陳麗瓊，關(guān)鑫,2，黃壯霖，曾淑嫻，張文鑫，梁一*

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)研究所臨床免疫學(xué)教研室，廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實驗室，廣東東莞 523808）（2.天津市濱海新區(qū)疾病預(yù)防控制中心，天津 300450）

乳腺癌（Breast cancer，BC）是全球女性高發(fā)且死亡率高的惡性腫瘤之一，早期診斷對降低死亡率意義重大。目前臨床診斷手段主要是乳腺造影、超聲、病理組化等，檢測到的依然是晚期階段。因此，尋找早期更高效的分子標(biāo)志物是臨床診斷及疾病監(jiān)控亟需解決的重要問題[1]。

糖基化是一種重要的蛋白翻譯后修飾，糖基化蛋白水平的檢測被認(rèn)為是一種新型腫瘤標(biāo)志物，可提高單純檢測蛋白水平的臨床診斷效能[2,3]。乳腺癌中被報道存在異常唾液酸化sialylation、巖藻糖修飾fucosylation、O-Glycosylation、末端β-N-acetylglucosamine（GlcNAc）修飾（包括O-GlcNAcylation）[4-8]。多項研究發(fā)現(xiàn)，末端GlcNAc的修飾出現(xiàn)在睪丸細(xì)胞表面[9,10]、人白血病細(xì)胞[11]、結(jié)腸癌相關(guān)抗原[12]、及前列腺癌患者血清中[13]，且這種修飾在多種惡性腫瘤（包括乳腺癌）患者血清中出現(xiàn)，被認(rèn)為是一種腫瘤相關(guān)糖基抗原[8]。然而，由于缺少特異性的抗體，這種糖基結(jié)構(gòu)目前研究甚少。

凝集素可與不同糖基結(jié)構(gòu)有高親和力的作用，被廣泛用于糖生物學(xué)的研究[14,15]。檢測GlcNAc常用的凝集素主要有麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）[16]、加納籽凝集素（Griffonia simplicifolialectin-II，GSL-II）[17]和楊樹菇凝集素（Agrocybe aegeritalectin 2，AAL2）[18]，其中，AAL2被認(rèn)為是結(jié)合末端GlcNAc糖修飾親和力和特異性最高的凝集素[18,19]。因此，本文將檢測健康人（Healthy volunteers, HE）和乳腺癌患者（BC）血漿中三種候選腫瘤標(biāo)志物血漿蛋白酶C1抑制劑（plasma protease C1 inhibitor，C1Inh）、Serpin B4和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白（serotransferrin，TF）的蛋白表達(dá)水平，并用反向凝集素（AAL2）ELISA法檢測三種候選標(biāo)志物的GlcNAc修飾的糖蛋白表達(dá)水平，探討其蛋白表達(dá)和糖蛋白表達(dá)水平的診斷效能差別，為糖蛋白在疾病診斷中的意義及凝集素的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床血漿樣本采集

53例血漿標(biāo)本來自廣東省中山市小欖醫(yī)院乳腺癌患者，所有患者均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診，根據(jù)美國癌癥劃分聯(lián)合委員會（American Joint Commission for Cancer Staging，AJCC）的第七版乳腺癌臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，分為Stage0：TisN0M0；StageⅠ：T1N0M0；StageⅡA：T0N1M0，T1N1M0，T2N0M0；StageⅡB：T2N1M0，T3N0M0；StageⅢA：T0N2M0，T1N2M0，T2N2M0，T3N1-2M0；StageⅢB：T4N0-2M0；StageⅢC：任何TN3M0；StageⅣ：任何T任何NM1。其中Tis是原位癌，T代表原發(fā)性腫瘤，N即為區(qū)域淋巴結(jié)，M表示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。分組為Breast cancer 1（BC1）組：26例Stage I和Stage IIa；BC2組：9例Stage IIb；BC3組：14例Stage IIIa和Stage IIIb；BC4組：4例Stage IV。同期在東莞市第六人民醫(yī)院體檢科收集21例健康女性體檢者血漿為對照。所有參與者均通過書面知情同意并通過廣東醫(yī)科大學(xué)和樣本來源醫(yī)院倫理委員會論證?；颊邩?biāo)本信息列于表1。

表1 乳腺癌患者和健康者臨床統(tǒng)計信息 Table 1 Clinical and demographic characteristics of breast cancer patients and healthy volunteers

標(biāo)本收集真空抗凝管中，4 ℃，400 g，離心10 min，離心后血漿分裝于冷凍管中，保存在-80 ℃低溫冰箱中，每支凍存管內(nèi)的血漿標(biāo)本不得反復(fù)凍融超過3次。

1.2 凝集素的制備

楊樹菇凝集素的制備參考之前的方法[18-20]。楊樹菇干粉通過浸泡、過濾和離心方式收集濾液。在濾液中加入硫酸銨至飽和度為40%，攪拌20 min，離心收集上清。在上清中加入硫酸銨至80%飽和度，沉淀60 min后離心收集沉淀。用PBS重懸沉淀，透析除鹽得到總蛋白。用0.45 μm的濾膜過濾總蛋白，安裝GlcNAc-Sepharose 6B親和層析柱，用TBS（20 mmol/L Tris-Cl，pH 7.4，0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MnCl2）平衡柱子30 min，調(diào)節(jié)流速為1 mL/min。將總蛋白溶液上樣到親和層析柱，TBS溶液洗脫雜蛋白，用200 mmol/L GlcNAc的TBS緩沖液洗脫，收集目的蛋白AAL2，透析真空干燥后于-20 ℃保存。

1.3 免疫印跡

經(jīng)BCA試劑盒定量，取50 μg～100 μg血漿蛋白，使用12%的SDS-PAGE電泳完成蛋白分離，依據(jù)目的蛋白分子量大小以250 mA進(jìn)行轉(zhuǎn)膜60 min，用3% BSA在室溫封閉1 h。將一抗anti-serpin B4、anti-serotransferrin、anti-plasma protease C1 inhibitor（ProteinTech，武漢）用封閉液稀釋（1:1000），4 ℃孵育過夜。用TBST室溫洗滌三次，每次10 min。加入HRP-羊抗兔IgG稀釋液（1:2000），室溫孵育2 h，用TBST洗脫三次，每次10 min。蛋白條帶使用化學(xué)發(fā)光法ECL系統(tǒng)（Thermo）檢測，用凝膠圖象處理系統(tǒng)（imageJ）分析目標(biāo)條帶的相對灰度值。

1.4 反向凝集素ELISA

用4 μg/mL的AAL2（溶于15 mmol/L碳酸鈉緩沖溶液，pH 9.6）包被96孔ELISA板，4 ℃過夜，PBST清洗一次，使用5%脫脂奶粉封閉液4 ℃封閉5 h，洗滌五次。每孔加入100 μL的1:20稀釋的血漿標(biāo)本，室溫孵育1 h，洗滌五次，加入生物素標(biāo)記的目的糖蛋白抗體（1:1500）室溫孵育1 h，洗滌五次，加入HRP-鏈霉親和素（1:1000）孵育1 h，洗滌五次，加入TMB反應(yīng)15～30 min，加入終止液，于酶標(biāo)儀波長450 nm下檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

免疫印跡和反向lectin-ELISA數(shù)據(jù)使用GraghPad Prism軟件的nonparametric unpaired t-test做統(tǒng)計分析，p＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。使用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件（15.0版本）分析ROC曲線下面積，多元方差分析通過邏輯回歸完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳腺癌與健康人群血漿候選腫瘤標(biāo)志物的蛋白水平比較

在之前的研究當(dāng)中，我們通過凝集素富集結(jié)合質(zhì)譜鑒定到53種差異表達(dá)蛋白，從中選擇C1Inh、Serpin B4和TF這三個蛋白，通過免疫印跡和ROC曲線進(jìn)一步驗證其表達(dá)差異。

如圖1a～1d所示，與HE組相比，C1Inh的蛋白表達(dá)水平在BC3、BC4和擴(kuò)散期疾病組（extensive stage disease，ED）顯著降低（圖1a～1d）。與BC1組相比，C1Inh的蛋白表達(dá)水平在BC4組顯著降低（p＜0.05）。與BC2組相比，C1Inh的蛋白表達(dá)水平在BC4組也顯著降低（p＜0.01）（圖1a～1d）。由此可見，C1Inh的蛋白表達(dá)水平在乳腺癌患者中明顯降低，且隨著病情的加重其表達(dá)越低。HE/BC1、HE/局限性疾病組（limited stage disease，LD）、HE/ED分別的ROC線下面積（area under curve，AUC）分別為0.66、0.58和0.80。

Serpin B4也叫鱗狀細(xì)胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen 2，SCCA2），被報道在多種腫瘤（包括宮頸癌、肺癌、肝癌等）中高表達(dá)[21-23]，我們的結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)，與HE組相比，serpin B4的蛋白表達(dá)水平在BC2組顯著升高（p＜0.05）（圖1e～1h），與BC1組相比，serpin B4的蛋白表達(dá)水平在BC2組也顯著升高（p＜0.05）（圖1e～1h），這與在其他腫瘤中的研究是一致的。同時結(jié)果表明serpin B4在HE/BC1、HE/LD、HE/ED組的AUC值分別為0.62、0.64和0.68。TF蛋白是血清和腦脊液中通過轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控鐵含量的糖蛋白，它還是負(fù)向調(diào)節(jié)的急性期蛋白，其蛋白表達(dá)水平在不同病理狀態(tài)下不同[24]，例如，在胃癌[25]、宮頸癌[26]、卵巢癌[27,28]中降低，在胰腺癌中升高[29]。我們的結(jié)果中與HE相比，TF蛋白的表達(dá)水平在BC1、BC2、BC4和LD顯著降低（圖1i～1l），這與大多數(shù)腫瘤中的表達(dá)是一致的。同時，與BC1組相比，TF的蛋白表達(dá)水平在BC4組顯著降低（p＜0.05）（圖1i～1l）。另外，TF蛋白在HE/BC1、HE/LD和HE/ED組的AUC值分別為0.73、0.74和0.81。

2.2 乳腺癌與健康人群血漿候選腫瘤標(biāo)志物的GlcNAc修飾蛋白水平比較

研究表明，反向凝集素ELISA可用于檢測糖基化修飾的蛋白[30-32]。因此為了檢測樣本中GlcNAc修飾的C1Inh、serpinB4和TF的表達(dá)水平，建立了一種基于AAL2的反向凝集素ELISA技術(shù)。用凝集素AAL2包被ELISA板，利用凝集素與相應(yīng)糖基特異性結(jié)合的特點(diǎn)富集樣品中帶有N-乙酰葡萄糖胺的糖蛋白后，再用腫瘤標(biāo)志物對應(yīng)的生物素化的抗體檢測，進(jìn)而評估樣品中糖蛋白水平的差異。如圖2a～2d，與健康對照組相比，GlcNAc修飾的C1Inh的表達(dá)在BC1、BC2、BC3、BC4、LD和ED組顯著升高，且與LD組相比，GlcNAc修飾的C1Inh的表達(dá)在ED組顯著升高，與BC1組相比，GlcNAc修飾的C1Inh的表達(dá)在BC2、BC4組均升高。與健康對照組相比，GlcNAc修飾的serpin B4在BC1、BC3、BC4、LD和ED組均顯著降低，且與LD組相比，GlcNAc修飾的serpin B4的表達(dá)在ED組中顯著降低（圖2e～2h），與BC1組相比，GlcNAc修飾的serpin B4的表達(dá)在BC4組中顯著降低（圖2e～2h）。與健康對照組相比，GlcNAc修飾的TF表達(dá)在BC1、BC2、BC3、BC4、LD和ED組顯著升高。值得注意的是，三個候選腫瘤標(biāo)志物的糖蛋白表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均不一致。大量蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)具有糖基化修飾，研究表明這種糖基化的異常表達(dá)與腫瘤的進(jìn)程有著重要的作用，同時糖基化修飾可以調(diào)節(jié)細(xì)胞過程，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)降解[33,34]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這三種蛋白的GlcNAc修飾水平在健康組和乳腺癌患者中的表達(dá)不同，提示GlcNAc修飾可能通過不同方式影響這三種蛋白的表達(dá)以及功能，進(jìn)而影響其在乳腺癌中發(fā)揮不同的作用，其中的分子機(jī)制仍待進(jìn)一步的探索。

研究表明，異常糖基化修飾的SCCA2會影響免疫檢測反應(yīng)[35]，提示臨床標(biāo)本中存在糖基化serpin B4并且具有臨床檢測價值。像許多急性期蛋白[36]，TF糖基化程度很高[24,37]。唾液酸化的TF在胃癌中高表達(dá)[38]，而巖藻糖化的TF在肝癌中高表達(dá)[39]，但在乳腺癌中低表達(dá)[40]。另外，tetrasialotransferrin（糖基化TF）在胰腺癌中高表達(dá)[24]，而trisialotransferrin在肝癌中低表達(dá)[41]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)GlcNAc修飾的TF在乳腺癌中高表達(dá)，這說明TF上有多種類型糖基修飾，不同疾病模型中不同糖基修飾蛋白表達(dá)水平的檢測值得進(jìn)一步的探討。

ROC曲線用于分析糖基化修飾蛋白在健康人和腫瘤患者之間的診斷價值。在健康組和BC1組，GlcNAc修飾的C1Inh、serpin B4和TF的AUC值分別是0.69、0.76和0.83。在健康組和LD組，GlcNAc修飾的C1Inh、serpin B4和TF的AUC值分別是0.75、0.74和0.84。在健康組和ED組，修飾的C1Inh、serpin B4和TF的AUC值分別是0.82、0.82和0.93（圖2）。從表2中可見，糖基化蛋白表現(xiàn)出比檢測總蛋白水平更好的診斷價值，GlcNAc修飾的TF在對BC1、LD和ED對健康人的診斷中，AUC值最高。

表2 候選蛋白及糖蛋白在乳腺癌中的臨床診斷表現(xiàn) Table 2 Performance of candidate proteins or glycoproteins in distinguishing breast cancer

大約有75種標(biāo)志物被食品藥品管理局Food and Drug Administration（FDA）批準(zhǔn)，但絕大多數(shù)都只是用于輔助疾病的診斷[42]。而越來越多的研究表明，僅基于蛋白水平的生物標(biāo)志物檢測無法提供足夠的特異性和敏感性[43-45]。一個最著名的例子就是core fucosylated alpha-fetoprotein（AFP-L3），比單獨(dú)檢測AFP具有更高的診斷價值[44]，因此被FDA批準(zhǔn)為肝細(xì)胞癌的診斷標(biāo)志物。扁豆凝集素Lens culinarisagglutinin（LCA）常作為富集和檢測AFP-L3的工具[46,47]。末端GlcNAc修飾蛋白在許多腫瘤中出現(xiàn)異常表達(dá)[8]，而AAL2與末端GlcNAc結(jié)合親和力很高，因此，可以用于GlcNAc修飾蛋白的檢測。本研究發(fā)現(xiàn)C1Inh、serpin B4和TF蛋白水平和糖基化水平在乳腺癌患者血漿中的變化不一致，且糖蛋白的臨床診斷價值均高于總蛋白的檢測，這也進(jìn)一步提示我們檢測糖基修飾蛋白在疾病診斷中的重要意義[48]。

2.3 聯(lián)合檢測糖基化修飾蛋白的診斷價值評估

最后，使用ROC曲線評估聯(lián)合檢測糖基化蛋白的診斷價值（圖3和表2）。HE組和BC1組之間，聯(lián)合檢測GlcNAc修飾的TF和GlcNAc修飾的serpin B4的AUC值是0.89，特異性和敏感性分別是85%和94%，比單獨(dú)檢測GlcNAc修飾的TF的特異性和敏感性都高。HE和LD組之間，聯(lián)合檢測GlcNAc修飾的TF和GlcNAc修飾的serpin B4的AUC值是0.89，特異性和敏感性分別是85%和91.7%，比單獨(dú)檢測GlcNAc修飾的TF的特異性高。HE和ED組之間，聯(lián)合檢測GlcNAc修飾的TF和GlcNAc修飾的serpin B4的AUC值是0.94，特異性和敏感性分別是90%和91%，比單獨(dú)檢測GlcNAc修飾的TF的特異性高。

3 結(jié)論

糖基修飾蛋白作為疾病標(biāo)志物引起越來越多的關(guān)注，本文使用楊樹菇凝集素AAL2結(jié)合GlcNAc修飾蛋白，通過反向凝集素ELISA檢測末端GlcNAc修飾的C1Inh、serpin B4和TF，發(fā)現(xiàn)糖基化蛋白的水平與總蛋白表達(dá)水平在乳腺癌患者和健康人群中的變化不一致，且糖基化蛋白的診斷效能更高。其中GlcNAc修飾的TF和serpin B4可作為潛在的候選標(biāo)志物，未來需要在大量標(biāo)本中進(jìn)一步驗證凝集素在檢測GlcNAc修飾蛋白的診斷應(yīng)用。