阮 涌，陳 祥，田貴剛，安冬偉，鄒啟順

（1高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025；2銅仁市萬山區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，貴州銅仁 554200；3務(wù)川自治縣宏牧羊業(yè)有限公司，貴州遵義 564300）

0 引言

【研究意義】貴州白山羊是我國肉用型優(yōu)良地方山羊品種之一，具有性成熟早、繁殖力高、適應(yīng)性強(qiáng)、板皮質(zhì)優(yōu)等特性（楊家大等，2016；張黔浪等，2016；王鑫等，2017），但也存在體型小、屠宰率低及生長速度慢等缺點(diǎn)（安清明等，2020）。為改善貴州白山羊生長性能，通過引進(jìn)波爾山羊?yàn)楦副倦s交獲得F代，選擇其優(yōu)秀個體為母本，以貴州白山羊?yàn)楦副倦s交獲得F代，再以貴州白山羊?yàn)楦副倦s交形成F代。因此，分析F代波雜山羊生長性能與生長性狀相關(guān)基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性，可為后期培育出既改善貴州白山羊生長緩慢及體型小的缺點(diǎn)，又保留貴州白山羊優(yōu)良肉品質(zhì)的新品系提供科學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)而加快貴州白山羊新品系的育成?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】至今，有關(guān)山羊生長性能與生長性狀相關(guān)基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析已有較多研究報(bào)道（Nguyen et al.，2011；王璽年等，2013；姚毅等，2015a，2015b）?？到ū?016）研究證實(shí)，瘦素基因（）G14651A位點(diǎn)與貴州白山羊成年羊的體重顯著相關(guān)，且GA基因型個體顯著高于GG基因型個體，管圍方面則是GA基因型和AA基因型個體顯著高于GG基因型個體；瘦素受體基因（）A71354G位點(diǎn)與貴州白山羊周歲羊胸圍顯著相關(guān)，且GG基因型個體的胸圍顯著高于AA基因型個體。田應(yīng)志等（2017）在貴州白山羊生長性狀與肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白基因（）相關(guān)性的研究中發(fā)現(xiàn)，C4557T和A4575G位點(diǎn)多態(tài)座位有利于提高貴州白山羊體重、體高、體斜長和管圍，其中CCGG基因型有利于提高貴州白山羊成年母羊的體高和體斜長，TTGG基因型有利于提高貴州白山羊周歲母羊的體重和管圍。熊琪等（2017）在分析山羊肌醇磷酸酶基因（）與生長性狀的關(guān)聯(lián)性時發(fā)現(xiàn)，基因內(nèi)含子2存在1個U/A突變的SNP位點(diǎn)，且該位點(diǎn)與初生重量、胸圍、管圍和體高等性狀顯著相關(guān)，等位基因C與生長呈正相關(guān)。Li等（2020）在研究基因拷貝變異數(shù)與山羊生長性狀的相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)，基因拷貝數(shù)與貴州白山羊的生長性狀顯著相關(guān)。Shi等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，山羊基因拷貝數(shù)變異對其體重、體長和體高的影響存在顯著相關(guān)，因此基因拷貝數(shù)可作為輔助山羊生長性狀選擇的分子標(biāo)記。Xu 等（2020）通過研究基因與中國山羊群體生長性狀的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)貴州白山羊270型缺失個體的胸圍優(yōu)于正常個體?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基因是Kell血型系統(tǒng)相關(guān)亞單元家族（XKR）成員之一，在生物體內(nèi)參與紅細(xì)胞膜功能、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞代謝、脂肪代謝及糖類代謝，并調(diào)控動物的生長和發(fā)育過程（Russo et al.，1998；吳周林，2015；趙克慧，2015），目前已有研究發(fā)現(xiàn)基因是兔生長性狀相關(guān)基因，可作為兔品種選育的重要分子標(biāo)記（吳周林等，2016）。山羊作為重要的草食動物，與兔具有相同的食性，因此明確基因多態(tài)性與山羊生長性狀的相關(guān)性對指導(dǎo)生產(chǎn)具有重要意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】以F代波雜山羊?yàn)檠芯繉ο?，通過血液DNA混池測序的方法對基因SNP位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，并與F代波雜山羊的生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，旨在篩選出優(yōu)異基因?yàn)楹笃谂嘤缕废堤峁├碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

F代波雜山羊由務(wù)川縣宏牧羊業(yè)有限公司提供，選取統(tǒng)一飼養(yǎng)環(huán)境下的107只F代波雜山羊，通過頸靜脈采集5 mL血液置于EDTA抗凝管中。測量并記錄F代波雜山羊初生、6月齡和12月齡的體重、體高、體長、胸圍及管圍等生長數(shù)據(jù)。

1.2 試驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備

DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，2×PCR StarMix購自西寶生物科技（上海）股份有限公司，DM 2000 DNA Marker購自北京擎科生物技術(shù)有限公司。超微量分光光度計(jì)（Thermo Mano Drop 2000）和高速冷凍離心機(jī)（RC-6 Plus）購自美國Thermo公司，梯度PCR儀（9902）購自德國ABI公司，凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood II）購自美國Bio-Rad公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

NCBI已公布的山羊基因（NC030821.1）全長313040 bp，包含3個外顯子區(qū)域。根據(jù)引物設(shè)計(jì)優(yōu)化原則，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)覆蓋外顯子區(qū)域的PCR擴(kuò)增引物（表1），委托北京擎科生物科技有限公司合成。

1.4 F3代波雜山羊DNA提取及檢測

利用血液DNA提取試劑盒提取血液DNA，采用超微量分光光度計(jì)檢測DNA的純度和濃度，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴(kuò)增及測序

PCR 反應(yīng)體系40.0 μL：2×PCR StarMix 20.0 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA模板2.0 μL，ddHO 15.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃30 s，55～65 ℃1 min，72 ℃30 s，進(jìn)行32個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)檢測。同時，對提取的107頭羊血液DNA混池（1.5 μL）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測序，用DNAStar對測序結(jié)果與原始序列進(jìn)行對比，篩選出SNP位點(diǎn)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2017計(jì)算SNP位點(diǎn)的等位基因頻率、基因型頻率、遺傳純合度（）、期望雜合度（）、有效等位基因數(shù)（）及多態(tài)信息含量（PIC）等，以卡方（χ）檢驗(yàn)分析基因型是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（周春寶等，2021），并利用SPSS 25.0分析不同基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP位點(diǎn)檢測結(jié)果

利用表1中的引物與DNA混池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳（圖1）后送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，F(xiàn)代波雜山羊基因Exon-2擴(kuò)增區(qū)域存在2個SNPs位點(diǎn)（圖2），分別是C194069A和T194091A，均屬于Intron-1區(qū)域。

2.2 F3代波雜山羊XKR4基因SNPs位點(diǎn)遺傳學(xué)分析結(jié)果

由表2可知，F(xiàn)代波雜山羊基因2個SNPs位點(diǎn)的PIC均處于中度多態(tài)水平。C194069A位點(diǎn)的等位基因頻率中C＞A，優(yōu)勢基因型為CC型；T194091A位點(diǎn)的等位基因頻率中T＞A，優(yōu)勢基因型為TT型。χ檢驗(yàn)結(jié)果表明，C194069A和T194091A位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（＞0.05）。

2.3 F3代波雜山羊XKR4基因SNP位點(diǎn)不同基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)性

運(yùn)用SPSS 25.0對F代波雜山羊C194069A和T194091A位點(diǎn)各基因型在初生、3月齡、6月齡和12月齡時的體重、體高、體斜長、胸圍及管圍進(jìn)行差異性分析。結(jié)果顯示：在初生（表3）群體中，T194091A位點(diǎn)AA基因型與其他基因型的體斜長存在顯著差異（＜0.05，下同）。在3月齡（表4）群體中，C194069A和T194091A位點(diǎn)各基因型的生長性狀指標(biāo)間均無顯著差異（＞0.05，下同）。在6月齡（表5）群體中，C194069A和T194091A位點(diǎn)AA基因型的體重分別與相應(yīng)位點(diǎn)的CC基因型和TT基因型存在顯著差異。在12月齡（表6）群體中，C194069A位點(diǎn)AA基因型在體重和胸圍方面均極顯著優(yōu)于CC基因型（＜0.01，下同），在體高方面與CC基因型存在顯著差異；T194091A位點(diǎn)AA基因型的體重、體斜長分別與TT基因型呈顯著或極顯著差異。對不同時段的日增重進(jìn)行分析，結(jié)果（表7）發(fā)現(xiàn)在0～6月齡和0～12月齡，C194069A和T194091A位點(diǎn)AA基因型的日增重與相應(yīng)位點(diǎn)的CC基因型和TT基因型分別存在呈顯著或極顯著差異。綜上所述，基因C194069A位點(diǎn)AA基因型個體的生長性能優(yōu)于CC基因型個體和CA基因型個體，T194091A位點(diǎn)AA基因型個體的生長性能也優(yōu)于TT基因型個體。

3 討論

目前，與山羊生長性狀相關(guān)的基因已有較多研究報(bào)道。如基因與貴州白山羊的體重增長相關(guān)，且AB基因型在生長性狀上優(yōu)于AA基因型和BB基因型（Cai et al.，2013）；基因多態(tài)性與貴州黑山羊的體重和體尺性狀相關(guān)（羅開鵬等，2014）；貴州本地山羊基因G127A突變位點(diǎn)的GA基因型在體斜長、胸圍和管圍方面顯著高于GG基因型和AA基因型（謝海強(qiáng)等，2014）?；蛟谏矬w內(nèi)廣泛參與細(xì)胞代謝、脂肪代謝及糖類代謝，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的生長發(fā)育過程（吳周林，2015）。本研究的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)代波雜山羊基因C194069A和T194091A位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，其PIC處于中度多態(tài)性（0.25＜PIC＜0.50），可進(jìn)行生長性狀的關(guān)聯(lián)分析，在山羊育種工作中有一定參考價(jià)值。

關(guān)于基因在畜禽育種中的應(yīng)用已有相關(guān)研究報(bào)道。澳大利亞牛的肉和胴體性狀全基因組關(guān)聯(lián)性研究發(fā)現(xiàn)基因SNP位點(diǎn)與牛皮下脂肪厚度相關(guān)（Bolormaa et al.，2011）；在秈牛和雜交牛的研究中發(fā)現(xiàn)，基因SNP位點(diǎn)（rs41724387）表達(dá)與臀部脂肪厚度極顯著相關(guān)（Porto Neto et al.，2012）；基因與內(nèi)洛爾牛的初生重和成年體重相關(guān)（Utsunomiya et al.，2013）；基因多態(tài)性與羊茅飼養(yǎng)肉牛的血清催乳素濃度顯著相關(guān)，推測基因在介導(dǎo)羊茅中毒的負(fù)面影響中發(fā)揮作用（Bastin et al.，2014）。此外，Lindholm等（2012）在研究基因上包含位置候選基因、和區(qū)域與牛采食和生長表型的相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)，基因與牛群體的采食量和增重密切相關(guān)?？梢?，基因在動物脂肪沉積及肌肉生長等方面發(fā)揮重要作用，但至今鮮見與羊生產(chǎn)性能相關(guān)的研究報(bào)道。本研究通過直接測序發(fā)現(xiàn)在F代波雜山羊基因Intron-1區(qū)域存在2個SNPs位點(diǎn)，在6月齡和12月齡的F代波雜山羊群體中，C194069A位點(diǎn)的AA基因型與CC基因型在體重方面存在顯著或極顯著差異；T194091A位點(diǎn)AA基因型在初生群體中與TT基因型和TA基因型的體斜長存在顯著差異，在6月齡和12月齡群體中，AA基因型與TT基因型的體重存在顯著差異。此外，通過日增重分析發(fā)現(xiàn)這2個SNPs位點(diǎn)的AA基因型均優(yōu)于其他基因型，提示基因C194069A和T194091A位點(diǎn)可應(yīng)用于F代波雜山羊的后續(xù)育種工作。由于生長性狀受遺傳、性別和環(huán)境等因素的影響，因此今后可篩選更多基因進(jìn)一步驗(yàn)證，從而培育出F代波雜山羊優(yōu)勢基因群體。

4 結(jié)論

F代波雜山羊基因存在2個SNPs位點(diǎn)（C194069A和T194091A），且均表現(xiàn)為AA基因型個體的生長性能優(yōu)于其他基因型個體，即基因可作為F代波雜山羊生長性狀的候選基因。