張昊，劉振宏，曾寧波，唐康，羅梓楠，劉登望*，李林*

（1.湖南農業(yè)大學農學院，湖南 長沙，410128；2.湖南省花生工程技術研究中心，湖南 長沙，410128；3.國家花生工程技術研究中心長沙分中心，湖南 長沙，410128）

漬澇是影響世界農業(yè)布局與生產水平的最主要自然災害之一，隨著全球氣候異常變化，澇災愈加頻發(fā)，嚴重影響花生產量與品質[1,2]?；ㄉ俏覈饕挠土吓c經濟作物，長江流域是主產區(qū)之一，以春播種植為主，受季風氣候的影響，花生生育前、中期（3-6 月）正值多雨季節(jié)，漬澇災害嚴重影響花生生長發(fā)育，尤其對根系影響甚大。因此，開展?jié)n澇災害防控研究對于確?；ㄉa可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

植物根系是吸收養(yǎng)分、水分的主要器官及物質合成轉運的場所。根系生理及形態(tài)結構是植物生長狀況的重要表征，與產量形成息息相關。漬水對各類旱作物的生長發(fā)育產生不利影響，如大豆根表面積、冠根比降低[3]；油菜、玉米的根生物量、根表面積、根體積、須根數量比對照大幅減少，根系組織壞死，葉片抗氧化酶系統紊亂，丙二醛含量持續(xù)升高[4～7]。水稻、番茄等也受漬澇危害，且種質間存在耐性差異[8,9]。已有研究表明，多雨、過度灌溉或地下水位過高對花生不同基因型在不同生育期產生的影響十分明顯，包括根系生長受抑，根瘤數發(fā)育不良等[10～13]。但是，上述研究僅對漬澇情況下的花生形態(tài)建成、產量因素、光合生理、根系生理、內源激素和保護酶響應等方面進行了探討，而從解剖結構方面解析花生耐漬澇機理的研究尚未見報道。

本文以耐性品種湘花2008 與敏感品種中花4號根系為研究材料，從顯微結構與超微結構等方面深入解析花生的耐漬澇機理，為耐漬澇花生育種及災害農藝管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

經過課題組多年室內鑒定、大田驗證和大量種質聚類分析，篩選得到典型耐澇品種湘花2008和敏感品種中花4 號作為試驗種質[14]，取樣觀測部位為根系或主根。

1.2 試驗設計

采用沙培育苗法。為了讓花生根系充分自由伸展和便于觀測取樣，使用圓柱型PVC 培養(yǎng)桶（直徑20 cm、高度30 cm，圖1A），在桶內放置韌性及強度較好的塑料袋，再在袋中安裝自制的不銹鋼根架結構（圖1B），裝入精選潔凈的細沙，沙層厚度28 cm。每桶播1 粒催芽的種子，播深2 cm，3 次重復，當幼苗葉齡達到4 葉1 心時注水，使沙土面保持淹水深度2 cm（圖1C），持續(xù)時間分別為3、6、9、12 d，以正常澆灌為對照（圖1D）。培養(yǎng)室生態(tài)環(huán)境條件為溫度25℃（晝）/20℃（夜），每天光照14 h，照度240μmol·m-2·s-1。

圖1 自制根架結構與花生漬澇處理Fig.1 Self-made root frame structure and peanut waterlogging treatment

1.3 測定項目及方法

在漬澇處理完成后，每個處理從培養(yǎng)桶選取生長一致的根系用于觀測如下項目：

1.3.1 根系形態(tài)學特征研究 首先將塑料袋連同根架結構從培養(yǎng)桶中輕輕取出，垂直放置，再將塑料袋平展于地面，采用細水流緩慢沖洗根架，洗凈細沙后，將根系從根架取出，擦拭水分，放置在暗色實驗臺面上，選取5 個根系進行數碼照相。依據表1 花生漬澇幼苗期室內沙土水培條件下根系危害度分級標準[14]，描述根色、根味狀況及危害度分級。

表1 漬澇花生根系危害度分級標準Table 1 Grading standard for root damage degree of waterlogged peanut

測量根系生物量鮮重，然后105℃殺青1 h，70℃恒溫烘干48 h 至恒重時，稱取根系干重。各指標的耐漬系數計算如下：

根系鮮重耐漬系數=漬澇處理根系鮮重值/正常灌溉根系鮮重值。

根系干重耐漬系數=漬澇處理根系干重值/正常灌溉根系干重值。

1.3.2 顯微結構觀察 采用石蠟切片法制片[15,16]、光學顯微鏡觀察。具體方法：取3 株根系的主根中段組織，采用FAA 固定1～2 d，按照常規(guī)方法制作石蠟切片，用LEICA 公司RM2135 型號切片機切片，厚度10μm，隨后用蕃紅—固綠染色，中性樹膠封片，采用蔡司公司AXIOIMAGER A1 型號光學顯微鏡觀察。每個根樣制作3 個切片，在每張切片上選取5個橫截面作為樣點進行觀察、拍照。

1.3.3 超微結構觀察 采用樹脂包埋超薄切片法[17]、透射電鏡觀察。具體方法：取3 株根系的主根中段組織，浸入盛有3%戊二醛的青霉素小瓶中，常溫固定1～2 d，經pH 磷酸緩沖液沖洗、乙醇梯度脫水、丙酮脫水、樹脂滲透包埋處理后，在LEICA 公司超薄切片機上制作90 nm 超薄切片，再經醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重染色后，采用日立公司H-7500 型透射電鏡觀察主根中段細胞的超微結構、拍照。

1.4 數據處理與分析

采用EXCEL 進行數據錄入、作圖，用SPSS22.0進行數據分析，采用鄧肯極差法進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 漬澇對不同品種花生根系顏色和氣味影響

當外界條件改變尤其處于逆境脅迫狀態(tài)時，通過改變根系形態(tài)結構來適應環(huán)境是植物的主要應對策略之一。從圖2、表2 可看出，漬澇3 d 后，中花4號根系即開始變黃，產生臭味，而湘花2008根色和氣味無明顯變化；隨著漬澇天數增加，6 d 和9 d 后2個品種根系均受到不同程度的危害，根尖均變黃且有臭味，中花4 號尤為明顯；漬澇12 d 時，中花4 號整根烏黑，臭味異常，危害度達到5 級（最高級），湘花2008 根尖發(fā)黑，而中、上部變黃，整根也有臭味，危害度3 級。由此驗證中花4 號耐漬澇性弱，而湘花2008較強。

圖2 漬澇3～12 d的不同耐性品種根系形態(tài)特征Fig.2 Root morphological characteristics of different waterlogging-tolerant varieties under waterlogging for 3-12 days

表2 漬澇3～12 d的不同耐性品種根系危害度Table 2 Damage degree of root system of two cultivars under waterlogging for 3-12 days

2. 2 漬澇對不同品種根系鮮重影響

由表3 可知，正常水分條件下各品種根系鮮重均隨時間推移而不斷增長，而淹水后兩品種根鮮重變化趨勢存在差異：在淹水3～12 d 的范圍內，中花4號根系鮮重先增后降，湘花2008 先增后降，之后再增長；湘花2008 根系鮮重耐漬系數高于中花4 號，說明湘花2008耐澇性強于中花4號。

表3 漬澇3～12 d不同品種根系鮮重的變化Table 3 Fresh weight of roots in different peanut cultivarsunder waterlogging for 3-12 days

2.3 漬澇對不同品種根系干重影響

如表4 所示，兩品種根系干重與鮮重變化趨勢不同。淹水后2 個品種變化趨勢相近，均表現為先增后降，第6 d 為峰值；淹水3～9 d，湘花2008 根系干重耐漬系數均高于中花4號；淹水12 d，湘花2008根系干重耐漬系數低于中花4號。

表4 漬澇對不同品種花生根系干重的影響Table 4 Effect of waterlogging on dry weight of roots in different peanut cultivars

2.4 漬澇對不同品種根系顯微結構影響

如圖3A、F 所示，2 個品種3 d 的對照組主根中段組織顯微結構均表現正常。淹水3 d時，中花4號（圖3B）主根中段組織無明顯變化，木質部呈射線狀正常分布；湘花2008（圖3G）木質部也正常，并出現微小的通氣組織。淹水6 d 時，中花4 號（圖3C）主根中段木質部開始表現異常，導管呈無規(guī)則分布；湘花2008（圖3H）木質部較正常，大體呈射線狀分布，出現較明顯的通氣組織。淹水9 d 時，中花4 號（圖3D）主根中段木質部表現很不正常，導管呈無規(guī)則分布；湘花2008（圖3I）木質部基本正常，大體呈射線狀分布，通氣組織數量增加、橫截面積加大。淹水12 d 時，中花4 號（圖3E）主根中段木質部表現極不正常，導管呈無規(guī)則分布，細胞壁出現破損；湘花2008（圖3J）基本正常，木質部呈射線狀分布，通氣組織數量比淹水9 d 時增加，橫截面積也擴大，細胞壁無破損現象。

圖3 漬澇3～12 d不同耐性花生品種主根中段的顯微結構Fig.3 Microstructure of middle part of taproot of peanut varieties with different waterlogging tolerance underwaterlogging for 3-12 days

2.5 漬澇對不同品種花生根系超微結構影響

正常澆灌下，中花4 號（圖4A）主根中段細胞質濃厚，且核糖體、線粒體、粗面內質網等細胞器豐富，同樣，湘花2008（圖4F）主根中段細胞質濃厚，細胞核、線粒體、粗面內質網等細胞器均正常。

淹水3 d 后，中花4 號（圖4B）主根中段細胞的細胞核、線粒體仍正常，但粗面內質網減少；而湘花2008（圖4G）主根中段細胞的細胞核、線粒體、粗面內質網等細胞器均正常，無明顯變化。

淹水6 d 后，中花4 號（圖4C）主根中段細胞的細胞核、線粒體正常，但細胞質有溶解現象且細胞核染色質分布不均勻。而湘花2008（圖4H）主根中段細胞的細胞核染色質仍分布均勻，細胞核、線粒體、粗面內質網基本正常。

淹水9 d 后，中花4 號（圖4D）主根中段細胞的細胞質消失，但仍有正常線粒體及少量線粒體發(fā)生膨脹空泡化，嵴變得短而粗。而湘花2008（圖4I）主根中段細胞的細胞核及核雙層膜存在、內質網正常，線粒體基本正常，少量出現膨脹空泡化。

淹水12 d 后，中花4 號（圖4E）主根中段細胞的細胞質出現溶解消失，線粒體大部分發(fā)生膨脹空泡化且嵴消失，細胞壁發(fā)生扭曲。而湘花2008（圖4J）主根中段細胞的細胞核、線粒體正常，少量線粒體膨脹出現空泡化，細胞壁正常。

圖4 漬澇對不同耐性花生品種主根中段細胞超微結構的影響Fig.4 Effects of waterlogging on ultrastructure of middle taproot cells of peanut varieties

3 討論

3.1 根色和氣味對花生漬澇鑒定意義

在淹澇脅迫下，根系受影響是最為直接、最為嚴重的部分，通常表現為根系縮小、顏色變深，還伴有臭味或其他氣味[18,19]。張俊等[20]研究發(fā)現，濕澇脅迫損害花生根系正常形態(tài)，降低根系及葉片生理活力，從而影響了地上部各器官的干物質積累，最終影響了產量與品質。劉登望等[21]發(fā)現，花生在幼苗期發(fā)生漬澇造成根系變黑，水淹處理10 d 后，耐澇性越強的品種，根系顏色越接近正常，耐澇性差的品種根系顏色越深。

在3 d、6 d、9 d、12 d不同時間點，不同種類的花生的根系根色與氣味都有不同程度的惡化，說明隨著時間的延長，根系存在的有害物質增多，對花生根系以及其他部位的生長發(fā)育產生了嚴重影響。在漬澇3 d后，從根色與氣味分析中花4號其根系功能受到傷害，湘花2008 無明顯變化，受影響程度低于中花4 號；隨著漬澇天數的增加，在6 d 和9 d，中花4號受損程度比湘花2008明顯；漬澇12d時，中花4 號內部代謝與養(yǎng)分吸收、水分調節(jié)已紊亂，顏色以及氣味嚴重惡化，而湘花2008 與之相比，所受影響明顯較小。推測耐澇品種湘花2008 根系內部可能將有害物質進行降解并運輸出去，而不耐澇的中花4 號降解能力相對較差，因此，經過較長天數的漬澇，湘花2008 受損程度輕于中花4 號，表現出耐澇性。

3.2 漬澇與花生根系重量關系

根系部分是植物器官中與水、土壤直接接觸的器官，根系的發(fā)育狀況對植株長勢起了決定性作用。根鮮重與花生的耐澇性密切相關，一般來說，在淹水條件下的花生根鮮重越大，其對缺氧環(huán)境的適應性能越強，其抗?jié)承阅茉綇姡喾?，若其根系鮮重減輕，其耐澇性能不強。劉登望等[21]發(fā)現，水淹10 d 后幼苗期花生根鮮重降低20.2%～67.7%，耐澇性越強的品種根鮮重越重，耐澇性差的品種根鮮重越輕。

耐漬系數是淹水后根系重量與正常澆水根系重量的比值，反映根系耐澇漬能力的強弱，數值越大，表示淹水后根系重量相對較大，說明根系較耐澇，數值越小，說明根系不耐澇。淹水3～12 d 根系鮮重耐漬系數均以湘花2008 高于中花4 號，說明湘花2008耐澇性強于中花4號。

根系干重的變化也可以直接反映根系生長狀況，根系干重加大表明根系生長良好，根系干重減弱則表明根系生長衰弱，通常還伴隨著根細、須根少等現象。在花生幼苗期，漬澇處理1～2 d，對其根系干重影響較?。蝗魸n澇處理延長至4～6 d 時影響則非常大。易靜等[22]研究發(fā)現，短期濕澇對整個花生品種生物量的影響，以葉片最嚴重，其他依次是莖稈、莢果，而根系略增重。本研究中，淹水3～9 d，湘花2008 根系干重耐漬系數均高于中花4 號；淹水12 d，湘花2008 根系干重耐漬系數反而低于中花4號，可能是因為此時湘花2008 根系通氣組織較多，空腔化趨勢明顯。

3.3 根系顯微結構與漬澇耐性關系

本試驗研究結果揭示了漬澇處理對不同花生品種根系顯微結構的影響。漬澇脅迫使植物根系缺氧，從而影響植物一些關鍵生理功能和代謝途徑，這種影響也體現在根的顯微結構改變上[23]。根系結構發(fā)生顯著變化，皮層薄壁細胞相互融合形成了通氣組織，有利于氧氣的傳送，從而使根系適應低氧的環(huán)境。通氣組織大多分布于靠近表皮的皮層中，即位于保護組織內側，暢通的通氣組織能將植物地上部獲得的氧氣迅速輸送到根中[24,25]。對玉米進行漬澇處理，與敏感品種相比，耐澇品種根系的通氣組織更多、外皮層變厚[26]。十字花科植物通過通氣組織的形成等來提高耐澇能力[27]。宋學芳等[28]以淹水處理的耐濕、敏感小麥為材料進行研究發(fā)現，耐濕小麥品種在經過水淹144 h 后，次生根上的通氣組織較為發(fā)達且具有完整的結構，而對于漬澇敏感品種，盡管在其根部也產生了較為發(fā)達的通氣組織，但其結構不完整。

本試驗中，從淹水3 d 至12 d，敏感花生品種中花4 號主根中未觀察到明顯的通氣組織，在淹水后期，根結構出現破損，影響了植株對氧氣等的傳輸。與之相比，從淹水3 d開始，耐澇的湘花2008主根中就出現了通氣組織，隨著淹水時間的增加，通氣組織越來越明顯，表現為數量增加、橫截面積加大。因此，湘花2008比中花4號更能適應漬澇環(huán)境。

植物根系木質部的導管主要運輸水分和無機鹽。漬澇環(huán)境降低了澤瀉的根密度和后生木質部的導管直徑[29]。漬澇明顯增加了山芫荽的莖木質部的木質化[30]。張昊等[31]將棉花營養(yǎng)液漂浮育苗新技術與常規(guī)基質育苗（對照）相比較發(fā)現，漂浮苗的主根韌皮部能夠正常生長，而木質部生長則出現弱化現象，與對照相比，導管直徑縮小，導管占中柱的比例也變小。漬澇的風毛菊次生根皮層變薄、直徑小的導管數量變多[32]。曲桂敏等[33]研究發(fā)現，在水澇脅迫下，蘋果根的導管比正常供水時發(fā)達。陳銀華等[34]研究結果表明：水澇脅迫下，辣椒根的木質部增多，導管直徑變大，有助于水分的縱向運輸，將水分盡量散失，從而達到適應水澇環(huán)境、保護自身的目的。

本試驗中，從淹水6 d 至12 d，敏感花生品種中花4 號主根中段木質部表現不正常，導管呈無規(guī)則分布。與之相比，湘花2008主根中段木質部從淹水3 d至12 d始終保持正常，導管大體呈正常射線狀分布。湘花2008的主根木質部及導管的狀況比中花4號更穩(wěn)定，可以保持根系水分運輸。因此，在漬澇脅迫下，湘花2008比中花4號具有更強的適應性。

3.4 根系超微結構與漬澇耐性關系

在水分脅迫環(huán)境下，植物細胞的超微結構將發(fā)生相應的變化，細胞質膜形狀似波浪，會產生質壁分離，同時還會改變線粒體嵴等，如線粒體的嵴變薄且數量減少、缺失，間質減少，基質變透明。對大麥進行漬澇處理，耐澇品種的細胞間隙比敏感品種更多[35]。朱云集等[36]研究表明，生長期的小麥在遭受漬水時，根成熟區(qū)內的細胞、超微結構與對照相比存在差異，其細胞器發(fā)生了不同程度的改變，甚至導致細胞整個結構崩潰。宋學芳等[28]以淹水處理的耐濕、敏感小麥為材料，對次生根皮層細胞超微結構變化進行研究得出，細胞核遭受12 h 淹水時會發(fā)生變形，染色體在24 h 后會形成凝集，核膜會變得比較模糊，細胞壁則會變得更加透明，核膜在經過48 h 后的淹水時會發(fā)生破裂，細胞核將會被解體，細胞壁則會被降解，皮層細胞在遭受淹水后會導致程序化死亡。棉花營養(yǎng)液漂浮育苗1 葉1 心期漂浮幼苗主根尖細胞中出現酚類物質，2葉1心期皮層細胞之間存在明顯的細胞間隙，3葉1心期出現淀粉粒，4 葉1 心期出現含晶細胞，細胞出現明顯的質壁分離現象[31]。

本試驗中，正常澆灌下的2 個品種細胞的細胞質濃厚且核糖體、線粒體、粗面內質網等細胞器豐富。淹水3 d 時，2 個品種均是正常狀態(tài)，可能是因為漬澇處理天數較短，植物本身啟動了自我保護機制，如調控相關漬澇基因，進而引起生理生化改變等，可以在短時間內保護植物較少受水分的毒害作用。然而在淹水6 d 至12 d，中花4 號細胞質、粗面內質網不斷減少，最后消失，線粒體也不斷減少，直至細胞壁扭曲與細胞死亡。與之相比，湘花2008雖然細胞核、線粒體數量也有減少，但結構基本穩(wěn)定，從而維持根和植株基本的生長。

4 結論

漬澇脅迫下，敏感品種中花4 號根系最早受到傷害，根系受影響最大，造成顏色以及氣味的嚴重惡化，根系嚴重受損。而耐性品種湘花2008雖根系中、上部根色變黃，且出現臭味，但較之中花4號，所受影響明顯較小，耐澇性能優(yōu)勢明顯。中花4 號主根未形成明顯的通氣組織，木質部導管呈不規(guī)則分布。湘花2008主根出現了通氣組織，且隨著淹水時間的增加，通氣組織數量增加、橫截面積加大，主根中段木質部基本保持正常，導管大體呈正常射線狀分布。中花4 號細胞器受漬澇脅迫較敏感，加速衰老死亡。湘花2008主根細胞內細胞核、線粒體雖同樣受到影響，但仍能維持細胞活動，保持根系生長狀態(tài)。

該研究首次闡明了花生耐澇品種比敏感品種在根系形態(tài)、顯微結構與超微結構方面的優(yōu)勢，該結論對于指導耐性品種培育、漬澇災害管理具有重要意義。