鄒小南，羅 丹，李貴洪，王婭南，彭 杰，王淑婷，郭 峰，戰(zhàn) 楠，賈 靜，朱 帥，趙 虎

1.貴州工程職業(yè)學(xué)院，貴州 銅仁 565200 2.國家地質(zhì)實驗測試中心，北京 100037 3.重慶資源與環(huán)境保護職業(yè)學(xué)院，重慶 402360

內(nèi)分泌干擾物(Endocrine Disrupting Chemicals，EDCs)是指外因性干擾生物體內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)，又稱為環(huán)境激素[1]。該類化合物可對生物體的免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生干擾，進而導(dǎo)致相關(guān)疾病的增發(fā)，在甲狀腺疾病方面的影響尤為突出[2-5]。以雙酚A(BPA)為例，其能導(dǎo)致人體內(nèi)分泌失調(diào)，可能會威脅到胎兒和兒童的健康，因此，許多國家和地區(qū)已禁止生產(chǎn)含BPA的嬰兒奶瓶。BPA、雌二醇(E2)、炔雌醇(EE2)、氫化可的松(CRL)在環(huán)境水體和土壤中的檢出頻率非常高，已造成一定程度的環(huán)境污染[6-10]。地下水是我國的主要飲用水源之一。天然和人工合成的內(nèi)分泌干擾物在生產(chǎn)和使用過程中會通過淋濾作用進入地下水，從而對地下水質(zhì)量構(gòu)成潛在威脅。國家“十四五”規(guī)劃和2035年遠景目標(biāo)綱要明確提出了“重視新污染物治理”的工作部署。內(nèi)分泌干擾物是新污染物的典型代表，對其在地下水中的污染狀況開展調(diào)查勢在必行[11-16]。地下水中的內(nèi)分泌干擾物具有濃度低和性質(zhì)差異大的特點，因此，亟待建立可同時分析測定地下水中多類內(nèi)分泌干擾物的高效分析方法，以滿足調(diào)查監(jiān)控的需求。

目前，國內(nèi)外用于測定環(huán)境介質(zhì)中內(nèi)分泌干擾物的方法多為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[17-20]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[21-23]兩種技術(shù)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)耗費低、靈敏度高，但其前處理需要經(jīng)歷衍生化步驟，操作煩瑣。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)前處理相對簡單，選擇性好且無需衍生化,因此，目前多采用高效液相色譜-質(zhì)譜法測定環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾物。國內(nèi)有學(xué)者采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了污水中的雌激素水平，但所分析的物質(zhì)種類相對單一[24-26]。不同種類的激素在質(zhì)譜源中的電離模式不同，通常需分開測定，導(dǎo)致分析時間長，分析效率有待提高。在實際研究中，環(huán)境水體中往往多類內(nèi)分泌干擾物共存，而可同時測定多類內(nèi)分泌干擾物的高效分析方法則相對較少[27-32]。為更全面、快速地分析地下水中的痕量內(nèi)分泌干擾物，亟待建立準(zhǔn)確可靠、可實現(xiàn)不同類別內(nèi)分泌干擾物同時分析的方法[33]，以滿足地下水中痕量內(nèi)分泌干擾物分析的需要。

本研究選擇常見的9種雌激素、5種雄激素、3種腎上腺皮質(zhì)激素、4種酚類化合物和3種人工合成的非甾類激素共24種典型內(nèi)分泌干擾物為目標(biāo)分析物，通過重點優(yōu)化固相萃取時的pH、色譜條件及質(zhì)譜參數(shù)，建立了基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時分析地下水中24種內(nèi)分泌干擾物的方法，并將其應(yīng)用于實際地下水樣品分析，以期為地下水中多種內(nèi)分泌干擾物的同時測定提供可靠的技術(shù)方法。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX，API4000)，固相萃取裝置(美國Waters，wat200609)，氮吹儀(常州歐諾德，ODSL-12)，超純水儀(美國Millipore，Milli-Q)，Oasis MCX固相萃取小柱(美國Waters，500 mg，6 mL)，Poroshell 120 Bonus-RP色譜柱(美國Agilent，2.7 μm，100 mm×2.1 mm)，ACQUITY UPLC BEH色譜柱(美國Waters，1.7 μm，50 mm×2.1 mm)。實驗過程所用試劑見表1。

表1 主要試劑Table 1 The main reagent

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

準(zhǔn)確稱取固體標(biāo)準(zhǔn)品0.005 0 g，用甲醇溶解后定容于5 mL棕色容量瓶中，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，密封并置于溫度為4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

分別移取100 μL目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲備液，放入10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成濃度為10 μg/mL的混合儲備液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

移取不同體積的混合儲備液于10 mL棕色容量瓶中，加入100 ng內(nèi)標(biāo)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇定容，配制成濃度梯度為1.00、2.00、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品的采集及前處理

本研究參考《地下水環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》(HJ 164—2020)，在河北省8個地級市采集了48個地下水樣品。在每個采樣點，用待采水樣沖洗硬質(zhì)玻璃瓶3次后，采集監(jiān)測水井中水面下10～30 cm處的潛水(淺層地下水)，并用濃硫酸調(diào)節(jié)水樣pH至3及以下。將樣品運送至實驗室后，1～5 ℃避光冷藏。所有樣品于48 h內(nèi)完成處理并測定。

取上清液，經(jīng)0.45 μm玻璃纖維膜過濾后，量取1 L水樣，加入10 ng內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。依次用6 mL甲醇、6 mL pH=5的超純水充分活化Oasis MCX固相萃取小柱，然后將上述1 L已準(zhǔn)備好的水樣過柱(流速控制在5～10 mL/min)。上樣完成后，用6 mL pH=5的水進行清洗，使固相萃取柱上富集的水溶性離子化合物脫離，隨后真空抽取10 min以去除水分。最后，用9 mL堿化乙腈(4.5%，體積分數(shù))洗脫，氮氣吹干，并用甲醇定容至1.0 mL待上機分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜分析條件

采用Poroshell 120 Bonus-RP色譜柱對目標(biāo)化合物進行分離。柱溫30 ℃，進樣量10 μL，流速始終為0.3 mL/min。流動相D為0.1%氨水溶液，流動相B為乙腈。

梯度洗脫條件：0.0 min，35% B；0.0～5.0 min，35%～95% B；5.0～10.0 min，95% B；10.0～10.5 min，95%～35% B；10.5～14.0 min，35% B。

1.4.2 質(zhì)譜分析條件

采用MRM模式劃分時間窗口采集正、負離子。離子源：電噴霧(ESI)；電離模式：正負離子分段采集；氣簾氣(CUR)壓力：20 kPa；碰撞氣(CAD)壓力：20 kPa；電噴霧電壓：5 000 V；輔助氣1(GS1)壓力：40 kPa；輔助氣2(GS2)壓力：0 kPa；接口加熱器(Ihe)：開；入口電壓(EP)：10 V；離子源溫度(TEM)：500 ℃。在負離子模式下分析酚類化合物、非甾類激素及部分雌激素，在正離子模式下分析雄激素、腎上腺皮質(zhì)激素及部分雌激素(表2)。

表2 地下水中24種內(nèi)分泌干擾物的質(zhì)譜參數(shù)和保留時間Table 2 MS parameters and retention time of the 24 endocrine disrupting chemicals in the groundwater

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

對比了ACQUITY UPLC BEH與Poroshell 120 Bonus-RP兩種色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)后者對目標(biāo)物的分離度更高，可使雄激素和孕激素等實現(xiàn)較好的分離。為獲得最佳分離度和分析靈敏度，對比了分別以甲醇和乙腈為流動相時的分離情況。結(jié)果表明，以甲醇和乙腈為流動相時，大多數(shù)物質(zhì)均可獲得較好的分離度和峰形，但以乙腈為流動相時，E1和Dieno、ME-Prednl和NDL等出峰時間相近的物質(zhì)的分離度更好，故有機相選用乙腈。當(dāng)流動相選用超純水時，雌激素的響應(yīng)不高。在水相中加入0.1%的氨水后，負離子采集模式下的雌激素的響應(yīng)值提高了2～3倍，同時保證了對孕激素和雄激素等目標(biāo)物的測定。因此，最終選擇0.1%氨水溶液-乙腈作為流動相。在此條件下，24種內(nèi)分泌干擾物的峰形好、信號強、分離效果佳(圖1)。

圖1 24種內(nèi)分泌干擾物的提取離子色譜圖Fig.1 Extraction ion chromatograms of 24 endocrine disruptors chemicals

2.2 前處理條件的優(yōu)化

本文根據(jù)目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)中含有羥基和苯環(huán)的特點，采用了MCX混合型弱陽離子交換柱。這類經(jīng)羧基修飾的混合型弱陽離子吸附劑的苯環(huán)具有較強的疏水作用，羧基則提供了弱陽離子交換能力。對比pH=3和pH=5的水溶液的富集回收效果，結(jié)果(圖2)表明：用pH=5的水溶液進行富集時，大多數(shù)目標(biāo)化合物的富集回收率在50%～90%之間；用pH=3的水溶液進行富集時，富集回收率大多在10%～80%之間。

圖2 不同pH洗脫液的各物質(zhì)回收率Fig.2 The recoveries of eluentswith different pH values

2.3 線性范圍、檢出限及定量限

將質(zhì)量濃度不同的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)和色譜條件進行測定。以類固醇激素定量離子質(zhì)譜峰的面積為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。依據(jù)《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168—2020)開展方法檢出限驗證。線性方程、決定系數(shù)、方法檢出限和線性范圍見表3。從表3可見，在對應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，24種物質(zhì)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)R2均高于0.995，檢出限在0.05～2.00 ng/L之間。在現(xiàn)有文獻報道中，羅洲飛等[24]建立了利用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定環(huán)境水樣中20種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的方法，其方法檢出限為0.04～0.51 ng/L；王曉燕等[17]采用分散液液微萃取-衍生化高效液相色譜-熒光檢測法測定了環(huán)境水樣中的4種酚類內(nèi)分泌干擾物，其方法的檢出限為0.9～1.6 ng/L。本研究所建方法對各內(nèi)分泌干擾物的檢出限與現(xiàn)有文獻報道中的檢出限處于同一量級或優(yōu)于現(xiàn)有水平，且線性范圍寬，檢出物質(zhì)類別較多，定量準(zhǔn)確度高，并通過正負離子切換掃描實現(xiàn)了對不同性質(zhì)環(huán)境激素的同時測定，能更好地滿足地下水中多類內(nèi)分泌干擾物痕量分析的需要，具有較強的實用價值。

表3 24種類固醇激素的線性范圍、線性方程、決定系數(shù)、檢出限Table 3 Linear range,linear equation,determination coefficient and limits of detection of 24 steroid hormones

2.4 方法準(zhǔn)確性

向1.0 L超純水中準(zhǔn)確加入24種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，最終的濃度水平分別為2、5、50、100、500 ng/L，各平行制備3份，做加標(biāo)回收試驗，考察本文所述方法的精密度和回收率。試驗數(shù)據(jù)(表4)顯示，24種目標(biāo)物的平均回收率為68.8%～108%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.99%～9.80%之間，表明該方法的準(zhǔn)確度高，能較好地滿足地下水中痕量類固醇雌激素和雄激素同時分析測定的需要。

表4 加標(biāo)地下水樣中目標(biāo)物的回收率、精密度Table 4 Recovery and precision of the target hormones in spiked water samples %

2.5 實際樣品分析

將本文建立的測定方法運用于河北省8個地級市48個地下水樣品的內(nèi)分泌干擾物分析，結(jié)果顯示，48個樣品均有不同程度的內(nèi)分泌干擾物檢出。其中，E3、EE2、Pro、ADD、NDL在所有樣品中均未檢出，雌激素的檢出濃度在未檢出～17.19 ng/L之間，雄激素的檢出濃度在未檢出～40.42 ng/L之間。目標(biāo)激素中，E2和T的檢出率最高，兩者的檢出率、最大濃度分別為11.43%、17.19 ng/L和14.29%、3.03 ng/L。測定結(jié)果表明，該分析方法在實際地下水樣品的內(nèi)分泌干擾物測定方面具有較強的實用價值。

3 結(jié)論

本研究建立了一種可同時分析地下水中24種內(nèi)分泌干擾物含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。研究結(jié)果顯示,采用100 mm色譜柱進行分離時的效果較好,使用pH=5的水溶液進行富集回收時的效果更好。經(jīng)驗證，本研究所建方法對24種物質(zhì)的平均回收率為68.8%～108%，RSD為0.99%～9.80%，線性相關(guān)系數(shù)均高于0.995，檢出限為0.05～2.00 ng/L。將本文建立的測定方法運用于河北省8個地級市48個地下水樣品的內(nèi)分泌干擾物分析，結(jié)果顯示：在檢出的目標(biāo)物中，E2和T的檢出率最高，兩者的檢出率、最大濃度分別為11.43%、17.19 ng/L和14.29%、3.03 ng/L；E3、EE2、Pro、ADD、NDL在所有樣品中均未檢出。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確度好，可為地下水中痕量內(nèi)分泌干擾物的測定提供一種快速、準(zhǔn)確、可靠的技術(shù)方法，具有較強的實用價值。