周春紅，盧子濱

南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院國家中醫(yī)藥管理局科研三級實驗室中藥藥理實驗室，廣州 510515

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類廣泛表達于真核生物中，且高度保守的小分子RNA[1]。circRNA可通過不同方式參與調(diào)控親本基因的表達，或充當(dāng)miRNA和RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)“海綿”調(diào)節(jié)下游靶基因蛋白的表達等，在各種生物學(xué)過程中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[2- 4]。

模式生物斑馬魚作為一種小型水生動物，與人類之間大約有70%的基因是直系同源的[5]。斑馬魚特有的透明胚胎可用于實時監(jiān)測胚胎發(fā)育的過程，展開各種病理生理現(xiàn)象的研究。斑馬魚還具有繁殖周期短、養(yǎng)殖費用相對較低、可用于高通量藥物篩選的獨特優(yōu)勢，在醫(yī)藥研究領(lǐng)域應(yīng)用日益廣泛[6]。因此人們試圖從斑馬魚的組織中鑒定并表征circRNA[7]，發(fā)掘斑馬魚體內(nèi)與人類基因同源的circRNA，以利用斑馬魚自身優(yōu)勢，開展與circRNA相關(guān)的更高效、深入的疾病研究。

circRNA的分類和特征

circRNA的分類circRNA為閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可由前體RNA(pre-mRNA)通過反向剪接形成[8]。根據(jù)circRNA形成過程中pre-mRNA的剪接方式，可將circRNA分為3類：(1)內(nèi)含子circRNA(intronic circRNA，ciRNA)；(2)外顯子circRNA(exonic circRNA，EciRNA)；(3)內(nèi)含子、外顯子共同組成的circRNA(exonic-intronic circRNA，EIciRNA)[9-10]。circRNA形成的機制十分復(fù)雜，目前研究較多的假說有：套索驅(qū)動的循環(huán)化假說、RBP驅(qū)動的環(huán)化假說和配對環(huán)狀內(nèi)含子RNA驅(qū)動的環(huán)化假說等[11-13]。

circRNA的特征(1)與線性RNA不同，circRNA為閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。不具備5’- 3’極性及聚腺苷酸化尾巴，故而不易被RNA核酸外切酶或核糖核酸酶R(RNase R)降解，比線性RNA更為穩(wěn)定[14]。(2)circRNA主要存在于細胞質(zhì)中，且以EciRNA為主，還可能具有miRNA反應(yīng)元件(miRNA response element，MRE)[15]。(3)circRNA在真核細胞中廣泛表達，且種類眾多。(4)EIciRNA主要位于細胞核內(nèi)，參與基因的表達，其內(nèi)含子一般位于兩個外顯子之間[16]。(5)circRNA的分布具有組織特異性[17]。

circRNA的生物學(xué)作用隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，人們在多種生物體內(nèi)均檢測到大量circRNA的存在，并發(fā)現(xiàn)其廣泛參與了多種生理病理過程，具有重要的生物學(xué)作用[18]?，F(xiàn)已明確的circRNA的生物學(xué)功能有：(1)參與調(diào)控親本基因的表達過程。如EIciRNA通常位于細胞核內(nèi)，通過順式作用方式與U1小核糖核蛋白相互作用，進而增強其親本基因的轉(zhuǎn)錄活性[19]。此外，circRNA也可與磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ，RNA PolⅡ)相互作用來調(diào)控基因的表達[20]。不僅如此，主要定位于細胞核內(nèi)的ciRNA，也能參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[21]。(2)與miRNA或RBPs相互作用，發(fā)揮“海綿”作用。circRNA具有MRE，能與miRNA競爭性地與其下游靶基因mRNA上的3’非翻譯區(qū)域(3’-untranslated region，3’UTR)結(jié)合，從而參與調(diào)節(jié)miRNA對下游靶基因轉(zhuǎn)錄后的負調(diào)控過程，抑制靶標基因mRNA的降解。故circRNA又稱為競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)[22]。circRNA還可與RBPs結(jié)合，發(fā)揮RBPs海綿作用，從而參與生命活動的各個過程[23- 24]。后者與維持RNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、RNA的轉(zhuǎn)運及翻譯和選擇性剪接等多種生物學(xué)過程密切相關(guān)，在轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用[25](圖1)。

斑馬魚中的circRNA

斑馬魚中circRNA的鑒定與表征Shen等[26]對斑馬魚中的3868個circRNA進行了鑒定和表征，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)斑馬魚circRNA有一個或兩個作用于同一靶標miRNA的位點，多個circRNA共同作用于同一miRNA，例如circRNA000207、circRNA000348、circRNA000423等29個circRNA均可充當(dāng)dre-miR- 2193海綿，進而通過相互作用形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。此外，斑馬魚29%的circRNA與人類、小鼠和豚鼠都具有同源性，包括一些高度保守的circRNA，如：circRNA000348、circRNA000207和circRNA000423等。另有研究也表明這些circRNA在人類和小鼠中是保守的，它們可能在脊椎動物中也發(fā)揮著相似的功能[27]。與哺乳動物中circRNA的生物發(fā)生機制不同，斑馬魚中只有2.64%外顯子circRNA符合內(nèi)含子對驅(qū)動環(huán)化模型的條件，表明斑馬魚的circRNA可能通過不同的機制環(huán)化形成。在此基礎(chǔ)之上，劉麗麗[28]又進一步對斑馬魚胚胎中的32 949個circRNA的表達特征進行分析，在一定程度上豐富了斑馬魚circRNA數(shù)據(jù)庫。研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚circRNA主要分布于8號、9號、15和19號染色體，且其中69%來源于外顯子，6%來源于內(nèi)含子，其余的則是來源于基因間序列。同時斑馬魚circRNA多數(shù)長度在3200 nt以內(nèi)，且長度越長則數(shù)量越少。通過對成年斑馬魚中的3428個circRNA進行鑒定分析發(fā)現(xiàn)，circRNA分布在斑馬魚所有染色體上，且主要位于3號染色體。對斑馬魚染色體進行歸一化處理后，發(fā)現(xiàn)22號染色體上的circRNA密度最大。斑馬魚中大多數(shù)circRNA均來自蛋白質(zhì)編碼基因位點，僅有3.06%來自長期的非編碼RNA基因位點。在成年斑馬魚體內(nèi)，circRNA分布具有組織特異性，僅有1.31%在血液、心臟、肌肉、腦和鰓中共表達。如circ ttnb1，來源于與編碼肌肉蛋白相關(guān)的ttnb1基因，除在肌肉中高表達外，而在血液、腦和心臟中表達量較低[29]。Liu等[30]發(fā)現(xiàn)多數(shù)前體線性RNA只能產(chǎn)生單個circRNA，少數(shù)可以產(chǎn)生多達4或5種亞型，如circRNAece2b、circRNAcamk2b1和circRNAnbas等。該結(jié)果與先前報道的研究結(jié)果相吻合，即單個基因可以通過剪接產(chǎn)生多種執(zhí)行不同功能的circRNA[31- 32]。此外，Liu等[33]進一步在成年雄性斑馬魚線粒體鑒定得到139個線粒體基因組編碼的circRNA，并將由線粒體基因編碼的circRN稱之為“mecciRNAs”。進一步研究表明mecciRNA和核基因編碼的circRNA有著相似的 AG/GT 連接基序，這對于斑馬魚circRNA的研究具有重要的意義。

圖1 circRNA的分類及生物學(xué)功能

發(fā)育過程中的circRNA斑馬魚中的circRNA能通過影響各種生物學(xué)過程，進而參與到斑馬魚發(fā)育有關(guān)的不同途徑中。Liu等[30]以junction reads≥5、倍數(shù)變化≥2、目標circRNA分子在任意兩個樣品中共表達、P<0.05為篩選標準，對斑馬魚卵受精后4.5 h(4.5 hours post fertilization，4.5 hpf)、8 hpf、24 hpf、48 hpf和72 hpf 5個不同發(fā)育階段斑馬魚胚胎中差異化表達的circRNA進行測序分析，得到1029個差異化表達的circRNA。研究發(fā)現(xiàn)，8 hpf是斑馬魚早期胚胎形成和器官分化最活躍的時期，也是circRNA的最豐富時期。通過GO數(shù)據(jù)庫對斑馬魚發(fā)育不同時期差異化表達的circRNA生物學(xué)功能進行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)大量的功能富集與RNA聚合酶Ⅱ相關(guān)，它們可能是通過參與生物轉(zhuǎn)錄和翻譯過程來調(diào)節(jié)斑馬魚的生長發(fā)育。在斑馬魚發(fā)育4.5～8 hpf過程中，circRNA 4、circRNA19、circRNA20、CX43等表達量上調(diào)，而circRNA 14、circRNA 15、circRNA 17、MEF2C等表達量下調(diào)。功能富集分析發(fā)現(xiàn)差異化表達的circRNA主要與細胞形態(tài)發(fā)生、遷移和分化，碳水化合物衍生物代謝過程以及早期器官發(fā)育相關(guān)途徑。而斑馬魚發(fā)育4.5～24 hpf過程中，circRNA7、circRNA19、circRNA20、GATA4、MEF2C等表達量上調(diào)，而circRNA1、circRNA2、circRNA3、circRNA5、circRNA6、circRNA14等表達量下調(diào)，功能富集主要與碳水化合物的生物合成過程、DNA的代謝過程、血管和神經(jīng)節(jié)細胞軸突的發(fā)育以及RNA聚合酶Ⅱ參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。在48 hpf和72 hpf，circRNA7、circRNA8、circRNA9、circRNA20、VMHC、CX43等表達上調(diào)，circRNA1、circRNA2、circRNA3、circRNA5、circRNA13、circRNA15等表達下調(diào)，功能富集主要與器官的發(fā)育調(diào)控有關(guān)。其中circRNA 20是來源于plastin 3基因，pls3在多個物種間同源，與神經(jīng)和運動系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)，是運動神經(jīng)元保持活性的重要因子[34]。在斑馬魚卵受精后的不同發(fā)育過程中，circRNA 20表達持續(xù)上調(diào)，其可能對斑馬魚胚胎運動系統(tǒng)的發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。

在人、小鼠和斑馬魚等不同動物物種之間高度保守的circRNA也得到了一定的研究[35- 36]。如：CDR1as是一種與小腦變性相關(guān)蛋白1轉(zhuǎn)錄本反義的circRNA[37]，可與神經(jīng)組織中的miRNA- 7結(jié)合。研究表明過表達CDR1as可表現(xiàn)出類似于敲除miRNA- 7的生物學(xué)效應(yīng)，抑制斑馬魚腦部的發(fā)育。且CDR1as與miRNA的結(jié)合能力比其他已知轉(zhuǎn)錄本強10倍，此類小分子可以作為miRNA的拮抗劑，參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)過程[38- 39]，也表明circRNA可能通過復(fù)雜的機制參與器官的形成和發(fā)展(圖2)。

炎癥中的circRNA

由于circRNA的功能與其親本基因功能相似[40]，故可以通過現(xiàn)有的一些數(shù)據(jù)庫如KEGG、GO，對研究中發(fā)現(xiàn)的一些差異化表達的circRNA進行下游的靶標分析和功能富集分析等。此外，歸功于內(nèi)毒素斑馬魚炎癥模型的成功建立與成熟應(yīng)用，炎癥中的斑馬魚circRNA也有研究[41- 42]。劉東依[43]對內(nèi)毒素引起的斑馬魚炎癥模型組、PBS空白對照組和配伍組分干預(yù)組中差異化表達的circRNA進行分析發(fā)現(xiàn)，斑馬魚炎癥模型組和PBS空白對照組之間差異化表達的circRNA有43個，其中dre_circ chr12：4631537- 46375145、dre_circ chr8：53519204- 53520037等18個circRNA表達量上調(diào)，dre_circ chr22：9417319- 9440114、dre_circ chr10：29431529- 29435905等表達量下調(diào)。而斑馬魚炎癥模型組和配伍組分干預(yù)組之間差異化表達的circRNA有27個，其中dre_circ chr24：37741203- 37767103、和dre_circ chr6：8813630- 8832610等17個circRNA表達量上調(diào)，dre_circ chr19：31644209- 31655263、dre_circ chr18：17827911- 17848482等表達量下調(diào)，功能富集分析結(jié)果顯示它們可能參與了細胞凋亡、MAPK等多種信號通路的調(diào)控作用，主要涉及碳水化合物跨膜轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的組裝等眾多生物學(xué)過程進而對內(nèi)毒素引起的斑馬魚炎癥發(fā)生的過程產(chǎn)生影響。由此可見斑馬魚中的circRNA是通過極其復(fù)雜的機制參與到斑馬魚的炎癥發(fā)生發(fā)展過程中，配伍組分可減少內(nèi)毒素引起的斑馬魚炎癥模型中差異化表達的circRNA數(shù)，從多種途徑發(fā)揮抗炎作用(圖2)。

總 結(jié)

circRNA具有多種生物學(xué)功能，與各種疾病的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。目前研究顯示，斑馬魚中的circRNA的數(shù)量十分龐大，但斑馬魚的circRNA研究主要集中在發(fā)育過程當(dāng)中，可能是因為斑馬魚生長速度快、幼體時通體透明方便觀察等因素利于發(fā)育的研究。其次，歸功于斑馬魚炎癥模型的成功建立及炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系的產(chǎn)生，炎癥反應(yīng)中的斑馬魚circRNA也得到了初步的研究[44- 45]。但其他疾病中的斑馬魚circRNA仍未得到研究，其一大原因可能是眾多疾病并未能在斑馬魚身上建立成熟的模型，這可能是未來斑馬魚及其circRNA的一大研究方向。

圖2 斑馬魚中的circRNA