任家樂，韓曉露，楊 珍，張艷軍

·綜 述·

非化學(xué)修飾的藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用

任家樂，韓曉露，楊 珍*，張艷軍*

天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617

中醫(yī)藥是我國(guó)的科學(xué)與文化瑰寶，具有數(shù)千年的臨床用藥經(jīng)驗(yàn)。中醫(yī)藥在復(fù)雜疾病及慢性疾病防治方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，在當(dāng)前全球肆虐的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）防治中也彰顯了其優(yōu)勢(shì)，但由于作用機(jī)制不清楚等問題嚴(yán)重限制了其推廣應(yīng)用?；瘜W(xué)藥治療疾病作用機(jī)制明確，具有成熟的藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)，主要包括化學(xué)修飾技術(shù)和非化學(xué)修飾技術(shù)。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，應(yīng)用化學(xué)修飾技術(shù)進(jìn)行作用靶點(diǎn)的研究具有一定的局限性。因此，主要介紹細(xì)胞熱位移分析、分子對(duì)接技術(shù)、藥物親和反應(yīng)的靶點(diǎn)穩(wěn)定性和表面等離子共振技術(shù)等非化學(xué)修飾的藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)的原理、操作流程和應(yīng)用，并對(duì)其在中藥作用機(jī)制研究中的潛在優(yōu)勢(shì)與不足進(jìn)行討論，以期探索出一種中藥作用靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)模式，為中藥作用機(jī)制的闡明提供參考與借鑒，助推中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程。

非化學(xué)修飾的藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)；細(xì)胞熱位移分析；分子對(duì)接技術(shù)；藥物親和反應(yīng)的靶點(diǎn)穩(wěn)定性；表面等離子共振技術(shù)

中藥由于其多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)[1]，在許多復(fù)雜疾病治療方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)，且在當(dāng)前全球肆虐的新型冠狀病毒肺炎防治中也彰顯了其優(yōu)勢(shì)。近年來，西方國(guó)家對(duì)傳統(tǒng)藥物和植物藥的普遍重視和注冊(cè)政策的調(diào)整，為中藥發(fā)展提供了新的機(jī)遇，給中藥進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)提供了一個(gè)良好的契機(jī)。但中藥成分復(fù)雜、作用靶點(diǎn)不清楚等問題限制了其推廣應(yīng)用。目前，中藥作用機(jī)制多采用中藥方劑或主要成分作用于細(xì)胞或機(jī)體后所引起的整體蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組以及基因組表達(dá)變化的表觀性研究，未能通過這些表觀信號(hào)指標(biāo)的變化找到藥物成分的直接作用靶點(diǎn)，因此并未從真正意義上闡明其作用機(jī)制。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，與化學(xué)藥單成分、單靶點(diǎn)作用方式相比，作用方式更復(fù)雜，因此不能簡(jiǎn)單搬用化學(xué)藥的作用靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)對(duì)中藥的作用機(jī)制進(jìn)行研究。近年來，非化學(xué)修飾的藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)由于不需要對(duì)藥物結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾，在中藥研究中表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。本文主要總結(jié)了細(xì)胞熱位移分析（cellular thermal shift assay，CETSA）、分子對(duì)接技術(shù)、藥物親和反應(yīng)的靶點(diǎn)穩(wěn)定性（drug affinity responsive target stability，DARTS）和表面等離子共振技術(shù)（surface plasmon resonance，SPR）等非化學(xué)修飾的藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)的原理、操作流程和應(yīng)用，并對(duì)其在中藥作用機(jī)制研究中的潛在優(yōu)勢(shì)與不足進(jìn)行討論，最終提出了一種中藥直接靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)模式，以期為中藥作用機(jī)制的研究提供參考與借鑒。

1 CETSA

1.1 原理

CETSA由Molina等[2]于2013年首次提出，是一種基于配體誘導(dǎo)的靶蛋白熱力學(xué)穩(wěn)定性改變的原理研究藥物靶點(diǎn)的方法。具體為將細(xì)胞或組織[3]置于一定溫度下加熱，非藥物結(jié)合蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)在該溫度下發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變，從而發(fā)生受熱變性，失去蛋白質(zhì)分子的功能；結(jié)合了藥物的靶蛋白，其結(jié)構(gòu)變得穩(wěn)定，在相同溫度下不易變性。通過給藥與不給藥處理后，在一定溫度下對(duì)不同樣本進(jìn)行處理，離心、濾過去除不溶性成分，通過銀染技術(shù)檢測(cè)上述處理后各組蛋白質(zhì)情況或利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)上述銀染檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的差異條帶蛋白進(jìn)行鑒定（圖1）。

1.2 操作流程

在CETSA方法中，將未給藥的細(xì)胞和組織與給藥組加熱至相同的溫度，冷卻后用細(xì)胞裂解液裂解，然后將樣品研磨、離心去除不溶性的沉淀，取可溶性蛋白的上清液，利用電泳分離各組蛋白，通過銀染法對(duì)比不同組間蛋白條帶，對(duì)差異條帶蛋白利用質(zhì)譜進(jìn)行分析，結(jié)合特異性肽段鑒定，獲得藥物直接靶點(diǎn)的信息（圖1）。

圖1 CETSA操作流程

1.3 應(yīng)用

近年來，不同學(xué)者在CETSA基礎(chǔ)上發(fā)展了多種藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)，如2014年由Savitski等[4]將CETSA方法與多重定量質(zhì)譜法聯(lián)用，提出的熱蛋白質(zhì)組分析（thermal proteome profling，TPP），TPP原理在本質(zhì)上與CETSA方法完全一致，不同之處在于TPP方法能夠同時(shí)檢測(cè)全蛋白質(zhì)組在多個(gè)溫度下的熱變性狀態(tài)，并繪制出完整的熔化曲線，確定每種蛋白質(zhì)的熱位移變化，因此TPP又被稱為MS-CETSA。此外，在TPP技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了等溫劑量響應(yīng)指紋圖譜方法，該方法是在CETSA技術(shù)通過描繪不同處理（加熱與否）后蛋白的熱熔化曲線來獲取蛋白質(zhì)熱熔化中點(diǎn)位移溫度，通過等溫劑量相關(guān)的實(shí)驗(yàn)確定藥物劑量與藥物靶蛋白結(jié)合之間的關(guān)系，從而測(cè)定藥物分子與靶蛋白相互作用的親和力[5]。

CETSA技術(shù)目前在國(guó)內(nèi)外藥物靶點(diǎn)研究中得到廣泛應(yīng)用。林兵[6]對(duì)豆豉姜中的活性成分LC36抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶激酶1和組織蛋白酶K是LC36抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用靶點(diǎn)。陳香云[7]利用CETSA技術(shù)發(fā)現(xiàn)新藤磺酸可以通過抑制去泛素化酶9X的活性加速干細(xì)胞因子的降解，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Savitski等[4]利用CETSA技術(shù)在人類髓性白血病K562細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了蛋白酶抑制劑如絲氨酸酶抑制劑維羅非尼和間變性淋巴瘤激酶抑制劑阿來替尼中的靶標(biāo)亞鐵螯合酶，該酶的失活是產(chǎn)生嚴(yán)重光敏反應(yīng)的原因。Mateus等[8]利用TPP法考察大腸桿菌的生長(zhǎng)周期和抗菌藥物的分子作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)抗菌藥物氨芐西林耐受的β-內(nèi)酰胺酶同樣也是氨芐西林的作用靶點(diǎn)。Dziekan等[9]利用TPP法發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲嘌呤核苷酸磷酸化酶是抗虐藥物奎寧和甲氟奎的共同結(jié)合靶點(diǎn)。Sridharan等[10]利用多重定量質(zhì)譜法與CETSA聯(lián)用，得到了三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)復(fù)合物穩(wěn)定性和溶解度的定量蛋白質(zhì)組圖譜，從而揭示了ATP作為底物和變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的高親和力相互作用。Vasaturo等[11]運(yùn)用CETSA技術(shù)發(fā)現(xiàn)抗腫瘤活性藥物冬凌草甲素與核仁素蛋白具有直接相互作用，表明其可結(jié)合核仁素蛋白并抑制其功能。

1.4 潛在優(yōu)勢(shì)與不足

CETSA技術(shù)操作簡(jiǎn)便，受其他因素干擾程度小，能夠直接在活細(xì)胞或整體組織水平進(jìn)行研究，只要保證加熱時(shí)間和溫度恒定，即使在藥物成分不明確的情況下也可對(duì)其進(jìn)行作用靶點(diǎn)的研究。由于中藥成分復(fù)雜且在臨床上多以復(fù)方形式應(yīng)用，因此很難對(duì)其進(jìn)行全部分析。故可以在藥效劑量下進(jìn)行體內(nèi)CETSA實(shí)驗(yàn)，直接對(duì)其作用靶點(diǎn)進(jìn)行研究，通過快速銀染試劑盒發(fā)現(xiàn)差異條帶蛋白，利用質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)可能與藥物結(jié)合的蛋白進(jìn)行鑒定。近年來，CETSA技術(shù)與高分辨率質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，已廣泛應(yīng)用于植物、人類細(xì)胞、大腸桿菌等多種生物體，是目前藥物靶點(diǎn)篩選常用的方法之一[12]。然而，CETSA技術(shù)存在一些缺點(diǎn)，首先，在加熱后加入蛋白裂解液等強(qiáng)細(xì)胞裂解液會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，而膜上的許多蛋白可能是藥物的靶點(diǎn)，因此該方法會(huì)導(dǎo)致尋找小分子藥物靶點(diǎn)不完全，即使不使細(xì)胞膜破裂，加熱后也會(huì)改變細(xì)胞膜的通透性，造成原本不能進(jìn)入細(xì)胞的藥物進(jìn)入細(xì)胞結(jié)合胞漿內(nèi)蛋白，導(dǎo)致后續(xù)結(jié)合蛋白鑒定時(shí)假陽性的結(jié)果，目前可使用較溫和的NP-40裂解液代替蛋白裂解液從而保持膜蛋白的完整[13-14]。其次，非特異性蛋白質(zhì)的干擾是該方法面臨的一個(gè)困擾，一些低豐度的靶向蛋白可能會(huì)被高豐度的非靶向蛋白所淹沒，即使用“鳥槍法”定量蛋白組學(xué)也很難檢測(cè)出低豐度的靶向蛋白。此外，將中藥或復(fù)方給藥進(jìn)行分析后只能得到中藥/復(fù)方整體的作用靶點(diǎn)，并不能獲得成分-靶點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)的信息，如果采用中藥單成分進(jìn)行研究，由于中藥成分復(fù)雜且無法全部獲得，需多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)才能獲得成分直接作用的靶點(diǎn)信息，因此單獨(dú)使用該方法進(jìn)行中藥直接靶點(diǎn)的研究尚存在不足，需與其他方法聯(lián)用獲得中藥的確切作用靶點(diǎn)。

2 分子對(duì)接技術(shù)

2.1 原理

近年來，分子對(duì)接技術(shù)被廣泛用于中藥成分作用靶點(diǎn)的研究。在靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)已知的情況下，可采用分子對(duì)接技術(shù)研究小分子化合物與大分子生物受體間的相互作用，預(yù)測(cè)中藥成分的作用靶點(diǎn)[15-16]。根據(jù)蛋白質(zhì)與酶結(jié)合的假說原理分為2種[17]，其一為“鎖-鑰”學(xué)說，于1894年首次提出，該原理簡(jiǎn)單易懂，配體與受體之間既要滿足能量匹配，同時(shí)也要滿足互補(bǔ)匹配原則，但對(duì)配體與受體在結(jié)合前后三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，該原理并不能很好的解釋；其二為誘導(dǎo)契合學(xué)說，該方法于1958年首次提出，底物與酶相互作用時(shí)，酶的構(gòu)象會(huì)隨著底物結(jié)構(gòu)的改變發(fā)生誘導(dǎo)，兩者相互契合，進(jìn)而形成酶-底物復(fù)合物，當(dāng)藥物與酶發(fā)生解離時(shí)，酶的構(gòu)象又重新恢復(fù)到最初構(gòu)象。常用的分子對(duì)接方法有3種：剛體對(duì)接，即在對(duì)接過程中均不考慮配體、受體的構(gòu)象[18]；半柔體對(duì)接，指在對(duì)接過程中，僅考慮配體的多個(gè)構(gòu)象，將受體視為剛性結(jié)構(gòu)；柔體對(duì)接，在對(duì)接過程中同時(shí)考慮配體和受體的多個(gè)構(gòu)象，該方法精度很高，但此方法要求較大的計(jì)算量和較長(zhǎng)的時(shí)間，而且對(duì)計(jì)算機(jī)要求較高。目前，有多種軟件可進(jìn)行分子對(duì)接研究，常用的軟件有AutoDock、Dock、sybyl、Discovery Studio等[19]。

2.2 操作流程

分子對(duì)接技術(shù)的具體流程：首先獲得蛋白結(jié)構(gòu)，并對(duì)其進(jìn)行加氫、去水、定義活性位點(diǎn)等前處理；然后，對(duì)篩選的小分子添加力場(chǎng)，計(jì)算小分子的多個(gè)構(gòu)象；隨后利用分子對(duì)接模塊計(jì)算藥物小分子與蛋白活性位點(diǎn)的相互作用結(jié)合能[20]；最后，通過綜合分析藥物小分子與活性位點(diǎn)關(guān)鍵氨基酸相互作用及軟件打分情況，預(yù)測(cè)藥物小分子的作用靶點(diǎn)（圖2）。

圖2 分子對(duì)接技術(shù)簡(jiǎn)要流程圖

2.3 應(yīng)用

目前，分子對(duì)接技術(shù)已廣泛用于中藥活性成分及作用靶點(diǎn)的研究。李婧等[21]通過分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷E、B1、D、F、B2、C2、A和甘草酸等多種成分與SARS冠狀病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）3CL水解酶（Mpro）蛋白均具有較好的親和力，為抗SARS-CoV-2藥物研究及處方篩選提供參考。沈霞等[22]采用分子對(duì)接技術(shù)利用AutoDock 4.2軟件篩選連翹作用于IL-6的抗炎成分，最后證實(shí)齊墩果酸、樺木酸和樺木酮酸具有顯著的抗炎作用。王芳芳等[23]通過分子對(duì)接技術(shù)研究車前草活性成分的抗炎機(jī)制，篩選出排名前7的抗炎活性成分，包括桃葉珊瑚苷、車前草苷B等，這與報(bào)道的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。鄭春松等[24]利用Discovery Studio進(jìn)行分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)羌活治療骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)為白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），且與靶點(diǎn)主要結(jié)合的活性成分為香豆素苷類化合物香柑酚--β--吡喃葡萄糖苷等。Yadav等[25]利用分子對(duì)接軟件Scigress Explorer發(fā)現(xiàn)沉香木油的有效成分沉香螺旋醇、沉香雅檻藍(lán)醇和茅蒼術(shù)醇與炎癥靶標(biāo)IL-1、IL-6、TNF-α和環(huán)氧合酶-1有很好的結(jié)合力，具有較好的抗炎潛力。谷宇等[26]利用分子對(duì)接軟件Discovery Studio確定大黃中的revandchinone 4、羌活中的二十三烷酸和二十四烷酸以及秦艽中的褐煤酸甲酯這4個(gè)成分為靶標(biāo)5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）和白三烯A4水解酶（leukotriene A4 hydrolase，LTA4H）的雙效抑制劑，為大黃、姜活和秦艽3味中藥具有確切抗炎活性提供了證據(jù)。

2.4 潛在優(yōu)勢(shì)與不足

中藥多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)使其作用機(jī)制的研究變得異常復(fù)雜。分子對(duì)接具有高效、快速、低成本的優(yōu)點(diǎn)，近年來在中藥研究中得到廣泛應(yīng)用。隨著計(jì)算機(jī)性能的不斷提高，利用分子對(duì)接技術(shù)可快速、批量預(yù)測(cè)中藥成分的作用靶點(diǎn)。此外，利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)中藥成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行研究，可獲得成分-靶點(diǎn)一對(duì)一的關(guān)系。但是分子對(duì)接結(jié)果僅為預(yù)測(cè)結(jié)果，后期需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證才能確定中藥成分的作用靶點(diǎn)。在藥效劑量下進(jìn)行體內(nèi)的CETSA實(shí)驗(yàn)只能獲得中藥成分潛在靶點(diǎn)的信息，但具體哪些成分作用于哪些靶點(diǎn)并不清楚，故可在CETSA的基礎(chǔ)上，利用分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)中藥成分潛在的藥物靶點(diǎn)，以及作用于特定靶點(diǎn)的中藥成分。

3 DARTS

3.1 原理

DARTS的概念最早由Lomenick等[27]于2009年提出，其原理為靶蛋白與藥物小分子結(jié)合后對(duì)蛋白酶的敏感性降低。直觀地說，與藥物結(jié)合后的小分子不易被蛋白酶水解，與對(duì)照組相比，通過銀染技術(shù)檢測(cè)差異蛋白條帶，采用質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)銀染檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的差異條帶蛋白進(jìn)行鑒定。

3.2 操作流程

DARTS實(shí)驗(yàn)的操作流程：首先培養(yǎng)可能含有目的靶點(diǎn)的細(xì)胞，該細(xì)胞盡量包含較全的蛋白，收集足量細(xì)胞，提取蛋白，然后蛋白定量，調(diào)整蛋白液濃度；分組、藥物處理及孵育，最后通過銀染等技術(shù)對(duì)比不同組間的蛋白條帶；對(duì)差異條帶蛋白利用質(zhì)譜進(jìn)行分析，結(jié)合特異性肽段鑒定，獲得藥物直接靶點(diǎn)的信息（圖3）。一些關(guān)鍵的試劑如蛋白酶、細(xì)胞裂解液和緩沖液的選擇是決定DARTS實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，合適的蛋白酶種類以及濃度是DARTS操作的關(guān)鍵點(diǎn)，目前常用于DARTS技術(shù)的蛋白酶有枯草桿菌蛋白酶[28]、嗜熱菌蛋白酶[29-31]和鏈霉菌蛋白酶[32-34]。

3.3 應(yīng)用

目前，國(guó)內(nèi)外已對(duì)該方法進(jìn)行廣泛研究。Tanabe等[35]利用DARTS技術(shù)發(fā)現(xiàn)苦參堿可作用于熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90），同時(shí)能增強(qiáng)HSP90的伴侶活性。Kost等[29]利用DARTS技術(shù)證實(shí)p68RNA螺旋酶是RX-5902的一個(gè)細(xì)胞靶點(diǎn)，從而達(dá)到治療癌癥的目的。Chin等[36]發(fā)現(xiàn)作為三羧酸循環(huán)中的重要中間代謝產(chǎn)物，α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）可延長(zhǎng)線蟲的壽命，DARTS技術(shù)證實(shí)α-KG的作用靶標(biāo)為ATP合成酶的β亞基，α-KG可以使ATP合成能力下降，減少了氧的消耗，揭示了α-KG介導(dǎo)長(zhǎng)壽的機(jī)制。Yang等[37]聯(lián)合運(yùn)用DARTS技術(shù)和免疫沉淀液相色譜/質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)的有效成分柚皮素及體內(nèi)代謝物可與腦神經(jīng)元上的腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2結(jié)合，從而促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)，改善阿爾茨海默病的癥狀。Kim等[38]利用DARTS實(shí)驗(yàn)表明異澤蘭黃素具有穩(wěn)定鈣調(diào)蛋白免受蛋白水解酶的作用，從而揭示了其與鈣調(diào)蛋白之間的相互作用。Robinson等[39]利用高通量篩選方法得出雙硫侖具有抑制多種三陰性乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，并用DARTS技術(shù)揭示了其直接作用靶標(biāo)為IO基序因子IQGAP1和MYH9，F(xiàn)leta-Soriano等[40]發(fā)現(xiàn)黏細(xì)菌代謝產(chǎn)物Ratjadone A具有體外抑制人免疫缺陷病毒感染的作用，并利用DARTS技術(shù)揭示了其可通過結(jié)合核輸出蛋白1（RanGTPase-dependent export mediators，Exportin1）/染色體區(qū)域穩(wěn)定蛋白1（chromosome region maintenance 1，CRM1），抑制CRM1蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子-病毒顆粒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子（CRM1-regulator of virion protein expression，CRM1-Rev-ES）復(fù)合物的形成，干擾Exportin1/CRM1對(duì)Rev蛋白中亮氨酸富集區(qū)信號(hào)的識(shí)別，從而抑制人免疫缺陷病毒非剪接或部分剪接的mRNA基因組的核輸出。

圖3 DARTS操作流程

3.4 潛在優(yōu)勢(shì)與不足

DARTS技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、不需要對(duì)研究的小分子進(jìn)行修飾等優(yōu)勢(shì)，為目前常用的尋找小分子藥物靶點(diǎn)的方法之一。但是，由于DARTS技術(shù)使用體外提取的蛋白對(duì)藥物靶點(diǎn)進(jìn)行研究，因此無法真實(shí)反映藥物在體內(nèi)的作用情況，這也是其與CETSA技術(shù)最大的區(qū)別[41]。在中藥作用機(jī)制研究中DARTS既可以同CETSA技術(shù)一樣作為篩選藥物靶點(diǎn)的手段，也可以在分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)藥物作用于蛋白之后進(jìn)行單成分或中藥提取物作用靶點(diǎn)的驗(yàn)證。

4 SPR

4.1 原理

SPR最早由瑞典科學(xué)家Liedberg等首次提出，借助電磁波在金屬和電介質(zhì)交界面上激勵(lì)形成影響電磁波傳播的諧振波的現(xiàn)象以研究2種物質(zhì)相互作用的情況[42-46]，通過測(cè)定共振角的變化以檢測(cè)生物分子間的相互作用，用于探索分子間有無結(jié)合以及相互作用的親和力、結(jié)合/解離的快慢。原理為當(dāng)一束光照射到玻璃表面的金屬膜發(fā)生全反射且入射光波向量與金屬膜內(nèi)表面電子的振蕩頻率一致時(shí)，金屬電子吸收光能發(fā)生共振，從而使反射光的強(qiáng)度達(dá)到最?。▓D4）[47]。

4.2 操作流程

操作流程：首先對(duì)芯片表面進(jìn)行預(yù)處理，設(shè)置系統(tǒng)溫度，用純水沖洗管道，通過HBS-EP緩沖液平衡系統(tǒng)至基線穩(wěn)定；其次使用氨基偶聯(lián)試劑盒中不同pH的醋酸鈉緩沖液稀釋靶標(biāo)蛋白，確定合適的蛋白偶聯(lián)pH；使用篩選得到的最合適的pH偶聯(lián)緩沖液稀釋靶標(biāo)蛋白至一定濃度，應(yīng)用蛋白固定自動(dòng)化程序進(jìn)行氨基偶聯(lián)最后結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)力學(xué)測(cè)定，計(jì)算分離率和結(jié)合常數(shù)，最終確定待測(cè)藥物的直接靶點(diǎn)及與之相結(jié)合的成分[48]。

4.3 應(yīng)用

近年來，SPR技術(shù)在免疫球蛋白G抗體與其抗原相互反應(yīng)的測(cè)定、微生物檢測(cè)[49-54]、免疫生化物質(zhì)檢測(cè)[55-58]、中藥活性成分篩選及作用靶點(diǎn)研究中得到廣泛應(yīng)用。Yue等[59]通過反向?qū)蛹夹g(shù)預(yù)測(cè)靈芝酸D能與14-3-3蛋白家族的亞型蛋白結(jié)合，并利用SPR傳感器對(duì)其結(jié)合能力進(jìn)行驗(yàn)證，得到21個(gè)能夠與靈芝酸D結(jié)合的蛋白。Jiang等[60]首先對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）的催化激酶結(jié)構(gòu)域（MMP-9 CD）進(jìn)行表達(dá)，將純化的MMP-9 CD固定在SPR芯片表面，對(duì)丹酚酸A與其他7種酚酸類化合物進(jìn)行SPR檢測(cè)，證明MMP-9是丹酚酸A的結(jié)合位點(diǎn)。Zheng等[61]將脂質(zhì)A固定在SPR芯片上，利用SPR生物傳感器篩選60種中藥提取物中的活性成分，得出京尼平苷可作為治療膿毒癥先導(dǎo)化合物的結(jié)論。研究發(fā)現(xiàn)牛蒡子主要成分牛蒡子苷元可通過增加足細(xì)胞黏附來保護(hù)高糖所致的細(xì)胞損傷，首先利用DARTS技術(shù)發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元可通過激活蛋白磷酸酶2A緩解炎性反應(yīng)以保護(hù)腎臟，再利用SPR技術(shù)確認(rèn)牛蒡子苷元與蛋白磷酸酶2A的結(jié)合能較強(qiáng)（D＝0.062 μmol/L）[62-63]。邵欣欣等[64]將炎性反應(yīng)遞質(zhì)半胱氨酰白三烯合成的限速酶5-LOX，通過分子對(duì)接和藥效團(tuán)構(gòu)建模塊進(jìn)行計(jì)算機(jī)虛擬篩選后，再利用SPR技術(shù)確認(rèn)17種中藥的11個(gè)黃酮類小分子能與5-LOX結(jié)合。何田等[65]利用液相色譜-熒光檢測(cè)方法篩選出苯乙醇苷等17種化合物，再通過SPR技術(shù)確認(rèn)齊墩果酸、牛蒡子苷等10個(gè)特異性結(jié)合化合物為乳腺癌新靶標(biāo)14-3-3τ蛋白的特異性結(jié)合化合物。

圖4 SPR原理

4.4 潛在優(yōu)勢(shì)與不足

與傳統(tǒng)的相互作用相比，SPR技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于進(jìn)樣量小，可檢測(cè)樣品數(shù)量多，方法靈敏且精確度高，無需標(biāo)記樣品，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，且在大多數(shù)情況下不需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果可信度強(qiáng)[66-67]。在中藥靶點(diǎn)研究中，其最大的優(yōu)點(diǎn)是可以獲得藥物-蛋白一對(duì)一的作用關(guān)系。但是，在低濃度、小分子樣品的檢測(cè)和藥物在體內(nèi)非特異性蛋白分子結(jié)合的研究中存在一定的限制[68-69]。其次，SPR技術(shù)僅對(duì)距離傳感器金屬表面幾百納米內(nèi)的折射率變化具有檢測(cè)效應(yīng)。此外，使用SPR技術(shù)時(shí)需要中藥成分標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白溶液作為參照物，而中藥標(biāo)準(zhǔn)品、蛋白溶液成本高、不易制備，因此限制了其在中藥成分作用靶點(diǎn)廣泛研究中的應(yīng)用。但如果對(duì)特定成分、特定靶點(diǎn)進(jìn)行研究，可獲得較準(zhǔn)確的信息，因此可將其與其他技術(shù)結(jié)合驗(yàn)證中藥成分的作用靶點(diǎn)。

5 結(jié)語與展望

中藥由于其組成成分較多，往往一種成分會(huì)同時(shí)作用于多個(gè)靶點(diǎn)或多種有效成分作用于一種靶點(diǎn)，并且單一方法在中藥靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)中存在著各自的優(yōu)勢(shì)和不足（表1），因此僅僅使用上述單一方法并不能找到準(zhǔn)確的靶點(diǎn)，并且可能會(huì)造成目標(biāo)靶點(diǎn)尋找的遺漏或出現(xiàn)假陽性結(jié)果。筆者提出一種方法：首先使用CETSA技術(shù)檢測(cè)體內(nèi)活性成分或利用DARTS技術(shù)檢測(cè)體外成分，再利用快速銀染技術(shù)檢測(cè)不同處理后差異蛋白條帶，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)差異條帶蛋白進(jìn)行鑒定，獲得潛在的作用靶點(diǎn)，再用分子對(duì)接技術(shù)將中藥成分與上述獲得的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接研究，得到成分-靶點(diǎn)潛在一對(duì)一關(guān)系，最后利用DARTS技術(shù)與Western blotting聯(lián)用或SPR技術(shù)對(duì)單一成分進(jìn)行靶點(diǎn)確證（圖5）。綜合應(yīng)用上述非化學(xué)修飾藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)，可充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)，避免各自的不足，最終，明確中藥成分的直接靶點(diǎn)，為中藥作用機(jī)制的闡明提供參考與借鑒，助推中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程。

表1 常用非化學(xué)修飾的藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)的比較

Table 1 Comparison on commonly used non-chemical modification drug target discovery techniques

技術(shù)共同點(diǎn)優(yōu)勢(shì)不足 CETSA、DARTS可發(fā)現(xiàn)中藥的直接靶點(diǎn)（結(jié)合靶點(diǎn)）或結(jié)合成分可批量獲得中藥成分的直接靶點(diǎn)不能批量獲得成分-靶點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)關(guān)系；成本相對(duì)較高 分子對(duì)接技術(shù)速度快、成本低，可獲得靶點(diǎn)-成分一對(duì)一關(guān)系僅預(yù)測(cè)結(jié)果，需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 SPR可獲得靶點(diǎn)-成分一對(duì)一關(guān)系不能批量獲得中藥直接靶點(diǎn)；成本相對(duì)較高

圖5 非化學(xué)修飾的藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)聯(lián)用尋找中藥潛在藥物靶點(diǎn)的流程

中藥具有成分復(fù)雜，在臨床上多以復(fù)方形式應(yīng)用且具有多成分、多靶點(diǎn)、多層次和多環(huán)節(jié)的作用特點(diǎn)，因此，化學(xué)修飾的藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)在中藥作用機(jī)制研究中具有一定局限性。非化學(xué)修飾的藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)由于不需對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾、易于操作且具有通用性，更適合于具有多成分、多靶點(diǎn)特色的中藥研究，本文主要介紹了幾種非化學(xué)修飾的藥物靶點(diǎn)技術(shù)的原理、操作流程、應(yīng)用及在中藥作用機(jī)制研究中的潛在優(yōu)勢(shì)與不足，由于單獨(dú)使用一種小分子靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)技術(shù)不能排除假陽性的產(chǎn)生，故提出一種綜合應(yīng)用幾種技術(shù)以解決中藥作用靶點(diǎn)的研究模式，以期為中藥作用機(jī)制的研究提供參考與借鑒。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Application of non-chemical modification drug target discovery techniques in traditional Chinese medicine

RENJia-le, HAN Xiao-lu,YANGZhen, ZHANG Yan-jun

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China

Traditional Chinese medicine (TCM) is a science and cultural treasure of our country, with thousands of years of clinical experience in medication. TCM has significant advantages in prevention and treatment of complex diseases and chronic diseases, and has also demonstrated its advantages in prevention and treatment of corona virus disease 2019 (COVID-19) that is currently raging around the world, but due to unclear mechanism problem, the promotion and application of TCM have been seriously limited. Mechanism of Western medicine is clear, and it has mature drug target discovery technology, mainly including chemical modification technology and non-chemical modification technology. Due to the characteristics of multi-component, multi-target action of TCM, the application of chemical modification technology in TCM mechanism study has certain limitations. Thus, the principle, operation steps and application of non-chemically modified drug target technology such as cellular thermal shift assay, molecular docking, drug affinity responsive target stability, surface plasmon resonance are introduced in this paper. The potential advantages and disadvantages of such non-chemically modified drug target technologies are discussed in the study on mechanism of TCM, in order to explore a target discovery model of TCM target discovery, provide reference for elucidating the mechanism of TCM, and promote the modernization process of TCM.

non-chemical modification drug target discovery technique; cellular thermal shift assay; molecular docking; drug affinity responsive target stability; surface plasmon resonance

R284

A

0253 - 2670(2022)17 - 5513 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.029

2022-03-04

天津市教委科研計(jì)劃項(xiàng)目（2017KJ132）

任家樂，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幚?。E-mail: 1158402404@qq.com

張艷軍，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幩幚怼-mail: zyjsunye@163.com

楊 珍，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幮畔W(xué)。E-mail: yzwygb@126.com

[責(zé)任編輯 崔艷麗]