賀潤(rùn)鋮，黃芷棋，馮倩倩，寧一博，孫建寧，張碩峰，董世芬

天山雪蓮對(duì)老年脂質(zhì)代謝異常（氣虛血瘀型）小鼠的改善作用及機(jī)制研究

賀潤(rùn)鋮，黃芷棋，馮倩倩，寧一博，孫建寧，張碩峰，董世芬*

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 中藥藥理系，北京 102488

結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究天山雪蓮對(duì)老年脂質(zhì)代謝異常（氣虛血瘀型）小鼠的影響與作用機(jī)制。采用高脂喂食配合力竭游泳建立擬臨床老年脂質(zhì)代謝異常（氣虛血瘀型）小鼠模型，設(shè)置對(duì)照組、模型組、羅格列酮組及天山雪蓮低、中、高劑量（0.3、0.9、1.8 g/kg）組，各給藥組連續(xù)給藥5周。檢測(cè)各組小鼠葡萄糖耐量、血脂等指標(biāo)；HE染色檢測(cè)脂肪組織形態(tài)；定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測(cè)脂肪組織解偶聯(lián)蛋白-1（uncoupling protein 1，）、DNA聚合酶γ1（DNA polymerase γ1，）基因表達(dá)；免疫組化法檢測(cè)脂肪組織UCP1的蛋白表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究作用機(jī)制，將棕色脂肪細(xì)胞分為對(duì)照組、羅格列酮組及天山雪蓮低、中、高劑量（0.025、0.05、0.1 mg/mL）組。qRT-PCR法檢測(cè)棕色脂肪細(xì)胞中、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coacti-vator-1α，）、核呼吸因子1（nuclear respiratory factor 1，）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，）、PR結(jié)構(gòu)域蛋白16（positive regulatory domain-containing 16，）、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，）的基因表達(dá)；免疫熒光法和Mito Tracker染色檢測(cè)棕色脂肪細(xì)胞Ucp1蛋白表達(dá)水平及線粒體數(shù)量。與對(duì)照組比較，模型小鼠表現(xiàn)對(duì)抗性減弱、舌質(zhì)出現(xiàn)紫瘀等氣虛血瘀的表征，空腹血糖、曲線下面積（area under curve，AUC）、腹股溝白色脂肪組織（inguinal white adipose tissue，iWAT）指數(shù)及總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）含量顯著升高（＜0.01），棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）指數(shù)顯著降低（＜0.01），BAT和iWAT白色化特征明顯且Ucp1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)顯著減少（＜0.01）。與模型組對(duì)比，天山雪蓮給藥組小鼠血脂指標(biāo)、糖代謝指標(biāo)、iWAT指數(shù)顯著改善（＜0.01），BAT指數(shù)顯著升高（＜0.05），iWAT和BAT形態(tài)棕色化特征明顯，BAT中、等基因表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01），脂肪組織中Ucp1蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）。體外實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，天山雪蓮干預(yù)后棕色脂肪細(xì)胞基因表達(dá)水平及線粒體數(shù)量和Ucp1蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.05、0.01）。天山雪蓮?fù)ㄟ^(guò)調(diào)控脂肪可塑性，促進(jìn)白色脂肪棕色化以及棕色脂肪活化，進(jìn)而提高線粒體功能改善老年小鼠氣虛血瘀型脂質(zhì)代謝異常。

天山雪蓮；氣虛血瘀證；脂質(zhì)代謝異常；脂肪可塑性；線粒體

隨著中國(guó)老齡人口數(shù)量快速增加，老年病已經(jīng)嚴(yán)重影響老年人的健康和生活質(zhì)量[1]。氣虛血瘀是老年病常見的病因病機(jī)，是誘發(fā)血脂異常、破壞能量穩(wěn)態(tài)的重要因素，臨床表現(xiàn)為疲倦乏力、少氣懶言、唇爪青紫、舌紫等證候特征[2]。在臨床上，通過(guò)對(duì)脂質(zhì)代謝異常患者進(jìn)行中醫(yī)證型分析，表明氣虛血瘀型是常見證型之一[3-5]。脂肪組織是體內(nèi)重要的內(nèi)分泌和儲(chǔ)能器官，深入?yún)⑴c機(jī)體能量代謝，具有可塑性，與機(jī)體維持能量穩(wěn)態(tài)具有密切的關(guān)系[6]。

天山雪蓮是菊科植物天山雪蓮(Kar. et Kir.) Sch. -Bip.的干燥地上部分，生長(zhǎng)在海拔4000 m左右的山區(qū)，主要分布在阿爾泰山脈、天山山脈附近[7]。天山雪蓮性溫，味微苦，具有溫腎助陽(yáng)、通經(jīng)活血等功效，現(xiàn)代研究表明其具有抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)血脂、抗肥胖、抗氧化等作用。在臨床上，以天山雪蓮為主藥的復(fù)方雪蓮?fù)}丸對(duì)氣虛血瘀證患者有著良好的療效[8-9]，研究表明天山雪蓮及其多種有效成分如金合歡素[10]、高車前素[11]等能夠調(diào)控脂質(zhì)代謝過(guò)程，但具體機(jī)制尚未闡明。因此，本研究通過(guò)體內(nèi)高脂飲食配合力竭游泳建立老年脂質(zhì)代謝異常（氣虛血瘀型）小鼠模型和體外棕色脂肪細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，研究天山雪蓮對(duì)老年脂質(zhì)代謝異常（氣虛血瘀型）小鼠的血脂、脂肪可塑性、線粒體功能的影響及其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

60只6月齡SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（28.6±2.2）g；8周齡SPF級(jí)C57BL/6J小鼠12只，雌雄各半，體質(zhì)量（19.2±1.4）g；棕色脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞取自于8只2日齡雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠。所有小鼠由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010，使用許可證號(hào)SYXK（京）2016-0038。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度（25±2）℃、濕度（50±10）%的屏障環(huán)境內(nèi)，自由進(jìn)食飲水，每日光照12 h，實(shí)驗(yàn)通過(guò)北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)許可（BUCM-4-2020120103-4155）。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 藥品 天山雪蓮經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)吳浩忠老師鑒定為菊科植物天山雪蓮(Kar. et Kir.) Sch. -Bip.的干燥地上部分。稱取天山雪蓮60.0 g，剪碎，加800 mL水，浸泡1 h，煎煮30 min，濾過(guò)；藥渣同法再煎煮2次，合并濾液，濃縮至稠浸膏，冷凍干燥，即為天山雪蓮提取物（16.90 g），得率為28.16%。采用《中國(guó)藥典》2020年版一部中天山雪蓮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下方法測(cè)定指標(biāo)性成分含量，天山雪蓮提取物中蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.59%，綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.78%。羅格列酮（批號(hào)Y05F9C54480）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)試劑 總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒（批號(hào)20210122）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）試劑盒（批號(hào)20210122）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒（批號(hào)20210122）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒（批號(hào)20210103）購(gòu)于南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；RNA裂解液（批號(hào)G3013）、Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit（批號(hào)G3330）、2×SYBR Green qPCR Master Mix（none ROX）（批號(hào)G3320）、檸檬酸（pH 6.0）抗原修復(fù)液（批號(hào)G1202）、DAB顯色劑（批號(hào)G0002）、蘇木素（HE）染液（批號(hào)G0115）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，批號(hào)G5001）購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司；山羊抗兔HRP標(biāo)記（批號(hào)GB23303）購(gòu)于Servicebio公司；抗解偶聯(lián)蛋白-1（uncoupling protein 1，Ucp1）抗體（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，批號(hào)A2320）。

1.2.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)試劑 PBS緩沖液（美國(guó)CORNING公司，批號(hào)14019011）、II型膠原酶（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號(hào)2202404）、DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)SIGMA公司，批號(hào)RNBJ7483）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，浙江天杭生物科技股份有限公司，批號(hào)20010506）、胰島素（美國(guó)SIGMA公司，批號(hào)19D287）、3,3?,5?-三碘甲腺原酸（3,3?,5?-triiodo--thyronine sodium salt，T3，美國(guó)SIGMA公司，批號(hào)WXBC9483V）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxan-thine，IBMX，美國(guó)SIGMA公司，批號(hào)﹟STBF2497V）、吲哚美辛[奧默生物技術(shù)（上海）有限公司，批號(hào)53-86-1]、青霉素-鏈霉素混合液（P/S，美國(guó)Corning公司，批號(hào)30002297）、山羊抗小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20200822）、ProLong?Gold Antifade Reagent with DAPI（美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)11）、山羊血清（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20191113）、4%組織細(xì)胞固定液（北京百瑞極生物科技有限公司，批號(hào)20210118）；10% FBS培養(yǎng)基，含DMEM高糖培養(yǎng)基、10% FBS、1% P/S；誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，含DMEM高糖培養(yǎng)基、10% FBS、1% P/S、20 nmol/L胰島素、1 nmol/L T3、0.125 mmol/L吲哚美辛、5 mol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMX；生長(zhǎng)分化培養(yǎng)基，含DMEM高糖培養(yǎng)基、10% FBS、1% P/S、20 nmol/L胰島素，1 nmol/L T3。

1.3 儀器

EPOCH酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）、血糖儀（強(qiáng)生醫(yī)療器械有限公司，One Touch Ultra Easy）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司，StepOne Plus）、HERACELL 150i二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）、AE200型倒置顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）、ECLIPSE Ti激光共聚焦顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 動(dòng)物造模、分組及給藥 60只6月齡SPF級(jí)C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，通過(guò)喂食高脂飼料結(jié)合力竭游泳構(gòu)建老年脂質(zhì)代謝異常（氣虛血瘀型）小鼠模型。造模小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，均喂養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束。力竭游泳造模共持續(xù)10 d，每天8: 00時(shí)進(jìn)行1次力竭游泳。當(dāng)小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量降低、對(duì)抗性減弱、精神倦怠、毛發(fā)干燥、大便增加并出現(xiàn)大便便溏、小鼠舌質(zhì)紫瘀等表征時(shí)表明老年氣虛血瘀模型造模成功[12]。將造模成功的小鼠，隨機(jī)分為模型組，天山雪蓮低、中、高劑量（0.3、0.9、1.8 g/kg）組和羅格列酮（10 mg/kg）組，每組12只，雌雄各半。另設(shè)12只8周齡SPF級(jí)C57BL/6J小鼠為對(duì)照組，雌雄各半，給予普通飼料喂養(yǎng)。

天山雪蓮給藥劑量設(shè)置依據(jù)：《中國(guó)藥典》2020年版收錄天山雪蓮的成人用量為3～6 g，成人體質(zhì)量按照70 kg計(jì)算得出小鼠的給藥劑量分別為0.3、0.9、1.8 g/kg，其中0.9 g/kg相當(dāng)于人的臨床等效量。對(duì)照組和模型組小鼠每天ig給予飲用水。各給藥組按照相應(yīng)劑量（用蒸餾水配制）給藥，每天ig 1次，連續(xù)ig給藥5周。

2.1.2 葡萄糖耐受量的測(cè)定 藥物連續(xù)干預(yù)5周后，禁食12 h，通過(guò)剪尾法取血，按照2 g/kg體質(zhì)量ip葡萄糖，檢測(cè)0 min及注射葡萄糖后的30、60、90、120 min小鼠血糖值，繪制葡萄糖耐量-時(shí)間曲線圖，通過(guò)近似梯形法計(jì)算曲線下面積（area under curve，AUC）。

2.1.3 取材 給藥周期結(jié)束后，動(dòng)物禁食12 h，不禁水，麻醉后摘眼球取血，靜置2 h后，3500 r/min離心10 min分離血清，分離的血清?80 ℃保存。獲取小鼠腹股溝白色脂肪組織（inguinal white adipose tissue，iWAT）和棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT），精確稱質(zhì)量后，部分固定于4%組織固定液中，部分存放于?80 ℃冰箱。

2.1.4 脂肪組織指數(shù)的測(cè)定 精確稱取小鼠iWAT、BAT質(zhì)量后，按公式分別計(jì)算iWAT、BAT指數(shù)。

iWAT指數(shù)＝iWAT質(zhì)量/體質(zhì)量

BAT指數(shù)＝BAT/體質(zhì)量

2.1.5 血脂相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量。

2.1.6 HE染色檢測(cè)脂肪組織形態(tài) 用4%多聚甲醛固定iWAT、BAT，取出依次梯度脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢，通過(guò)Image Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行平均光密度分析。

2.1.7 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)脂肪組織UCP1的蛋白表達(dá) 石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟，將iWAT、BAT切片放在抗原修復(fù)緩沖液中進(jìn)行修復(fù)，在iWAT、BAT切片上滴加3%雙氧水溶液，避光室溫孵育25 min，PBS洗3次，在切片上滴加山羊血清封閉1 h。在切片上滴加稀釋好的UCP1抗體溶液（1∶500），將切片放入濕盒內(nèi)4 ℃過(guò)夜。滴加稀釋好的二抗，37 ℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染3 min，常規(guī)脫水，中性樹膠封片。通過(guò)Image-ProPlus 6.0軟件處理數(shù)據(jù)。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1 棕色脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)及分組 通過(guò)膠原酶消化法獲取棕色脂肪組織的血管基質(zhì)部分（stromal vascular fraction，SVF），進(jìn)一步誘導(dǎo)分化獲得棕色脂肪細(xì)胞。

（1）細(xì)胞培養(yǎng)：取8只2日齡雄性C57BL/6J小鼠在75%乙醇中消毒；無(wú)菌手術(shù)器械從小鼠肩胛骨中間取出SVF，PBS緩沖液沖洗，剪碎，消化；消化后，加入與消化液等量的完全培養(yǎng)基，混懸，離心；離心后吸棄上清，加入含10% FBS DMEM完全培養(yǎng)基，通過(guò)100 μm細(xì)胞篩，濾液1200 r/min離心5 min；離心后吸棄上清，加入含10% FBS DMEM完全培養(yǎng)基，重懸，接種在60 mm2培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，8 h后進(jìn)行換液，洗去未貼壁細(xì)胞。之后每隔1 d更換培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%以上，進(jìn)行誘導(dǎo)及分化。將含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基替換為棕色脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)48 h后，將棕色脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液替換為生長(zhǎng)分化培養(yǎng)液，分化培養(yǎng)時(shí)每隔1 d換1次液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d后取材。

（2）分組：將棕色脂肪細(xì)胞分為對(duì)照組，天山雪蓮低、中、高劑量（0.025、0.050、0.100 mg/mL）組和羅格列酮（1 μmol/L）組，給藥組使用分化生長(zhǎng)培養(yǎng)液配制為相應(yīng)濃度含藥培養(yǎng)液，現(xiàn)用現(xiàn)配。對(duì)照組給予等體積載體（PBS溶液）。

2.2.2 免疫熒光檢測(cè)棕色脂肪細(xì)胞Ucp1的蛋白表達(dá) 將細(xì)胞按照1×105個(gè)/mL接種在含有細(xì)胞爬的24孔板中，誘導(dǎo)分化并按照各組劑量給藥；給藥處理后，PBS緩沖液沖洗，4%組織細(xì)胞固定液固定細(xì)胞；0.1% Triton X-100透化，沖洗；10%山羊血清封閉后，與UCP1（1∶200）抗體4 ℃孵育過(guò)夜；使用含有FITC的山羊抗兔二抗標(biāo)記細(xì)胞，孵育后用含DAPI的甘油封片；激光掃描共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)，并通過(guò)Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算平均光密度。

2.2.3 Mito Tracker染色法檢測(cè)棕色脂肪細(xì)胞線粒體數(shù)量 將細(xì)胞按照1×105個(gè)/mL接種在含有細(xì)胞爬片的24孔板中，誘導(dǎo)分化并按照各組劑量給藥，分化第8天收集細(xì)胞并進(jìn)行線粒體Mito Tracker染色。用不含血清及酚紅的生長(zhǎng)培養(yǎng)基將其稀釋至100 nmol/L，用PBS緩沖液洗細(xì)胞，加入Mito Tracker染料，37 ℃孵育15 min，4%組織細(xì)胞固定液固定細(xì)胞，室溫下用0.1% Triton X-100透化10 min，含DAPI的甘油封片，通過(guò)激光掃描共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)線粒體染色情況，并通過(guò)Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算平均光密度。

2.3 qRT-PCR法檢測(cè)脂肪組織和棕色脂肪細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)

利用TRIzol試劑提取總RNA，微核酸分析儀測(cè)定濃度和純度。采用Prime Script TMRT試劑將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。加入SYBR Green、引物及cDNA模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。引物序列見表1。

表1 相關(guān)引物序列

Table 1 Primers sequence

目的基因引物序列(5’-3’)目的基因引物序列(5’-3’) Ucp1正向CTCTACGACTCAGTCCAAGAGNrf1正向TGTTTGGCGCAGCACCTTT 反向CATTAAGCCGGCTGAGATCTTG反向CGCAGACTCCAGGTCTTCCA Prdm16正向CAGCACGGTGAAGCCATTCGlut 4正向ATAGGGAGCAGAAACCCAAGG 反向GCGTGCATCCGCTTGTG反向AGGGTGAGTGAGGCATTTTCT Pgc-1α正向CCCTGCCATTGTTAAGACCPolg1正向CGCTTCTGCATCAGCATCCA 反向TGCTGCTGTTCCTGTTTTC反向ACTGCACTGAAAAAGGCGAC Pparγ正向TTTCAAGGGTGCCAGTTTβ-actin正向ACTCCTATGTGGGTGACGAGG 反向GAGGCCAGCATCGTGTAG反向CACACGCAGCTCATTGTAGAAG Tfam正向GAAGAACGCATGGAGGAGAG 反向TTCTGGGGAGAGTTGCAGTT

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 老年脂質(zhì)代謝異常（氣虛血瘀型）小鼠模型建立

與對(duì)照組比較，喂食高脂飼料并進(jìn)行力竭游泳的老年小鼠出現(xiàn)活動(dòng)性差、對(duì)抗性減弱、精神萎靡、大便略增加、力竭游泳時(shí)間縮短等表征，舌質(zhì)較對(duì)照組出現(xiàn)紫瘀。

3.2 天山雪蓮對(duì)老年脂質(zhì)代謝異常小鼠葡萄糖耐量的影響

葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，模型組小鼠的空腹血糖及AUC顯著升高（＜0.01）。與模型組相比，天山雪蓮0.3、0.9、1.8 g/kg組小鼠的空腹血糖，葡萄糖注射后60、90、120 min血糖值顯著降低（＜0.05、0.01）；天山雪蓮0.3、1.8 g/kg組小鼠AUC顯著降低（＜0.05、0.01），表明天山雪蓮可改善老年脂質(zhì)代謝異常小鼠的糖耐量，見圖1。

與對(duì)照組比較：?P＜0.05 ??P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，圖2～5、7同

3.3 天山雪蓮對(duì)老年脂質(zhì)代謝異常小鼠血脂指標(biāo)的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C含量顯著升高（＜0.01）。與模型組相比，天山雪蓮0.3、1.8 g/kg組小鼠血清TC含量明顯降低（＜0.01）；天山雪蓮0.9、1.8 g/kg組小鼠血清TG含量明顯降低（＜0.01），見圖2。

3.4 天山雪蓮對(duì)老年脂質(zhì)代謝異常小鼠脂肪比重的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠BAT指數(shù)顯著減少（＜0.01），iWAT指數(shù)明顯升高（＜0.01）。與模型組比較，天山雪蓮0.9 g/kg組小鼠BAT指數(shù)明顯升高（＜0.05），天山雪蓮1.8 g/kg組小鼠iWAT指數(shù)明顯降低（＜0.01），見圖3。

圖2 天山雪蓮對(duì)老年脂質(zhì)代謝異常小鼠血脂指標(biāo)的影響(,n= 12)

圖3 天山雪蓮對(duì)老年脂質(zhì)代謝異常小鼠BAT指數(shù)和iWAT指數(shù)的影響(,n= 12)

3.5 天山雪蓮對(duì)老年脂質(zhì)代謝異常小鼠脂肪組織棕色化基因表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，在BAT中，與模型組相比，天山雪蓮0.3、0.9、1.8 g/kg組基因表達(dá)明顯增加（＜0.05、0.01），過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coacti-vator-1α，）基因表達(dá)無(wú)顯著性差異（＞0.05），見圖4。在iWAT中，與模型組相比，天山雪蓮給藥組、基因表達(dá)具有增加趨勢(shì)但無(wú)顯著性差異（＞0.05），見圖4。

3.6 天山雪蓮對(duì)老年脂質(zhì)代謝異常小鼠脂肪組織線粒體生物合成基因表達(dá)的影響

結(jié)果表明，在BAT中，與模型組相比，天山雪蓮0.3、1.8 g/kg組DNA聚合酶γ1（DNA polymerase γ1，）基因表達(dá)明顯增加（＜0.05），線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，）基因表達(dá)無(wú)顯著性差異（＞0.05），見圖5。在iWAT中，與模型組相比，天山雪蓮給藥組、基因表達(dá)無(wú)顯著性差異（＞0.05），見圖5。

3.7 天山雪蓮對(duì)老年脂質(zhì)代謝異常小鼠脂肪形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠皮下iWAT較為松散，脂肪細(xì)胞直徑較大，細(xì)胞核被擠至細(xì)胞一側(cè)呈薄環(huán)狀，白色脂肪細(xì)胞特征明顯。與模型組小鼠比較，天山雪蓮0.3、0.9、1.8 g/kg組小鼠皮下白色脂肪組織細(xì)胞變小，并呈現(xiàn)多室，脂肪細(xì)胞具有棕色化趨勢(shì)。

與對(duì)照組比較，模型組小鼠BAT細(xì)胞直徑較大，組織中具有單一空泡狀脂滴的細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞形態(tài)更加趨向于白色脂肪細(xì)胞。與模型組比較，天山雪蓮0.3、0.9、1.8 g/kg組小鼠棕色脂肪組織較為緊密，細(xì)胞分布增多，細(xì)胞呈現(xiàn)多室，細(xì)胞之間可以看到豐富致密的毛細(xì)血管，具有較為明顯的棕色脂肪細(xì)胞形態(tài)特征，見圖6。

圖4 天山雪蓮對(duì)老年脂質(zhì)代謝異常小鼠BAT和iWAT中Ucp1、Pgc-1α mRNA表達(dá)的影響(,n= 12)

圖5 天山雪蓮對(duì)老年脂質(zhì)代謝異常小鼠BAT和iWAT中線粒體相關(guān)基因Polg1、Tfam mRNA表達(dá)的影響 (,n = 12)

3.8 天山雪蓮對(duì)老年脂質(zhì)代謝異常小鼠脂肪組織Ucp1蛋白表達(dá)的影響

脂肪組織免疫組化結(jié)果顯示，在皮下iWAT中，與對(duì)照組比較，模型組小鼠Ucp1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減少（＜0.01）。與模型組比較，天山雪蓮0.3、0.9、1.8 g/kg組小鼠Ucp1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增多（＜0.05、0.01）。

與對(duì)照組比較，模型組小鼠BAT中Ucp1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減少（＜0.01）。與模型組比較，天山雪蓮0.3、0.9、1.8 g/kg組小鼠中Ucp1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增多（＜0.05、0.01），見圖7。

3.9 天山雪蓮對(duì)棕色脂肪細(xì)胞標(biāo)志物基因及Ucp1蛋白表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，天山雪蓮0.025、0.050 mg/mL組中棕色脂肪分化相關(guān)基因過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，）的mRNA表達(dá)水平顯著增加（＜0.01），天山雪蓮0.025、0.100 mg/mL組中PR結(jié)構(gòu)域蛋白16（positive regulatory domain-containing 16，）mRNA表達(dá)顯著增加（＜0.01），mRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異（＞0.05），見圖8。Ucp1免疫熒光結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，天山雪蓮0.025 mg/mL組可顯著增加棕色脂肪細(xì)胞特異性蛋白Ucp1表達(dá)（＜0.05），表明天山雪蓮可能具有促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞分化，激活BAT的作用，見圖9。

圖6 天山雪對(duì)老年脂質(zhì)代謝異常小鼠脂肪組織形態(tài)的影響(HE染色，×400)

圖7 天山雪蓮對(duì)老年脂質(zhì)代謝異常小鼠Ucp1蛋白表達(dá)的影響(,n = 12，免疫組織化學(xué)染色，×400)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，圖9～11同

3.10 天山雪蓮對(duì)棕色脂肪細(xì)胞線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因及數(shù)量的影響

qRT-PCR結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，天山雪蓮0.025 mg/mL組線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平顯著增加（＜0.05），核呼吸因子1（nuclear respiratory factor 1，）mRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異（＞0.05）；葡萄糖代謝相關(guān)基因葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，）mRNA表達(dá)水平顯著增加（＜0.05），見圖10。

線粒體Mito Tracker染色結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，天山雪蓮0.025、0.100 mg/mL組均可顯著增加棕色脂肪細(xì)胞線粒體數(shù)量（＜0.05），表明天山雪蓮具有一定增加棕色脂肪線粒體數(shù)量的作用，見圖11。表明天山雪蓮可能具有促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞線粒體生物發(fā)生，促進(jìn)葡萄糖攝取的作用。

4 討論

隨著年齡的增長(zhǎng)，人體逐漸衰老，各項(xiàng)生理機(jī)能隨之下降，尤其脾胃的運(yùn)化功能下降明顯使水谷精微不能被人體正常吸收利用而化為痰、濁、膏、脂，在體內(nèi)積累，發(fā)展為脂質(zhì)代謝異常、肥胖等[13]。機(jī)體的衰老導(dǎo)致血脂代謝異常的風(fēng)險(xiǎn)大幅度上升，伴隨著TG、LDL水平升高，HDL水平下降，脂質(zhì)代謝異常會(huì)干擾脂肪細(xì)胞的正常生理功能，影響脂肪因子的分泌[14-15]。本研究中，造模小鼠出現(xiàn)活動(dòng)性差、精神萎靡、舌質(zhì)紫瘀等表征，血脂指標(biāo)TC、TG、LDL-C含量顯著升高，iWAT指數(shù)上升、狀態(tài)松散且細(xì)胞直徑較大，BAT指數(shù)下降、形態(tài)“白色化”，表明老年脂質(zhì)代謝異常（氣虛血瘀證型）小鼠造模成功。

圖9 棕色脂肪細(xì)胞Ucp1蛋白免疫熒光染色(×400) 及平均光密度(,n = 3)

圖10 天山雪蓮對(duì)棕色脂肪細(xì)胞線粒體生物發(fā)生(A)及葡萄糖代謝(B)相關(guān)基因表達(dá)的影響(,n = 3)

心腦血管疾病是全球發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一，且風(fēng)險(xiǎn)隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，血脂異常是心腦血管疾病重要發(fā)生因素之一[16]。本研究中，天山雪蓮能顯著降低老年脂質(zhì)代謝異常小鼠血清中TC、TG含量；降低注射葡萄糖后不同時(shí)間段血糖值以及AUC；上調(diào)脂肪細(xì)胞葡萄糖代謝基因表達(dá)水平，表明天山雪蓮對(duì)血脂異常具有改善作用，維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。天山雪蓮改善脂質(zhì)代謝異常的機(jī)制與調(diào)節(jié)脂肪可塑性和線粒體功能障礙具有密切的關(guān)系。

圖11 棕色脂肪細(xì)胞線粒體Mito Tracker染色(×400)及平均光密度(,n = 3)

衰老會(huì)引起脂肪組織組成和分布發(fā)生變化，進(jìn)而影響機(jī)體代謝，打破全身能量穩(wěn)態(tài)，引起代謝并發(fā)癥的逐漸發(fā)展。在哺乳動(dòng)物中，脂肪在能量穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著核心作用。脂肪組織分為WAT、BAT、米色脂肪組織，分別負(fù)責(zé)不同功能。白色脂肪細(xì)胞由單室脂滴占據(jù)大部分細(xì)胞體積，負(fù)責(zé)在營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩時(shí)以TG的形式儲(chǔ)存多余的能量，WAT過(guò)度累積是肥胖的標(biāo)志[17]。與WAT相比，棕色脂肪細(xì)胞由多房脂滴、中央細(xì)胞核和高密度線粒體構(gòu)成，線粒體富含的鐵元素使組織呈褐色。Ucp1是棕色脂肪組織中高表達(dá)蛋白，存在于線粒體內(nèi)膜，能夠利用脂肪酸破壞質(zhì)子梯度，使二磷酸腺苷不能磷酸化為三磷酸腺苷，能量以熱能的形式釋放[18-21]。因此，BAT不僅能調(diào)節(jié)體溫功能，而且能夠維持能量穩(wěn)態(tài)和消耗過(guò)量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以防止肥胖和脂質(zhì)代謝紊亂。脂肪具有可塑性，在寒冷、藥物刺激下WAT會(huì)發(fā)生棕色化，上調(diào)、等產(chǎn)熱基因的表達(dá)，增強(qiáng)產(chǎn)熱作用；而當(dāng)機(jī)體β-腎上腺素能信號(hào)受損、衰老，BAT會(huì)發(fā)生白化，產(chǎn)熱功能降低，機(jī)體能量消耗減少。米色脂肪是一種特殊的脂肪細(xì)胞，干細(xì)胞與白色脂肪細(xì)胞相同，但具有棕色脂肪細(xì)胞特征，同樣能夠發(fā)揮產(chǎn)熱的作用[22]。在衰老的過(guò)程中，人體內(nèi)的BAT質(zhì)量和活性會(huì)隨之下降，主要表現(xiàn)為BAT活性顯著降低、標(biāo)志性產(chǎn)熱基因表達(dá)喪失。通過(guò)18F-FDG-PET/CT成像檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BAT活性在青春期和性成熟期間增加，而在60歲以上的個(gè)體活性很難檢測(cè)到[20]。而米色脂肪細(xì)胞形成能力也隨之下降，導(dǎo)致產(chǎn)熱功能受損，具體機(jī)制仍不清楚，有研究表明在衰老的過(guò)程中棕色化基因如、等表達(dá)水平會(huì)下降[23]。因此通過(guò)激活BAT功能和誘導(dǎo)WAT褐化是一種抵抗衰老引起的肥胖和代謝疾病的潛在治療方法。

BAT和米色脂肪細(xì)胞中豐富的線粒體是機(jī)體維持能量代謝的關(guān)鍵，在代謝超載情況下能夠通過(guò)非耦合呼吸產(chǎn)熱對(duì)抗脂質(zhì)代謝失常，防止肥胖、高血糖和糖尿病等疾病的發(fā)生[24]。線粒體功能障礙是衰老引起脂肪組織變化的主要原因之一。線粒體功能障礙引發(fā)的肥胖會(huì)進(jìn)一步惡化線粒體功能，脂肪在體內(nèi)調(diào)控失衡會(huì)引起炎癥，導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生增加，引起氧化應(yīng)激，最終進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體功能障礙，此外肥胖狀態(tài)下過(guò)多的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)會(huì)打破正常的線粒體呼吸鏈和克氏循環(huán)，最終加劇肥胖的情況[23,25]。線粒體功能障礙包括線粒體DNA突變?cè)黾?、線粒體生物合成下降、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)抑制進(jìn)而引起多種與衰老相關(guān)疾病如肥胖、2型糖尿病等[26]。脂肪組織中存在大量線粒體，而線粒體在脂肪細(xì)胞分化、BAT產(chǎn)熱、調(diào)節(jié)胰島素敏感性等方面發(fā)揮重要作用。膳食天然化合物誘導(dǎo)脂肪重塑和改善線粒體功能障礙以維持機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)是具有潛力的治療方法[27]。

本研究發(fā)現(xiàn)天山雪蓮能夠顯著改善老年脂質(zhì)代謝異常小鼠的血脂情況及血糖穩(wěn)態(tài)，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪可塑性和改善線粒體功能障礙。天山雪蓮給藥后能夠誘導(dǎo)iWAT棕色化、激活BAT、降低iWAT指數(shù)、升高BAT指數(shù)、改善脂肪組織狀態(tài)，在動(dòng)物和細(xì)胞水平上表明能上調(diào)棕色脂肪標(biāo)志基因、及表達(dá)水平，增加UCP1蛋白和基因的表達(dá)。天山雪蓮對(duì)線粒體功能障礙的改善作用是通過(guò)增強(qiáng)線粒體合成基因的表達(dá)、葡萄糖代謝相關(guān)基因表達(dá)和增加線粒體數(shù)量實(shí)現(xiàn)的。綜上所述，天山雪蓮能夠通過(guò)改善脂質(zhì)代謝、脂肪可塑性、線粒體功能障礙等多方面來(lái)綜合調(diào)節(jié)老年小鼠的脂質(zhì)代謝異常。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 劉厚蓮. 世界和中國(guó)人口老齡化發(fā)展態(tài)勢(shì) [J]. 老齡科學(xué)研究, 2021, 9(12): 1-16.

[2] 王治寬, 王發(fā)渭. 從氣虛血瘀論治老年病 [J]. 中國(guó)醫(yī)藥學(xué)報(bào), 2004, 19(6): 359-361.

[3] 李端陽(yáng). 調(diào)脂消斑通脈方干預(yù)血脂異常邊緣升高(氣虛兼血瘀質(zhì)) 的臨床觀察 [D]. 長(zhǎng)春: 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué), 2020.

[4] 韋峰, 梁海燕. 原發(fā)性血脂異常及心血管危險(xiǎn)分級(jí)與中醫(yī)證候相關(guān)研究 [J]. 實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志, 2016, 30(10): 1-3.

[5] 劉旭東, 鐘小雪, 吳海芳, 等. 基于復(fù)雜系統(tǒng)熵聚堆方法的1019例血脂異常的中醫(yī)證候研究 [J]. 北京中醫(yī)藥, 2017, 36(12): 1085-1091.

[6] Parra-Peralbo E, Talamillo A, Barrio R. Origin and development of the adipose tissue, a key organ in physiology and disease [J]., 2021, 9: 786129.

[7] 商國(guó)懋, 王文穎. 維吾爾族習(xí)用藥材天山雪蓮 [J]. 首都醫(yī)藥, 2014, 21(13): 41.

[8] 秦漢, 胡志希, 李琳, 等. 雪蓮?fù)}丸對(duì)冠心病氣虛血瘀證小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)指標(biāo)ET-1、NO、ACE的影響 [J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 36(2): 25-28.

[9] 陳小兵, 任小娟, 張秀芬, 等. 雪蓮?fù)}丸治療氣虛血瘀型后循環(huán)缺血性眩暈的臨床觀察 [J]. 天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 38(3): 244-246.

[10] Liou C J, Wu S J, Chen L C,. Acacetin from traditionally usedKar. et Kir. suppressed adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes and attenuated lipid accumulation in obese mice [J]., 2017, 8: 589.

[11] Wu X C, Xu J. New role of hispidulin in lipid metabolism: PPARα activator [J]., 2016, 51(11): 1249-1257.

[12] 張偉健, 劉宏, 蘇薇薇, 等. 高脂飼喂結(jié)合力竭游泳的氣虛血瘀證動(dòng)物模型的構(gòu)建及評(píng)價(jià) [J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2020, 59(2): 131-136.

[13] 康誦清. 益脈顆粒治療老年高脂血癥氣虛血瘀證的臨床療效觀察 [D]. 濟(jì)南: 山東中醫(yī)藥大學(xué), 2015.

[14] Liu H H, Li J J. Aging and dyslipidemia: A review of potential mechanisms [J]., 2015, 19: 43-52.

[15] Singer K, Lumeng C N. The initiation of metabolic inflammation in childhood obesity [J]., 2017, 127(1): 65-73.

[16] Yandrapalli S, Gupta S, Andries G,. Drug therapy of dyslipidemia in the elderly [J]., 2019, 36(4): 321-340.

[17] Roncari D A, Hamilton B S. Cellular and molecular factors in adipose tissue growth and obesity [J]., 1993, 334: 269-277.

[18] Lidell M E, Betz M J, Enerb?ck S. Brown adipose tissue and its therapeutic potential [J]., 2014, 276(4): 364-377.

[19] Fedorenko A, Lishko P V, Kirichok Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1uncoupling in brown fat mitochondria [J]., 2012, 151(2): 400-413.

[20] Yang J, Zhang H L, Parhat K,. Molecular imaging of brown adipose tissue mass [J]., 2021, 22(17): 9436.

[21] Yang J, Yang J, Ran C Z. Spectral unmixing imaging for differentiating brown adipose tissue mass and its activation [J]., 2018, 2018: 6134186.

[22] Kotzbeck P, Giordano A, Mondini E,. Brown adipose tissue whitening leads to brown adipocyte death and adipose tissue inflammation [J]., 2018, 59(5): 784-794.

[23] Singh R, Barrios A, Dirakvand G,. Human brown adipose tissue and metabolic health: Potential for therapeutic avenues [J]., 2021, 10(11): 3030.

[24] Michurina S S, Stafeev I S, Menshikov M Y,. Mitochondrial dynamics keep balance of nutrient combustion in thermogenic adipocytes [J]., 2021, 59: 157-168.

[25] Das M, Sauceda C, Webster N J G. Mitochondrial dysfunction in obesity and reproduction [J]., 2021, 162(1): bqaa158.

[26] Macêdo A P A, da Silva A S R, Mu?oz V R,. Mitochondrial dysfunction plays an essential role in remodeling aging adipose tissue [J]., 2021, 200: 111598.

[27] Lee J H, Park A, Oh K J,. The role of adipose tissue mitochondria: Regulation of mitochondrial function for the treatment of metabolic diseases [J]., 2019, 20(19):4924.

Study on improving effects and mechanism ofin aged mice with abnormal lipid metabolism (deficiency and blood stasis syndrome)

HE Run-cheng, HUANG Zhi-qi, FENG Qian-qian, NING Yi-bo, SUN Jian-ning, ZHANG Shuo-feng, DONG Shi-fen

Department of Pharmacology of Traditional Chinese Medicine, School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To study the effects and mechanisms of Tianshan Xuelian (, SI) on aged mice with abnormal lipid metabolism (deficiency and blood stasis syndrome) combinedandexperiments.The aged mice model of abnormal lipid metabolism (deficiency and blood stasis syndrome) were established by vigorous swimming and high-fat diet. The mice were divided into control group, model group, rosiglitazone group and low, medium and high dose (0.3, 0.9, 1.8 g/kg) of SIgroups, and each administrated group was orally given drugs or solvent respectively for consecutive 5 weeks. The parameters of glucose tolerance and blood lipids of the mice in each group were measured by biochemical method. And adipose tissues morphological changes were detected by HE staining. The genes expression of uncoupling protein 1 (), DNA polymerase γ1 () in adipose tissue were detected using quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR). The protein expression of Ucp1 in adipose tissue was detected by immunohistochemistry., brown adipocytes were divided into five groups, including control group, low, medium and high dose (0.025, 0.05, 0.1 mg/mL) of SI groups, and rosiglitazone group, further mechanism of action. The genes expression of, peroxisome proliferator-activated receptor γ (), positive regulatory domain-containing 16 (), mitochondrial transcription factor A (), glucose transporter 4 () were detectedby qRT-PCR. The protein expression of Ucp1 expression was detected by immunofluorescence. Mitochondrial Mito tracker staining was used to detect mitochondrial number changes in brown adipocytes.Compared with the control group, the model mice showed decreased resistance, purple blood stasis and other characteristics ofdeficiency and blood stasis in the tongue, fasting blood glucose, area under curve (AUC), inguinal white adipose tissue (iWAT) index, total cholesterol (TC), triglyceride (TG) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) content was significantly increased (< 0.01), and the brown adipose tissue (BAT) index was significantly decreased (< 0.01), the white characteristics of BAT and iWAT and the expression of Ucp1 positive cells were significantly decreased (< 0.01). Compared with model group, the blood lipid index, glucose metabolism index and iWAT index were significantly improved (< 0.01), BAT index was significantly increased (< 0.05), iWAT and BAT morphologic browning characteristics were obvious, and the expression levels ofandgenes in BAT were significantly increased (< 0.05, 0.01), the expression of Ucp1 protein in adipose tissue significantly increased (< 0.05, 0.01) of mice in SI administration group.experiments, compared with the control group, the expression levels of,,,genes, mitochondrial number and Ucp1 protein expression in brown adipocytes after SI intervention were significantly increased (< 0.05, 0.01).SI could improve abnormal lipid metabolism in aged mouse models withdeficiency and blood stasis by regulating fat plasticity, and ameliorating mitochondrial dysfunction.

(Kar. et Kir.) Sch. -Bip.;deficiency and blood stasis syndrome; abnormal lipid metabolism; adipose plasticity; mitochondria

R285

A

0253 - 2670(2022)17 - 5433 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.17.020

2022-03-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81503287）

賀潤(rùn)鋮（1998—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。Tel: 18846834623 E-mail: heruncheng0823@163.com

董世芬，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥防治心腦血管疾病研究。E-mail: dongshifen@bucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 潘明佳]