [雷愛(ài)瑩, 曾地剛. 復(fù)方中草藥對(duì)凡納濱對(duì)蝦熱應(yīng)激蛋白70基因表達(dá)的影響. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 39(6): 830–833]

LI Z S, MA S, SHAN H W,. Accumulation of nitrite and responses of energy metabolism exposed to nitrite stress in. Journal of Fisheries of China, 2021, 45(11): 1825–1834 [李忠?guī)? 馬甡, 單洪偉, 等. 亞硝態(tài)氮脅迫下凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)亞硝態(tài)氮的積累與能量代謝響應(yīng). 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2021, 45(11): 1825–1834]

LIU L X, XI Q Y, YANG L,. The effect of dietarypolysaccharide extract on the immune responses in white shrimp,. Fish and Shellfish Immunology, 2011, 30(2): 495–500

LU Z C, XU L J, LU W Y,. Effects ofon hemocytes toxicity, apoptosis and immune-related genes in. Journal of Southern Agriculture, 2018, 49(12): 2559–2565 [盧芷程, 許鑾佳, 盧文宇, 等. 溶藻弧菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞毒性及細(xì)胞凋亡和免疫相關(guān)基因的影響. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2018, 49(12): 2559–2565]

Lü L, NING Q J. Research progress on the structure and function of chitinase gene in crustacean. Progress in Physiological Sciences, 2011, 42(6): 457–459 [呂黎, 寧黔冀. 甲殼動(dòng)物幾丁質(zhì)酶基因結(jié)構(gòu)與功能的研究進(jìn)展. 生理科學(xué)進(jìn)展, 2011, 42(6): 457–459]

LYU K, ZHU X X, Chen R,. Molecular cloning of manganese superoxide dismutase gene in the cladoceran: Effects of microcystin, nitrite, and cadmium on gene expression profiles. Aquatic Toxicology, 2014, 148(1): 55–64

MALLASEN M, WAGNER C V. Effect of nitrite on larval development of giant river prawn. Aquaculture, 2006, 261(4): 1292–1298

MANINGAS M, KONDO H, HIRONO I,. Essential function of transglutaminase and clotting protein in shrimp immunity. Molecular Immunology, 2008, 45(5): 1269–1275

PENG J H, CHEN L Y, CHENG C H,Acute toxicity of ammonia nitrogen toand its influence on immune factors in serum. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(5): 114–121 [彭軍輝, 陳麗英, 程長(zhǎng)洪, 等. 氨氮對(duì)擬穴青蟹的急性毒性及對(duì)其血清免疫相關(guān)酶活力的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(5): 114–121]

PENG Z R, ZANG W L, GAO Y,. Toxic effects of ammonia and nitrite onjuvenile. Journal of Shanghai Fisheries University, 2004, 13(3): 274–278 [彭自然, 臧維玲, 高楊, 等. 氨和亞硝酸鹽對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦的毒性影響. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 13(3): 274–278]

RADYUK S N, SOHAL R S, ORR W C. Thioredoxin peroxidases can foster cytoprotection or cell death in response to different stressors: Over- and under- expression of thioredoxin peroxidase incells. Biochemical Journal, 2003, 371(3): 743–752

SHEN M, ZHAO Y C, LING T,Effects of high-salt abrupt on growth and related enzyme activities in. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2019, 50(1): 204–209 [沈敏, 趙玉超, 凌濤, 等. 高鹽突變對(duì)凡納濱對(duì)蝦()生長(zhǎng)性能及相關(guān)酶活力的影響. 海洋與湖沼, 2019, 50(1): 204–209]

STEPHEN A, ROJO L, ARAUJO-BERNAL S,. Cathepsin B from the white shrimp: cDNA sequence analysis, tissues-specific expression and biological activity. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2012, 161(1): 32–40

TSENG I T, CHEN J C. The immune response of white shrimpand its susceptibility tounder nitrite stress. Fish and Shellfish Immunology, 2004, 17(4): 325–333

WANG L, ZHANG X X, ZHENG P H,.Effects of sulfide stress on expressions of antioxidant enzymes inhaemocytes. Sichuan Journal of Zoology, 2016, 35(6): 884–888 [汪蕾, 張秀霞, 鄭佩華, 等. 硫化物脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞抗氧化酶基因表達(dá)的影響. 四川動(dòng)物, 2016, 35(6): 884–888]

WANG W N, ZHOU J, WANG P,. Oxidative stress, DNA damage and antioxidant enzyme gene expression in the pacific white shrimp,when exposed to acute pH stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology and Pharmacology, 2009, 150(4): 428–435

WANG X M, LIU B Z, WANG G D,. Molecular cloning and functional analysis of cathepsin B in nutrient metabolism during larval development in. Aquaculture, 2008, 282(1/2/3/4): 41–46

WU Z H, LIU C B, LIU C R,.Histopathological research on chronic poisoning ofby nitrite and ammonia. Journal of Central China Normal University (Natural Sciences), 1999, 33(1): 119–122 [吳中華, 劉昌彬,劉存仁, 等. 中國(guó)對(duì)蝦慢性亞硝酸鹽和氨中毒的組織病理學(xué)研究. 華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 1999, 33(1): 119–122]

XIAO W, SHAN H W, MA S,. Effects of chronic nitrite stress on body composition and glucose metabolism of.Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(6): 74–81 [肖威, 單洪偉, 馬甡, 等. 亞硝態(tài)氮慢性脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦體成分和糖代謝的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(6): 74–81]

XV H Q, CUI Y H, LI J,. Effects of cadmium on some biochemical indexes in the serum of. Reservoir Fisheries, 2006, 26(5): 6–7, 20 [許宏慶, 崔勇華, 李晶, 等. 鎘對(duì)克氏原螯蝦血清中部分生化指標(biāo)的影響. 水利漁業(yè), 2006, 26(5): 6–7, 20]

YAO D, WANG Z, WEI M,. Analysis ofhemocyanin interacting proteins reveals its role in hemolymph clotting. Journal of Proteomics, 2019, 201: 57– 64

ZANG W L, JIANG M, ZHANG J D,. The toxic effects of NO2–-N and NH3-N onlarva. Journal of Shanghai Fisheries University, 1996, 5(1): 15–22 [臧維玲, 江敏, 張建達(dá), 等. 亞硝酸鹽和氨對(duì)羅氏沼蝦幼體的毒性. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 1996, 5(1): 15–22]

ZHANG Y F, YE C X, WANG A L,. Isolated and combined exposure to ammonia and nitrite in giant freshwater pawn (): Effects on the oxidative stress, antioxidant enzymatic activities and apoptosis in haemocytes. Ecotoxicology, 2015, 24: 1601–1610

ZHENG J B, MAO Y, SU Y Q,. Effects of nitrite stress on mRNA expression of antioxidant enzymes, immune-related genes and apoptosis-related proteins in. Fish and Shellfish Immunology, 2016, 58: 239– 252

ZHOU M, WU Z H, LIANG R S,. Biochemical and cellular immunological responses of Pacific white shrimp,to cold shock. Guangdong Agricultural Sciences, 2015, 24: 134–139 [周萌, 吳灶和, 梁日深, 等. 急性降溫對(duì)凡納濱對(duì)蝦血液生化指標(biāo)及細(xì)胞免疫指標(biāo)的影響. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 24: 134–139]

Changes in Immune System and Growth Performance ofafter 40-Day Challenge with Different Concentrations of Nitrite

FANG Cheng, LI Lanshi, LIANG Zhenyu, CHENG Liangfeng, DAI Xilin①

(Shanghai Ocean University, National Experimental Teaching Demonstration Center of Fisheries Science, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Key Laboratory of Freshwater Aquatic Germplasm Resources, Aquatic Animal Genetic Breeding Center Shanghai Collaborative Innovation Center, Shanghai 201306, China)

After 40 days of exposure to different concentrations of nitrate at a salinity of 5, the effect of nitrite on the immune system and growth performance ofwasexplored to provide a theoretical basis for constraining the effect of nitrite subacute stress on the speciesFive nitrite concentration groups (0.50, 0.90, 1.70, 3.20, and 6.00 mg/L) and a control group (0.05 mg/L) were used in this experiment. Furthermore, we detected the activity of immune-related enzymes, malondialdehyde (MDA) content, and relative expression of immune- and growth-related genes. Results showed that the mortality rate ofincreased with an increasing nitrite concentration, and the weight gain rate (WGR) and length gain rate (LGR) in the 6.00 mg/L group were significantly lower than those in the control group (<0.05). The activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), acid phosphatase (ACP), and alkaline phosphatase (AKP) in the serum and hepatopancreas increased under the influence of nitrite in 0.90 and 3.20 mg/L groups. The activity of SOD in the hepatopancreas was significantly higher than those in the control group when the concentration was higher than 0.50 mg/L (<0.05). CAT activities in the 0.50, 0.90, and 1.70 mg/L groups were significantly higher than those in the control group. The activity of SOD and CAT in the serum first decreased, then increased, and then decreased again with an increasing concentration of nitrite. The activities of AKP and ACP in the serum and hepatopancreas in the 0.90 mg/L group were significantly higher than those in the control group (<0.05). There was no obvious change in MDA content across groups. In addition, serum glutamic-pyruvic transaminase (GPT) activity was significantly higher in the serum than in the control group (<0.05). The results of quantitative real-time PCR showed that the relative expression ofandgenes in the hepatopancreas was significantly higher than that in the control group, except in the 0.50 mg/L concentration group (<0.05). The relative expression of,,,, andgenes in the hepatopancreas was significantly lower than that in the control group (<0.05). After 40 days of challenge with different concentrations of nitrite, the growth and immune function ofclearly diminished. The concentration of nitrite should be controlled below 0.50 mg/L in the production process at a salinity of 5 to ensure the healthy farming of.

; Nitrite; Enzyme activity; Environmental stress

DAI Xilin, E-mail:xldai@shou.edu.cn

10.19663/j.issn2095-9869.20210421001

S917.4

A

2095-9869(2022)04-0180-10

*上海市蝦類產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)項(xiàng)目(滬農(nóng)科[2014]第5號(hào))資助[This work was supported by Shanghai Shrimp Industry System Construction Project (Shanghai Agricultural Science [2014] No.5)]. 方 成，E-mail: 2414100497@qq.com

戴習(xí)林，教授，E-mail: xldai@shou.edu.cn

2021-04-21,

2021-06-18

http://www.yykxjz.cn/

方成, 黎蘭詩(shī), 梁震宇, 成良峰, 戴習(xí)林. 不同濃度亞硝酸鹽亞急性脅迫對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)與免疫功能的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2022, 43(4): 180–189

FANG C, LI L S, LIANG Z Y, CHENG L F, DAI X L. Changes in immune system and growth performance ofafter 40-day challenge with different concentrations of nitrite. Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(4): 180–189

(編輯 馬璀艷)